专利名称：NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及NF-kB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的
构建方法。
背景技术：
HIV-1传播首先需要将病毒从粘膜表面的感染部位转运到二级淋巴组织的T细胞区，进 一步在CD4+T细胞进行病毒复制。病毒的早期传播机制目前还不清晰，但根据不同造血谱 系细胞的体外感染研究提示，皮肤和粘膜表面的不成熟DC可能是HIV-1的第一耙细胞，起 着识别和结合HIV的作用。而DCs表面的树突状细胞特异的胞间黏附分子-3捕获非整合素 (DC-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-GrabbingNonintegrin， DC-SIGN)在识另U、结 合和转运HIV的过程中起着重要的作用。
作为黏附分子受体，DC-SIGN通过结合ICAM-3，促使DC和T细胞相互作用；通过和 ICAM-2相互作用，使DC细胞在内皮进上黏附游走；作为病原微生物的识别受体，DC-SIGN 可以和HIV-gpl20蛋白高亲和力结合，把HIV从粘膜受感染部位运输到引流淋巴结，在那里 感染T淋巴细胞。但是DCs本身却被感染，成为体内HIV病毒聚集和携带的载体，起着浓 縮和转运HIV的作用。然后，通过DC的迁移到达引流淋巴结，促进耙细胞的感染。此外， DC-SIGN还通过in trans机制加速AIDS的进程。这些研究结果表明，DC-SIGN在HIV-1感 染和传播及AIDS病情进展方面具有重要意义。
通过原位染色技术发现，DC-SIGN在体内表达相对局限，主要表达于皮肤和粘膜固有层， 肠道淋巴节和胎盘等处，而在其它部位较少表达。DC-SIGN表达的局限性提示DC-SIGN表 达有特异性，可能在表达调控上受特异机制调节。在真核细胞，基因的表达主要受基因的启 动子和增强子等基因元件调节，但是，目前有关DC—SIGN表达调控机制尚不完全清楚。作 为核转录因子的NF-kB，有着广泛的生物学活性，在机体的主动核和被动免疫调节方面发挥着 核心作用，和信号转导，抗凋亡，肿瘤发生等方面密切相关。NF-kB和DC的关系也十分 密切。很多病原微生物可以识别DCs表面的TLR受体，从而启动NF-kB的表达,导致DCs 分泌细胞因子和化学因子，促使DC细胞的成熟。目前有研究发现，IL-4可诱导DC-SIGN 表达，主要是通过STAT途径来实现的。但是IL-4调节细胞表达的详细机制尚存作争论有 研究认为，IL-4是通过抑制NF-kB的表达来实现IL-4的生物调节功能的，而另外的研究则 认为，IL-4发挥其生物活性是经过STAT6和NF-kB直接的相互作用来实现的，STAT6和NF-kB 在细胞内直接联系，并具有协同效应。
无论何种机制，NF-kB无疑在DC-SIGN启动子的表达调控中起重要作用，研究NF-kB 与DC-SIGN启动子的作用机制很有必要。因此，构建NF-KB位点缺失型DC-SIGN启动子真
核质粒十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供NF-kB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法。 我们通过通过设计用Ecor I酶切位点替代NF-kb位点的DC-SIGN启动子NF-kB位点
上下两端引物，将DC-SIGN启动子报告质粒重的启动子序列分两端扩增，再通过酶切、连
接及PCR扩增等方法重新得到NF-kB位点缺失的DC-SIGN启动子片段，将该片断插入
pGL3-Basic质粒，成功构建了 NF-kB位点缺失型DC-SIGN启动子真核质粒。通过与
pGL3-Basic空质粒，DC-SIGN启动子质粒DSPGB和阳性对照质粒pGL3-Contro1在各种
PMA、 IL-4刺激情况下的活性进行比较，证实了所构建真核质粒NF-kb位点的缺失。
具体方案如下
(1) 参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物， 在5'端和3'端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点ACGCGT和AGATCT，所用的上游引 物为 sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT 丁CTCCCTGTC ， antisense primer:TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG,用PCR法高保真扩增DC-SIGN启动
子片段，并纯化PCR产物，备用；
