专利名称：小鼠醛氧化酶转录水平定量用pcr引物组合及pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种小鼠含钥酶醛氧化酶转录水平进行定量用PCR引物组合，同时还涉及ー种使用该引物的实时荧光定量PCR方法，属于生物检测技木。
背景技术：
醒氧化酶(aldehyde oxidases. Α0Χ)是ー类催化醒类氧化成相应的羧酸并释放出活性氧的蛋白酶，主要存在于肝脏和红血球中。它属于钥-黄素酶(molybdo.flavorenzyme. MFE)家族的亚家族,是新陈代谢不可缺少的酶类。它參与多种生理调节,可以将体内形成的有毒醛氧化为无毒酸，以缓解醛类对机体的毒害作用，也參与细胞内电子传递，在与代谢和繁殖相关的生理活动中起着非常重要的作用。其转录水平的高低反映了机体代谢的状态。以往的对醛氧化酶的研究主要集中在该酶的序列、结构和功能上，其中RalfR.Mendel 在 Biochimica et Biophysica Acta 1763 (2006) 621-635 发表论文 Cell biologyof molybdenum就醒氧化酶的结构和功能等做了综述,而对于醒氧化酶转录水平研究上缺乏有效的工具。而实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量。实时荧光定量PCR可以对极微量的DNA模板进行准确定量，因其精度高，时间短而被广泛的应用。目前国内外还未见对醛氧化酶转录水平定量方法的研究。为了研究小鼠体内醛氧化酶的转录水平，需要建立一种能够精确对醛氧化酶mRNA定量的方法，进而为研究醛氧化酶功能及其影响因素打下基础。
发明内容
本发明的目的提供了一种醛氧化酶转录水平定量用PCR引物组合在转录水平上对醛氧化酶进行定量。同时，本发明的目的还在于提供了一种能够实时突光定量的PCR方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了 ー种小鼠醛氧化酶转录水平定量PCR引物，其核苷酸序列为正向5，-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3，反向5，-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3，。本发明的技术方案还采用了一种醛氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，该方法以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量醛氧化酶转录水平。fj 增ノ予列为actgcgtgggccatcttgtctgtgctgtgattgcagattctgagacacgggcaaagcaagcggcgaagcaagtgaaggtggtctaccaagacttggcgcctctgatcctaacgattgaggaagctatacaacacaagtccttcttcaagtcagaacggaagctggagtgtgggaatgttgacgaagcatttaaaatcgttgatcaaattcttgaaggtgaaatacacataggcggccagga。
所述的实时荧光定量PCR扩增体系为25 μ L体系2XSYBR Mix 12. 5 μ L，10 μ mol/L正向；反向引物各 O. 5 μ L, cDNA模板2 μ L, 9. 35 μ L去离子水,TaqDNAPolymeraseO. 15 μ L，三步法对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。所述的三步法为95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40 个循环。本发明通过分析小鼠醛氧化酶基因序列，设计特异引物，能够快速、精确的对醛氧化酶转录水平定量。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得。引物序列是在充分分析醛氧化酶基因序列的基础上，因此对材料中非目的基因没有扩增信号。通过使用本发明的引物，对小鼠的醛氧化酶转录水平实施定量，方法简单，精确。并且，本发明的引物特异性強，不会受到其他基因的干扰，为研究小鼠醛氧化酶功能以及其他因素对其影响提供了有效工具。实时荧光定量PCR25y L 体系(2XSYBR Mix 12. 5 μ L，10 μ mol/L 正向、反向弓I物各 O. 5 μ L，cDNA 模板 2 μ L，9. 35 μ L 去离子水，TaqDNA Polymerase O. 15 μ L)，三步法 (95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40个循环)对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。扩增结果可以通过与看家基因(如3-磷酸甘油醛脱氢酶基因等)比较，从而确定醛氧化酶的转录水平。计算公式如下醛氧化酶基因转录水平=2_'ctΔ CT = (CT. Target-CT. Actin) Time χ- (CT. Target-CT. Actin) Time 0.注CT. Target为醛氧化酶基因CT值CT. Actin为看家基因CT值Time O为初始时间点数据Time χ为后期时间点数据使用本发明的引物以及方法进行醛氧化酶转录水平定量样品主要为肝脏，但其他组织也可使用。
