专利名称：一种生产l-乳酸的方法及其专用芽孢杆菌属菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产L-乳酸的方法及其专用芽孢杆菌属菌株。
背景技术：
乳酸(Lactic acid)又名二羟基丙酸，是世界三大有机酸之一。作为一种传统的多用途精细化学品，乳酸可作为酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长调节剂、生物可降解性材料、药物和农药等，应用于食品、制药、酿造、制革、纺织、环保和农业中。乳酸是一种手性分子，可分为L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。L-乳酸是生产聚L-乳酸的原料。利用L-乳酸聚合产生的聚L-乳酸，以其良好的生物可降解性和优良的使用特性，被公认为是取代传统塑料的理想的生物可降解塑料之一。L-乳酸的光学纯度对于聚L-乳酸的合成至关重要，聚DL-乳酸是以一种无定形态存在而不能得到工业应用。微生物发酵法生产乳酸，生产成本低，产品安全性高，而且能专一性的得到光学纯乳酸，是大规模生产乳酸的主要方法。目前主要应用的发酵菌株为乳酸细菌以及一些真菌。乳酸发酵过程中，由于不断生产产物而使发酵液的酸度逐渐上升，导致菌体生长和产酸都受到严重的抑制，为此要加入碳酸钙等中和剂进行中和。在乳酸的提取和纯化过程中，要加入硫酸对乳酸钙进行酸化，从而生成乳酸和不溶性的硫酸钙。目前，每生产一顿乳酸就会产生一顿的乳酸钙废弃物。碳酸钙作为中和剂的发酵工艺增加了分离提取的困难，而且影响产品质量，并且造成严重的环境问题和经济浪费。在离子交换技术与膜技术基础上发展起来的电渗析法是一种乳酸提取纯化新工艺。该工艺降低了劳动强度，更重要的是避免了碳酸钙的生成，减少了环境污染。在下游的乳酸提取纯化过程中，商业化的双极性电渗析膜可以使水电离出的H+和0H_分别与乳酸根和金属阳离子结合，生成乳酸和碱，碱可被重复利用。但是，这种双极性的膜对二价离子如Ca2+和Mg2+不耐受，因为二价离子会形成不可溶的碱从而破坏电渗析膜结构。为了利用这种环保节能的新技术，乳酸发酵过程中需要用一价离子的碱性物质作为中和剂，而NaOH就是这样一种理想的中和剂。事实上，电渗析技术研究过程中，都是以NaOH与乳酸中和的产物乳酸钠作为研究对象的。但是鉴于Na+对菌株的毒性，目前国内外利用NaOH作为中和剂进行的L-乳酸发酵都未能达到理想的效果。嗜碱微生物是一类最适pH在9.0以上的微生物类群。嗜碱菌除了能适应碱性环境外，对盐环境尤其是一价盐离子环境具有很好的耐受性。这样的生理性质可以降低乳酸发酵过程中的污染机率。更重要的是，对于嗜碱乳酸菌来说，NaOH可以代替CaCOJt为中和剂来维持发酵过程中的pH，从而 避免产生不溶性钙盐。鉴于在乳酸发酵方面的这些优势，嗜碱菌被认为是乳酸发酵方面的优秀潜力菌株。目前，中国专利中没有涉及以嗜碱菌作为L-乳酸发酵菌株的报道。国外只有一篇利用嗜碱菌发酵生产乳酸的报道(Calabia et al., Biotechnol.Lett.,2011,33:1429-1433)，但是该报道中，L-乳酸产量、转化率和光学纯度分别只有65.8克/升，83%和98.8%，达不到工业化要求。申请号为200510119041.3的中国专利公开了一种采用中性菌干酿乳杆菌改组菌株(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)_Lc_F34 发酵生产 L-乳酸的方法，该菌株以葡萄糖和酵母抽提物为发酵基质，摇瓶补料分批发酵生产乳酸，产生177.6克/升的乳酸；以玉米浆和葡萄糖为发酵基质，30升发酵罐分批补料发酵生产乳酸，产生154.6克/升的L-乳酸。L-乳酸的生产成本是制约L-乳酸应用的关键因素之一。因此，寻找能够低成本生产L-乳酸的技术成为研究的热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供芽孢杆菌属菌株(Bacillus Sp.)WL_S20。本发明提供的芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.) WL-S20，其保藏号为CGMCCN0.5634。上述的芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCC N0.5634在制备L-乳酸中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种生产L-乳酸的方法。本发明提供的方法，是发酵芽孢杆菌属菌株(BaciIIus sp.) WL-S20 CGMCCN0.5634，收集发酵产物，即得到L-乳酸。在上述方法中，所述发酵用的发酵培养基按照如下方法制备:将碳源、氮源、MgSO4.7H20、K2HPO4.3H20、CH3COONa、MnSO4.H2O 和水混合，得到发酵培养基；所述碳源在所述发酵培养基中的浓度为60克/升-150克/升，所述氮源在所述发酵培养基中的浓度为10克/升-50克/升，所述MgSO4.7H20在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-0.4克/升，K2HPO4.3H20在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-4克/升，CH3COONa在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-5克/升，MnSO4 -H2O在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-0.06g克/升；所述MgSO4.7H20、所述K2HPO4.3H20、所述CH3C00Na、所述MnSO4.H2O在所述发酵培养基中的浓度均不为O克/升。