(2) 对DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶 切产物进行连接，连接产物转化DH-5a感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒 DNA，作双酶切鉴定；
(3) 在NF-KB结合位点处分别设计5，—3，和3' — 5'方向的两条引物PrimerA 、PrimerB， 两条引物与DC-SIGN启动子NF-kB位点上下两端序列匹配，并且用Ecor I酶切位点替代 NF-kB位点。
(4) 根据已经构建好的报告质粒DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic(DSPGB)的序列，在插入的 启动子片段上下游分别设计两条引物PrimerC、 PrimerD，
(5) 分别以PrimerA与PrimerC、 PrimerB与PrimerD配对，对DC-SIGN报告质粒DSPGB 进行PCR扩增，并用EcorI对两个扩增片断进行酶切，酶切产物纯化后连接。
(6) 参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物， 在5，端和3，端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点ACGCGT和AGATCT，对上述连接产 物用PCR法高保真扩增，重新得到DC-SIGN promoter片段，该片段的NF-kB核转录结合位 点被Ecorl酶切位点替换。
(7) 使用Mlu I和Bgl II对上述DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行 双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5a感受态细胞，挑单个白色菌 落扩增，抽提重组质粒DNA，作双酶切鉴定；
图1为pGL3-basic， pGL3-enhancer和内对照质粒pRL-TK的结构图。 图2为NF-Kfi位点缺失的DC-SIGN启动子的合成过程图。
图3为NF-kB突变位点两条引物与DC-SIGN启动子NF-kB位点上下两端序列匹配，并 且用Ecor I酶切位点替代NF-kB位点的示意图。
图4根据已经构建好的报告质粒nC-§IGN-Eromoter-pGL3-Basic(DSPGB)的序列，在插入 的启动子片段上下游设计引物示意图。
图5分别用两组引物对报告质粒DSPGB进行PCR扩增示意图。
图6连接产物进行PCR扩增示意图。 图7为各质粒在PMA、 IL-4作用下的活性比较图。
具体实施例方式
1.构建NF-kB位点缺失的DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic 1.1首先根据找出DC-SIGN启动子区序列，设计NF-kB突变位点引物 1 ATGAGTCCTT CTCCCTGTCAACCCCAGACC ATCCCCCACT GCCTCCCTGA 50
51AATTCTTGAA AGATCCGGCCCATCTCATGC TCTGATGCTTTCCACTAGCC 100
101 TTTTGGATGACAGATCCCTA CCCAACTTCCTGTTTCTCTTTCTGTGGGAG 150
151 ACTAGATTTAGGAAGTAAAG ATCACAGGGT GGGAAATAAA AGCTGTGGCC 200
201 CCCAGGAGTT CTGGACACTG GGGGAGAGTG GGGTGAC 237
其中AGGGTGG为NF-kB结合位点。
设计如下两个引物
PrimerA: 5，- GGAATTCGTG ATCTTTACTT CCTAAA3，(包含Ecorl酶切位点) Primer B: 5-GAATTCCGAA ATAAAAGCTG TGGCCCCCA-3，(包含Ecorl酶切位点)
两条引物与DC-SIGN启动子NF-kB位点上下两端序列匹配，并且用Ecor I酶切位点
替代NF-kB位点。如图3所示。 1.2构建报告质粒DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic(DSPGB) 1.2.1扩增DC-SIGN启动子
取正常人外周血，分离PBMC，使用PCR引物扩增DC-SIGN基因的启动子。所用的上
游引物为sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC(含有Mlu I酶切位点)
antisense primer:TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG(含有Bgl II酶切位点)，使用