图I为荧光定量PCR特异性检测AOX目的片段的溶解曲线；图2为荧光定量PCR特异性检测AOX目的片段PCR扩增结果；图I、图2是荧光定量PCR特异性检测；图I中每条曲线代表不同小鼠的肝脏样品，图2中2-7，分别代表不同小鼠的肝脏样品。
具体实施例方式本实施例的小鼠醛氧化酶转录水平定量PCR引物，其核苷酸序列为正向5，-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3，反向5，-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3，。下面是小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法的具体实施例钥对小鼠醛氧化酶转录水平的影响I实验动物I. I. I实验动物的选择二月龄的清洁级ICR小白鼠60只。
I. I. 2实验动物的分组健康的雌性小白鼠40只和雄性小白鼠20只，适应5天后，随机分成4组，每组10只雌性和5只雄性小白鼠，雌雄分开饲养，自由采食，基础日粮相同，饮水中加入不同剂量的钥(以Na2MoO4 ·2Η20形式)，分别是空白对照组、低钥组(IOOmg ·じ1)、中钥组(200mg·じ1)、高钥组(400mg·じ1)，4周后雌雄合笼饲养。产仔后从每组仔鼠中随机雌性小白鼠30只和15只雄性小白鼠按原分组给予不同剂量的钥，8周后，再从每组中随机选取雌性小白鼠10只和5只雄性小白鼠合笼饲养。待其产仔。如此往复，使小鼠繁殖四代。每组取第三第四代二月龄小鼠各5只，眼球采血处死后，取肝脏组织置于样品保护剂中(Sampleprotector, TAKARA公司)用于醒氧化酶转录水平的检测。I. 2实验方法 1.2. I小鼠肝脏的采集小鼠眼球采血处死后，剪开腹腔，分离并摘取肝脏组织置于样品保护剂中(Sampleprotector, TAKARA公司)用于醒氧化酶转录水平的检测。I. 2. 2目的基因的扩增、克隆、鉴定及测序I. 2. 2. 2总RNA的提取，參照说明书，步骤如下匀浆取约50 IOOmg新鲜小鼠肝脏组织，用DEPC处理过液氮预冷的研钵匀浆后，转移入I. 5mL的EP管中，加入ImL TRIPURE试剂，振摇片刻。RNA的分离孵育匀浆样品5min，使核酸充分裂解游离出来，每毫升TRIPURE试剂添加O. 2mL氯仿，盖上瓶盖，用手用力地摇晃EP管15sec，15 30°C下放置2 3min，1200g离心15min(2°C 8°C )分层下层为酚-氯仿，上层为水相，RNA存在于水相中。水相体积应为总体积的60%。RNA的沉淀吸取上层水相到一新I. 5mL的EP管内，留下有机相。用异丙醇沉淀RNA，与最开始加入TRIPURE量的比为2 1，15 30°C放置lOmin，1200g离心IOmin (2°C 8。。)。RNA在离心前是肉眼看不到的，离心后可在管底或侧壁上形成类似凝胶的滴状物。RNA漂洗去上清，用75%的こ醇漂洗RNA沉淀，与最开始加入TRIPURE量的比为I I。震荡混匀样品，2°C 8°C 7500g离心5min。干燥RNA :空气干燥或真空干燥5 IOmin。重溶RNA :将RNA溶解在20 μ I无RNA酶的DEPC水中，吹打几下，置于55 600C lOmin，使其尽量溶解，贮于_70°C冰箱待用。I. 2. 2. 3琼脂糖凝胶电泳称取适量琼脂糖，用无菌TAE缓冲液配成I. 25%左右浓度，微波炉加热融化后，冷却并凝固，在用TAE缓冲液处理过的胶槽中电泳。电压为100V左右，在点样孔加入5μ L RNA样品后进行电泳。当溴酚蓝跑到凝胶长度的2/3时停止电泳，将凝胶移至紫外灯上观察其完整性并拍照。用pharmacia biotech公司的核酸浓度测定仪测定RNA的浓度,初步估计提取RNA的质量，以确定反转录时所需要添加量。I. 2. 2. 4cDNA合成按试剂盒说明操作。在用DEPC处理过的无Rnase的200 μ LPCR管中进行目的基因cDNA的合成。I. 2. 2. 5目的基因引物的设计根据GenBank中收录的AOX和3_磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的基因序列。利用引物设计软件Primer Express〗.O分别进行引物设计。其中GAPDH片段作为内參照。目的基因引物的设计如下(表I)表IPCR 引物
引物名称引物序列
AOX 上游 5，ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG3，AOX 下游 5，TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC3’
GAPDH 上游 5，-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3 ’
GAPDH 下游 _5，-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3，_ I. 2. 3目的基因荧光定量PCR反应体系的确定用RNA提取试剂盒提取RNA后，测定总RNA及逆转录的cDNA的浓度，对目的基因进行最佳PCR反应条件的确定。采用SYBR Green I染料法，在ABI7000荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。根据SYBR Green I Real Time PCR Kit推荐的反应体系，调整为25 μ L体系(2XSYBRMix 12. 5 μ L，10 μ mol/L 上、下游引物各 0.5 μ L，模板 2 μ L，9. 