一种提取拟南芥种子中总rna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种提取拟南芥种子中总RNA的方法。
【背景技术】
[0002] RNA提取是分子生物学研究领域的基础，高产量，高纯度的RNA样品是后续进行基 因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。因此，一套高效的RNA提取方法在分子 生物学研究中显得非常重要。
[0003] 植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织 RNA的提取比其他生物材料更加困难。富含酪类化合物和多糖类物质，或含有大量次生代谢 产物，或内源RNase含量较高是运些植物RNA提取的主要障碍。很多植物组织含有大量的多 酪和多糖类物质，酪类化合物在匀浆时极易被氧化成酿类物质，与RNA不可逆地结合，从而 影响RNA的分离纯化。多糖的许多理化性质与RNA相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，很难 将他们分开。
[0004] 公告号为CN 101638651 B的专利文献公开了一种利用异硫氯酸脈-氯仿抽提、 Tris饱和酪纯化植物RNA的抽提方法。改良了传统的异硫氯酸脈法，采用裂解后氯仿抽提加 酪纯化两步法，分别从红皮梨的叶片和果皮、葡萄的叶片和果肉、果皮组织W及草替果实和 新疆紫草愈伤组织中提取到了高质量的总RNA。该方法的抽提缓冲液中含有异硫氯酸脈、十 二烷基肌氨酸钢、巧樣酸钢、可溶性聚乙締化咯烧酬和0-琉基乙醇，既能高效裂解植物细胞 释放RNA，有效抑制RNA酶的活性，还能防止酪类物质的氧化和排除次生代谢物质的干扰。第 二步用化is饱和酪纯化粗提RNA溶液，能除去与RNA共沉淀的多糖和蛋白质。该方法操作步 骤简单、经济实惠、稳定性好，适用于从富含多糖多酪及次生代谢物质的植物组织中提取高 质量总RNA。
[0005] 拟南芥作为典型的模式植物，从拟南芥中提取纯度高、完成性好的总RNA，有利于 其分子生物学研究的开展。但是拟南芥种子含有大量的脂类、蛋白、多糖多酪等物质，严重 影响了RNA提取的质量和纯度，目前常用的提取方法如Trizol法、苯酪法、异硫氯酸脈酪法、 RNA plant plusW及Reagent Kits很难提取拟南芥种子RNA。
[0006] 公告号为CN 102220312 B的专利文献公开了一种室溫提取花生种子中总RNA的方 法，包括如下步骤：（1)研磨花生未成熟种子，制得花生冻干粉；（2)将花生冻干粉加入 化izol试剂，然后加入β-琉基乙醇和聚乙締化咯烧酬振荡，再加入苯酪/氯仿/异戊醇混合 液混合，静置，20~32°C离屯、，取上清液；（3)加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20~32°C 离屯、，取上清液；（4)加入异丙醇混合，静置，20~32°C离屯、，取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即 得。该方法离屯、步骤在20~32°C完成，且操作时间较原有技术时间短，从而缩短了 RNA被降 解的时间，重复性好，提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点。
[0007] 已有的报导提取含油脂、多糖、多酪的种子RNA的方法（如SIMONABIRTICJLSE KRANNER.，Phytochem. Anal. 2006,17 :144-148)应用到拟南芥种子的RNA提取中，效果均不 理想，且提取步骤多，提取试剂贵；利用Trizol提取的RNA的快速方法化ing and Lewis, Biotechnol.J. ,2010,5:183-186)也不能在拟南芥种子中提取高纯度的RNA，提取质量不 好。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，解决了现有技术中提取步骤 多、提取质量不高的问题。
[0009] -种提取拟南芥种子中总RNA的方法，包括W下步骤：
[0010] (1)在液氮冷却条件下研磨拟南芥种子，得拟南芥种子冻干粉；
[0011] (2)将拟南芥种子冻干粉加入到预热的提取缓冲液中，再加入β-琉基乙醇，满旋混 合，离屯、，吸取上清液，得第一离屯、上清液；