在上述方法中，所述碳源在所述发酵培养基中的浓度为80克/升-130克/升；所述氮源在所述发酵培养基中的浓度为20克/升；所述碳源具体为葡萄糖(初糖)，所述氮源具体为花生柏。在上述方法中，在所述发酵前还包括将所述发酵培养基进行如下处理的步骤:向所述发酵培养基加入终浓度为0.10克/升-0.30克/升的中性蛋白酶在pH7.0、45°C条件下预处理6小时-10小时。在上述方法中，所述发酵的pH为9.0-10.0，所述调节发酵pH的中和剂为IOM的NaOH水溶液；所述发酵的温度为35°C _45°C，所述发酵的时间为112小时-216小时。在上述方法中，所述发酵的通气条件为前12小时以0.5升/分钟通气，然后停止通气直到发酵结束。在上述方法中，所述发酵采用的搅拌转速为200转/分钟，旋转半径为48mm。在上述方法中， 所述发酵采用补加葡萄糖水溶液的方式保持发酵的体系中葡萄糖浓度不低于20-50克/升；所述葡萄糖水溶液的浓度为800-1000克/升。
上述补加葡萄糖水溶液的补料方式:可采用多次脉冲补料方式，也可采用单次脉冲补料方式。多次脉冲补料方式具体为，初始葡萄糖浓度为60-100克/升，当发酵液中葡萄糖的浓度低于20克/升时，则一次加入800-1000克/升葡萄糖溶液40-60ml，在整个发酵过程中，需要多次补料操作。单次脉冲补料方式具体为，发酵培养基葡萄糖初始浓度为100-150克/升，在发酵过程中，当葡萄糖浓度低于50克/升时，一次性加入800-1000克/升葡萄糖溶液100-130ml，只需一次补料操作。因此上述菌株WL-S20为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)，已于2011年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCN0.5634，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.。本发明的实验证明，本发明提供了一株芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC N0.5634，其可以用来生产L-乳酸，以葡萄糖为底物，在45 °C条件下以98.6% -99.3%的转化率高效发酵生产光学纯度将近100%的L-乳酸，其中L-乳酸浓度最高可达225克/升。另外，本发明利用芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCCN0.5634生产L-乳酸，以花生柏为氮源，降低了发酵成本，以NaOH作为中和剂，可以简化后期处理过程且减少环境污染。
图1为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.) WL-S20 CGMCC N0.5634发酵生产L-乳酸发酵过程曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL_S20的分离、鉴定1、WL-S20 的分离筛选培养基(克/升):葡萄糖10.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,MgSO4.7Η20 0.2，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌20分钟后加入高温灭菌的10%(w/v) Na2CO3 100ml。固体培养基则还需加入0.1-0.2克/升琼脂。从内蒙古鄂尔多斯盐碱湖湖边取得泥样。称取5g泥样于250ml三角瓶中，加入IOOml筛选培养基，充分混匀后用筛选培养基稀释10，000倍涂布于固体筛选培养基，37°C培养3天，将长出的单菌落接种入装有4ml筛选培养基的试管，在37°C条件下静置培养24小时。培养结束时，取发酵液，6，000转/分钟，离心半径为36mm，离心5分钟，取上清液。测定上清液中葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和L-乳酸的光学纯度。得到一株L-乳酸产量较高、L-乳酸光学纯度接近100%、转化率在95%以上的菌株，即WL-S20。检测方法如下:葡萄糖的测定方法为将上述上清液用去离子水稀释100-500倍，采用生物传感分析仪SBA-40E(山东省科学院生物研究所)测定。
L-乳酸浓度的测定方法为，将上述I得到的上清液用去离子水稀释100-500倍，采用生物传感分析仪SBA-40E(山东省科学院生物研究所)测定。
生物传感分析仪SBA-40E是以固定化酶为传感器的分析仪器，L-乳酸与氧气、水在L-乳酸氧化酶的催化下生成丙酮酸和双氧水，葡萄糖与氧气、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和双氧水。反应放出的双氧水与白金一银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖或L-乳酸浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出葡萄糖或L-乳酸浓度。L-乳酸纯度采用Agillent 1100液相色谱分析仪(安捷伦科技有限公司)测定，MCI GEL CRSlOW手性分析柱，二极管阵列检测器，检测波长254nm，流动相5mM CuSO4，流速