Invtrigon的Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, PCR反应体系如下
5X PCR buffer IO^iL
2.5mMdNTPmix 4pL
50mM MgS04 2pL
10mM sense primer 2juL
10mM antisense primer 2(iL
High Fidelity Taq(2U/pL) 0.5^L
DNA(lng/(iL) l^L
_DdH2Q_28.5pL
Total volumes 50|aL
按如下程序在PCR仪器上进行扩增
1. 95。CX3min
2. 94。CX20sec 58。CX30sec
72°CX25sec 共30个循环
3. 72。CX5min
4. 4'C保存 1.2.2 PCR产物纯化
使用过柱离心的方法，操作步骤和方法按着产品说明书进行。 1.2.3构建DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒
pGL3-basic质粒经过大肠杆菌DH-5a扩增后，使用质粒小量抽提试剂盒进行抽提，操 作按说明书进行。然后将所得质粒和在l.l中所得PCR经Bgl II和Mlu双酶切,所用内切酶
为Takara公司所得，体系如下A.B
10 X Buffer H争10 X Buffer H4^1
BglII (10，)1^1BglII (10,1)1^1
Mlu (10U/nl)l^dMlu (10，)ini
PGL3 -Basic/Enhancer(0 1 ug/|al) 1DC-SIGN promoter(50ng/pl)20nl
ddH2024^1ddH20
total volume40|xltotal volume，
将上述体系轻混匀，离心，37。C酶切过夜。酶切产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压 大小根据水平电泳槽两个电极间得距离进行设定，大小为5V/cm，电泳完毕后，进行DNA 凝胶回收。然后将所得纯化得DC-SIGN启动子片段(40ng/pl)和pGL3-Basic质粒切割片 段(80ng/W)用T4连接酶进行连接
10 X T4 ligation Buffer 1.0|_dpGL3-Basic 3.0^1
DC-SIGN promoter l羊 T4 ligase (5U/pl) 1.5^1
ddH20 _3.5^1
Total volume 10|oJ 将上述混合物混匀，离心，在16'C反应3小时。 1.2.4将连接产物导入感受态细胞
将事先用一步法感受态细胞制备溶液制好并且分装在灭菌Ep管中的DH-5ct感受态细胞 lOOpl至于冰上，然后按如下步骤操作
(1) 感受态细胞冰上预冷20min
(2) 向感受态细胞中加入5pl的连接产物，轻轻混匀，冰上放置30分钟
(3) 42。C水浴箱中热休克90sec，立即冰上放置20分钟
(4) 加入800^1无抗性的LB培养基
(5) 在水平恒温摇床中37°C 200rpm摇动1小时
(6) 4000rpm离心5分钟，去掉800^1上清
(7) 将剩余的10(^1液体和沉淀混匀，均匀涂在含有氨苄青霉素(10(Vg/mL)的LB固体培养 平板上
(8) 先将平板在37。C细菌培养箱中正放30min，然后底面向上，细菌面向下，37'C培养过夜。
(9) 挑取单克隆菌落，放于3mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，以300rpm在37'C振荡12-16 小时
(10) 提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定
(11) 将经过鉴定含有正确克隆的菌液放于300mL(含有100吗/mL)的LB进行扩增 (1》使用质粒中量高纯质粒抽提试剂盒抽提DC-promoter-pGL3-Basic
1.2.5抽提DC-promoter誦pGL3-Basic
(1) 平衡液EQ平衡质粒抽提过滤柱
(2) 将300mL菌液8000rpm离心5min，彻底去上清
(3) 加入Lysis Buffer,彻底混匀，室温放置5min
(4) 加入中和液N buffer中和5min， 13000rpm高速离心15min
(5) 小心取上清，加入以被平衡的过滤柱，过滤，收集过滤所得液体
(6) 向收集的过滤液体中加入70%体积的异丙醇，混匀
(7) 13000rpm高速离心15分钟，小心去上清
(8) 70%乙醇洗涤沉淀一次，然后高速离心10min，小心去掉乙醇
(9) 干燥仪中将沉淀风至半千
(10)加入ddH20 400pL融解质粒 1.2.6质粒双酶切坚定同上述 1.3设计DC-SIGN promoter区域两端引物
根据已经构建好的报告质粒DC-SIGN-Eromoter-pQL3-旦asic(DSPGB)的序列，在插入的