35 μ L 去离子水，Taq DNAPolymerase O. 15μ L),三步法(％で 3min, 95°C 30sec,60°C 30sec, 72°C 31sec,40 个循环)对样品进行扩増。2. 2. 4基因的相对表达差异分析本实验采用2-ACT方法分析基因的相对表达差异。计算公式如下amount of target = 2_Δετ Δ CT = (CT. Target-CT. Actin) Time χ- (CT. Target-CT. Actin) Time 0.2 结果2. I小鼠AOX基因荧光定量PCR反应的溶解曲线由图1、2可见，在AOX基因的扩增过程中荧光定量PCR反应的溶解曲线仅见単独的峰，反应结束后的电泳的结果仅见一条特异条帯。表明扩增的目的片段特异性良好。2. 2钥对小鼠肝脏AOXmRNA水平的影响通过实时荧光定量PCR的方法可知，实验组的AOXmRNA水平普遍高于对照组。结果见表2表2钥对小鼠肝脏AOXmRNA水平的影响
m3] aoxTST"
对照组I a低钥组 0.31±0.22a
中钥组11.77±2.28b
高钥组 42.56±1.56c序列表〈110〉河南科技大学<120>小鼠醛氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法<170>patentin version 3. 3<210>1
<212>DNA〈213〉人工合成〈223〉引物 Fl<400>1ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG22
<210>2<212>DNA〈213〉人工合成〈223〉引物 F2<400>2TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC24<210>3<212>DNA〈213〉人工合成<400>3actgcgtgggccatcttgtctgtgptgt^ttgca^ttct^^cacgggcaaagcaagcggc^agcaagt^aggtggtctacca 88a^cttggcgcctct^,tcctaac^,tt^g^agptatacaacacaagtccttcttcaagtca^acg^agptg^gtgtgg^at 176gtt^c^agcatttaaaatcgtt^tcaaattctt^aggt^aatacacataggcggccag^a24权利要求
1.一种小鼠醛氧化酶转录水平定量PCR引物组合，其特征在于其核苷酸序列为 正向5，-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3， 反向5，-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3，。
2.一种醛氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量醛氧化酶转录水平。
3.根据权利要求2所述的醛氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于fj -曾序列为actgcgtgggccatcttgtctgtgctgtgattgcagattctgagacacgggcaaagcaagcggcgaagcaagtgaaggtggtctaccaagacttggcgcctctgatcctaacgattgaggaagctatacaacacaagtccttcttcaagtcagaacggaagctggagtgtgggaatgttgacgaagcatttaaaatcgttgatcaaattcttgaaggtgaaatacacataggcggccagga。
4.根据权利要求2所述的醛氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于所述的实时荧光定量PCR扩增体系为25 μ L体系2 X SYBR Mix 12. 5 μ L，10 μ mol/L正向；反向引物各 O. 5μ L, cDNA 模板 2μ L，9. 35 μ L 去离子水，TaqDNAPolymerase O. 15 μ L，三步法对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。
5.根据权利要求4所述的醛氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR方法，其特征在于所述的三步法为 95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40 个循环。
全文摘要
本发明涉及一种小鼠醛氧化酶转录水平定量PCR引物组合及PCR方法，PCR引物组合核苷酸序列为正向5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’反向5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’。通过使用本发明的引物，对小鼠的醛氧化酶转录水平实施定量，方法简单，精确。并且，本发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，为研究小鼠醛氧化酶功能以及其他因素对其影响提供了有效工具。
文档编号C12Q1/68GK102690882SQ201210004660
公开日2012年9月26日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者尚泽松, 张才, 朱重伟, 杨自军, 汪纪仓, 王亚垒, 王臣, 王雪莹 申请人:河南科技大学