0.5ml/分钟，柱温25°C，进样量10μ I。L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为货号为L0625。L-乳酸光学纯度计算方法:L-乳酸光学纯度(％) =L-乳酸浓度(克/升)/[L-乳酸浓度(克/升)+D-乳酸浓度(克/升)]X 100%转化率计算方法:转化率(％ ) = L-乳酸浓度(克/升)/葡萄糖消耗量(克/升)X 100%2、WL_S20的生理生化鉴定将WL-S20菌株在上述I中所述的固体筛选培养基上培养1-2天，观察菌落形态，并用相差显微镜(ZESSI)观察菌体形态。分别以20克/升葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉为碳源，培养基其他成分相同，为I克/升酵母粉、3克/升多聚蛋白胨、I 克 / 升 K2HPO4.3Η20、0.2 克 / 升 MgSO4.7Η20、0.005 克 / 升 MnSO4.H20,5 克/升CH3COONa和50克/升NaCl，以10%体积比的接种量接种于装有IOOml上述培养基的250ml三角瓶中，在45°C条件下静置培养12h。培养结束时，取发酵液，6，000转/分钟，离心半径为36mm，离心5分钟，取上清液，测定L-乳酸的浓度。测定方法与上述I中相同。结果如下:WL_S20菌落形态无规则，边缘不齐，表面干燥。细胞为杆状，产内生芽孢。WL-S20菌株可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖和麦芽糖为碳源产生乳酸，产量分别为18.3克/升、13.7克/升、14.7克/升、8.0克/升、8.7克/升、18.0克/升和9克/升，WL-S20菌株不能利用乳糖和淀粉作为碳源产生乳酸。上述菌株WL-S20初步鉴定为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)，已于2011年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCN0.5634，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.。实施例2、芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCC N0.5634的应用方法一:1、发酵该实施例 中所用的培养基的组成如下:种子培养基(克/升):葡萄糖10.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,MgSO4.7Η20 0.2，NaCl 50，蒸馏水900ml，115°C高温灭菌20分钟后加入高温灭菌的10%(w/V) Na2CO3IOOml。发酵培养基(克/升):葡萄糖80，花生柏(北京康明威培养基技术有限责任公司)20, MgSO4.7H20 0.35，K2HPO4.3H20 2，CH3COONa 1，MnSO4.H2O 0.03。115°C条件下灭菌20分钟。
本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤:I)、活化培养:将保存的芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC N0.5634甘油菌液以体积比为4%接种量接种入装液量为4ml的试管往复式摇床，200转/分钟，温度37°C，培养12小时；2)、种子培养:将步骤I)的液体培养物，在无菌条件下接种于装有IOOml种子培养基的250ml三角瓶中，40°C静置培养8小时，制得种子培养液；3)、发酵培养:瑞士 Infors HT公司Multifors 1.4升发酵罐中加入700ml发酵培养基，以0.15克/升的终浓度加入过滤灭菌的中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，在pH7.0，45°C条件下处理花生柏8h。以10% (体积比)接种量接入上述种子液，发酵过程中，当发酵液葡萄糖浓度低于20克/升时，补加50ml 800克/升的葡萄糖一次，整个过程共补加4次。前12小时通气0.5升/分钟，然后停止通气直到发酵结束，转速为200转/分钟，旋转半径为48mm。利用IOM NaOH维持恒定pH9.0，45°C培养216小时结束发酵。每 隔4小时取一次发酵液，6，000转/分钟，离心半径为36mm，离心5分钟，取上清液。2、检测检测方法与实施例1中所述相同。实验共设3次重复，结果取平均值。结果如图1A所示，上述I最终得到的发酵液中葡萄糖的浓度为O克/升，L-乳酸浓度225克/升，转化率99.3%, L-乳酸光学纯度100% (未检测出D-乳酸)。方法二、1、发酵该实施例中所用的培养基的组成如下:种子培养基同方法一。发酵培养基(克/ 升):葡萄糖 130，花生柏 20，MgSO4.7H20 0.35，K2HPO4.3H202，CH3COONa I, MnSO4.H2O 0.03。115°C条件下灭菌 20 分钟。