启动子片段上下游按图4示意设计引物
primer C: 5-ACAATTTGCC ATTCGCCAT-3 (4713-4731) primer D: 5- ATTCTGTGAT TTGTATTCAG -3(320-301)
1.4重新分配引物，进行序列扩增
按上述设计引物，对引物进行重新配对
组1; primer C: 5-ACAATTTGCC ATTCGCCAT-3
primerA: 5-GGAATTCGTG ATCTTTACTT CCTAAA -3 组2: primer B: 5-GAATTCCGAA ATAAAAGCTG TGGCCCCCA-3 primer D: 5- ATTCTGTGAT TTGTATTCAG -3
分别用两组引物对报告质粒DSPGB进行PCR扩增，扩增示意如图5所示，分别得到
A(大小为720bp)和B(大小为480bp)两条一端含有Ecorl酶切位点的DNA片段。 1.5用EcorI对A、 B两个片段进行酶切
体系如下
10 X buffer 4pL
fragment A/b 2 5 (jL Ecorl(10u^iL) 0.5pL
ddH20_10.5pL
Total volume 40)xL
37'C反应过夜。
酶切后产生EcorI末端，将酶切产物纯化。然后进行去磷酸化反应
10 X buffer 4pL fragment A/b 20joL CIP (10u/nL) l攀
ddH20_J^iL
Total volume 40/xL
37X:反应3h后，再次纯化反应产物。 1.6连接A、 B两个片段
使用T4连接酶对去磷酸化的两个片段连接
10 X T4 ligation Buffer 1 .Opl
Fragment A 4.0^1 Fragment B 4.0|al T4 ligase (5U/jxl) 0.5(xl
ddH20_^_5pl
Total volume 1 Ojal
16'C反应3h ，这样A、 B两个片段将在EcorI酶切位点处连接。 1.7合成NF-kB缺陷的DC-SIGN promoter
使用引物
sense primer:ATC ATA CGC GTA TGA GTC CTT CTC CCT GTC(含有Mlul酶切位点)
对A、 B两个片段的连接产物进行PCR扩增，重新得到DC-SIGN promoter片段，该片 段的NF-kB核转录结合位点被Ecorl酶切位点替换。PCR扩增示如图6所示。然后使用 Mlul和BglII对PCR产物进行酶切，然后将所得DC-SIGN promoter插入载体pGL3-Basic 中。这样得到带有NF-kB结合位点缺失的DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic质粒(DSPGBnf-^-) 2. NF-icB位点缺失型DC-SIGN启动子质粒与其它质粒活性比较
将空载体pGL3-Basic，质粒DSPGB， DSPGBnf-Kb-Z-和阳性对照质粒pGL3-Con加l以及 内对照质粒pRL-TK转染THP-l 。首先分别将pGL3-Basic，质粒DSPGB， DSPGBnf-Kb-A， pGL3-Contro1和pRL-TK混合，pRL-TK的用量为每种质粒的量的1/50，使用Qiangen公司 的Effectene Reagent转染试剂进行转染。步骤如下
(1) 转染前一天，将THP-l细胞接种到96孔板，密度为lX 105/100pl，接种的量为100pl， 培养箱培养过夜
(2) 将0.1吗的DNA稀释到EC buffer中，混匀，再加入0.8piL的Enhencer
(3) 振荡lsec，室温放置5min
(4) 加Effectene Reagent 2.5^L到DNA沉淀中，吹打5次，混匀。
(5) 室温孵育lOmin
(6) 包装的DNA加入细胞培养体系中，每种混合质粒做8个复孔重复。
(7) 转染完成立即入PMA (浓度为10ng/mL)，转染12小时后加入IL-4浓度为1000U/mL)
转染30小时后检测荧光素酶活性，操作方法如下 第一步试剂的准备
1. 将5 X的passive lysis buffer (PLB) 用ddH20稀释到1 X
2. 准备luciferase assay reagent II. (LAR)
将luciferase assay substrate力卩入luciferase assay buffer II
3. 配制Stop & glo reagent
将50 X Stop & glo substrate临用前加入Stop & glo buffer
第二步按下列步骤操作
1. 每个细胞培养孔中加入2(Hd的PLB，室温水平轻轻振荡15min
2. 加入脚l的LAR，吹打2-3次，设定2sec延迟，10sec测定firelfly luciferase.