[001^ (3)第一离屯、上清液中加入氯仿和水饱和酪，满旋混匀，18~25°C条件下离屯、，吸 取上清液，得第二离屯、上清液；
[0013] (4)第二离屯、上清液中加入氯化裡，静置，离屯、，得第一离屯、沉淀；
[0014] (5)用DEPC水溶解第一离屯、沉淀，加乙酸钢和异丙醇，静置，离屯、，得第二离屯、沉 淀；
[0015] (6)将第二离屯、沉淀经醇洗，干燥，复溶即得所述拟南芥种子总RNA。
[0016] 所述提取缓冲液的成分为：100ml Tris-肥laOmM抓TA，2%w/v十二烷基硫酸裡， 0.6M NaCl，0.4M巧樣酸Ξ钢。
[0017] 作为优选，步骤(2)中，每百毫克拟南芥种子冻干粉中加入提取缓冲液1~3mL，i3- 琉基乙醇50~15化L。
[001引本发明在提取缓冲液中添加抗氧化剂β-琉基乙醇、金属离子馨合剂抓TA和脚ase 抑制剂十二烷基硫酸裡，高效裂解植物细胞和释放RNA到水相。高钢环境有利于RNA从种子 细胞中释放。
[0019] 本发明研究表明，提取缓冲液加热到一定溫度，有助于种子细胞的破碎和核酸的 释放。作为优选，步骤(2)中，提取缓冲液的预热溫度为40~60°C。更为优选的，提取缓冲液 的预热溫度为60°C。
[0020] 作为优选，步骤(2)中，满旋振荡1~2min。
[0021] 本发明用氯仿-水饱和酪代替传统的苯酪-氯仿-异戊醇的提取方法，避免了异戊 醇运种有毒害试剂，而且不影响RNA的提取效果。
[0022] 氯仿-水饱和酪用于去除蛋白质，作为优选，步骤(3)中，氯仿添加量为1倍体积的 第一离屯、上清液，水饱和酪添加量为1倍体积的第一离屯、上清液。
[0023] 本发明在研究中发现，在进行到步骤(3)时，4°C条件下离屯、，得到的离屯、液的分层 效果与常溫（18-25°C)离屯、相比，分层效果不好，得到的上清液回收效率低，常溫离屯、所得 上清液约是4°C离屯、所得上清液的1.5倍。因此，本发明对该步骤进行了改进，提高离屯、时的 溫度条件，在18~25°C条件下离屯、，得到更大体积的离屯、液。
[0024] 获得的第二离屯、上清液经高浓度氯化裡作用下选择性沉淀RNA，降低多糖污染。作 为优选，步骤(4)中，所述氯化裡的终浓度为2~3M。
[00巧]作为优选，步骤(4)中，-80°C条件下静置15min~化。更为优选的，-80°C条件下静 置化。本发明研究发现，静置1小时得到的RNA产率最高。
[0026] 静置结束，4°C、12000~13000巧m条件下离屯、3~5min，获得RNA粗品。
[0027] 步骤(5)对RNA进一步纯化，RNA粗品重新溶于DEPC水中，用乙酸钢除去多余的多糖 等物质。作为优选，步骤(5)中，所述乙酸钢的终浓度为0.15~0.3M。
[00%]步骤(5)中，添加等体积异丙醇后，室溫静置3~5min，异丙醇再次沉淀RNA。
[0029] 作为优选，步骤(2)和(5)中，离屯、的条件为18~25°C。
[0030] 第二离屯、沉淀经75%乙醇洗涂、室溫干燥后加入RNase free水溶解即得高质量的 RNA。
[0031] 本发明具备的有益效果：（1)本发明对提取缓冲液进行预热，缓冲液中各组分充分 溶解，有助于植物细胞的裂解和RNA释放；（2)本发明一次性加入足量的氯仿-酪，有效去除 蛋白等杂质，减少抽提次数，减少RNA在提取过程中的损失；（3)本发明所述方法的离屯、在室 溫条件下进行，有助于分相，提高RNA产量；（4)本发明方法操作时间短，重复性好，提取的拟 南芥种子的RNA纯度好、质量高，为其他高油、高脂、W及多糖多酪植物组织的提取提供技术 参考。
【附图说明】
[0032] 图1为实施例1提取的野生型拟南芥成熟种子总RNA的电泳图，其中L为RNAmarker; 1-6为6个拟南芥成熟种子样品。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施 例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下 所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
[0034] 实施例中所用实验用品处理及试剂配制说明：
[0035] RNA提取过程中所使用的枪头、离屯、管等塑料器皿应使用0.1%DEPC水浸泡后高压 蒸汽灭菌，烘干。