本发明发酵法生产L-乳酸的方法包括以下步骤:I)活化培养:同方法一；2)种子培养:同方法一；3)发酵培养:瑞士 Infors HT公司Multifors 1.4升发酵罐中加入700ml发酵培养基，以0.15克/升的终浓度加入过滤灭菌的中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，在pH7.0，45°C条件下处理花生柏8h。以10% (体积比)接种量接入上述种子液，发酵过程中，当发酵液葡萄糖浓度低于50克/升时，补加IOOml 800克/升的葡萄糖一次，整个过程只补加I次。前12小时通气0.5升/分钟，然后停止通气直到发酵结束，转速为200转/分钟。利用IOMNaOH维持恒定pH9.0，45°C培养112小时结束发酵。每隔4小时取一次发酵液，6，000转/分钟，离心半径为36mm，离心5分钟，取上清液。2、检测检测方法与实施例1中所述相同。实验共设3次重复，结果取平均值。结果如图1B所示，上述I最终得到的发酵液中葡萄糖的浓度为O克/升，L-乳酸浓度180克/升，转化率98.6%, L-乳酸光学纯度100% (未检测出D-乳酸)。
权利要求
1.芽孢杆菌属菌株(Bacillussp.)WL_S20，其保藏号为CGMCC N0.5634
2.权利要求1所述的芽孢杆菌属菌株(Bacillussp.)WL_S20 CGMCC N.5634在制备L-乳酸中的应用。
3.一种生产L-乳酸的方法，是发酵芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCCN0.5634，收集发酵产物，即得到L-乳酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述发酵用的发酵培养基按照如下方法制备:将碳源、氮源、MgSO4.7Η20、K2HPO4.3Η20、CH3COONa、MnSO4.H2O和水混合，得到发酵培养基； 所述碳源在所述发酵培养基中的浓度为60克/升-150克/升，所述氮源在所述发酵培养基中的浓度为10克/升-50克/升，所述MgSO4.7Η20在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-0.4克/升，K2HPO4.3Η20在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-4克/升，CH3COONa在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-5克/升，MnSO4 -H2O在所述发酵培养基中的浓度为O克/升-0.06g克/升；所述MgSO4.7H20、所述K2HPO4.3H20、所述CH3C00Na、所述MnSO4.H2O在所述发 酵培养基中的浓度均不为O克/升。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于: 所述碳源在所述发酵培养基中的浓度为80克/升-130克/升； 所述氮源在所述发酵培养基中的浓度为20克/升； 所述碳源具体为葡萄糖，所述氮源具体为花生柏。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于: 在所述发酵前还包括将所述发酵培养基进行如下处理的步骤:向所述发酵培养基加入终浓度为0.10克/升-0.30克/升的中性蛋白酶在pH7.0、45°C条件下预处理6小时-10小时。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述发酵的PH为9.0-10.0，所述调节发酵pH的中和剂为IOM的NaOH水溶液； 所述发酵的温度为35°C _45°C，所述发酵的时间为112小时-216小时。
所述发酵的通气条件为前12小时以0.5升/分钟通气，然后停止通气直到发酵结束。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于:所述发酵采用的搅拌转速为200转/分钟，所述发酵的旋转半径为48mm。
9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于: 所述发酵采用补加葡萄糖水溶液的方式保持发酵的体系中葡萄糖浓度不低于20-50克/升； 所述葡萄糖水溶液的浓度为800-1000克/升。
全文摘要
本发明公开了一种生产L-乳酸的方法及其专用芽孢杆菌属菌株。本发明所提供的芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL-S20，其保藏号为CGMCC NO.5634。上述的芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC NO.5634在制备L-乳酸中的应用。本发明的实验证明，本发明提供了一株芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC NO.5634，其可以用来生产L-乳酸，以葡萄糖为底物，在45℃条件下以98.6％-99.3％的转化率高效发酵生产光学纯度将近100％的L-乳酸，其中L-乳酸浓度最高可达225克/升。
文档编号C12P7/56GK103194402SQ201210004678
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者马延和, 孟莹, 薛燕芬, 于波 申请人:中国科学院微生物研究所