3.加入100^1的stop & glo reagent,混匀，测定Rena luciferase。
结论
我们成功构建了 NF-kB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒，并通过与pGL3-Basic空 质粒，DC-SIGN启动子质粒DSPGB和阳性对照质粒pGL3-Control在各种PMA、 IL-4刺激 情况下的活性进行比较，证实了所构建真核质粒NF-kb位点的缺失。 序列表
1、 DC-SIGN启动子区序列 1 atgagtcctt ctccctgtcaaccccagacc atcccccact gcctccctga 50
51aattcttgaa agatccggcccatctcatgc tctgatgctttccactagcc 100
101 ttttggatgacagatcccta cccaacttcctgtttctctttctgtgggag 150
151 actagatttaggaagtaaag atcacagggt gggaaataaa agctgtggcc 200
201 cccaggagtt ctggacactg ggggagagtg gggtgac 237
2、 NF-kB突変位点引物
PrimerA: 5，-GGAATTCGTG ATCTTTACTT CCTAAA3，
PrimerB: 5-GAATTCCGAA ATAAAAGCTG TGGCCCCCA-3'
3、 DC-SIGN promoter区域两端引物
primerC: 5-ACAATTTGCC ATTCGCCAT-3 (4713-4731)
primerD: 5-ATTCTGTGAT TTGTATTCAG-3(320-301)
4 、合成NF-kB缺陷的DC-SIGN promoter使用引物
sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC
antisense primer: TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG
权利要求
1、NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征在于下述步骤(1)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点ACGCGT和AGATCT，用PCR法高保真扩增DC-SIGN启动子片段，并纯化PCR产物，备用；(2)对DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，得到报告质粒DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic(DSPGB)，并作双酶切鉴定；(3)在NF-κB结合位点处分别设计5’→3’和3’→5’方向的两条引物PrimerA、PrimerB，两条引物与DC-SIGN启动子NF-κB位点上下两端序列匹配，并且用Ecor I酶切位点替代NF-κB位点；(4)根据已经构建好的报告质粒DSPGB的序列，在插入的启动子片段上下游分别设计两条引物PrimerC、PrimerD；(5)分别以PrimerA与PrimerC、PrimerB与PrimerD配对，对DC-SIGN报告质粒DSPGB进行PCR扩增，并用Ecor I对两个扩增片断进行酶切，酶切产物纯化后连接；(6)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点ACGCGT和AGATCT，对上述连接产物用PCR法高保真扩增，重新得到NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子片段；(7)使用Mlu I和Bgl II对上述DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，作双酶切鉴定。
2、 根据权利要求1所述NF-kb位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征 在于步骤(1)所述DC-SIGN启动子的一对引物序列如下sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC ，含Mlu I识别位点； antisense primer: TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG，含Bgl II识另U位点。
3、 根据权利要求1所述NF-kb位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征在于步骤(3)所述在nf-kb结合位点处两条引物序列如下primerA: 5，-GGAATTCGTG ATCTTTACTT CCTAAA3'，含EcorI酶切位点； primer B: 5-GAATTCCGAAATAAAAGCTGTGGCCCCCA-3 ，，含Ecorl酶切位点。
4、 根据权利要求1所述NF-kb位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征 在于步骤(4)所述插入的启动子片段上下游两条引物序列如下primer C: 5-ACAATTTGCC ATTCGCCAT-3 (4713-4731); primer D: 5-ATTCTGTGAT TTGTATTCAG-3(320-301)。
全文摘要
本发明公开了NF-κB位点缺失型DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法。通过设计用EcorI酶切位点替代NF-κB位点的DC-SIGN启动子NF-κB位点上下两端引物，将DC-SIGN启动子报告质粒重的启动子序列分两端扩增，再通过酶切、连接及PCR扩增等方法重新得到NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子片段，将该片断插入pGL3-Basic质粒，成功构建了NF-κB位点缺失型DC-SIGN启动子真核质粒。通过与pGL3-Basic空质粒，DC-SIGN启动子质粒DSPGB和阳性对照质粒pGL3-Control在各种PMA、IL-4刺激情况下的活性进行比较，证实了所构建真核质粒NF-κB位点的缺失。
文档编号C12N15/79GK101182540SQ20071015650
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月6日 优先权日2007年11月6日
发明者吴南屏, 许利军, 靳昌忠 申请人:浙江大学