专利名称：用于检测小鼠仙台病毒的引物、探针及其方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠仙台病毒的引物、探针及其方法。
背景技术：
自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的 8种鼠源病毒，其中小鼠仙台病毒属于一类，人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物，对人体来说有很大的危险性。仙台病毒(Sendai virus，SEV)属于副粘病毒科，副粘病毒属。1953年首次于日本仙台发现，并分离出了第一株病毒Fushimi株，之后人们对仙台病毒进行了广泛的研究和报道。仙台病毒为单股负链RNA病毒，病毒粒子多是呈圆形，直径130 250nm。病毒内部由直径约18nm的螺旋状对称结构的核蛋白组成，外包有脂蛋白囊膜，其上有放射状排列的纤突，纤突长8 15nm，宽2 4nm。小鼠仙台病毒的自然宿主是啮齿类动物。仙台病毒可凝聚和溶解多种动物的红细胞，如小鼠、豚鼠、人、鸡、大鼠、绵羊、兔的红细胞。小鼠感染本病后可有两种表现型。慢性型多见于幼鼠至42日龄的小鼠，呈亚临床感染，病毒在鼠群中长期存在，并呈地方性流行。急性型病鼠常表现临床症状，即被毛粗乱、 呼吸困难、消瘦等。孕鼠死胎率提高，新生乳鼠死亡率上升。同时小鼠仙台病毒也可感染人类，引起呼吸道系统疾病。为了客观评价小鼠生物制品的质量，确保人民健康必将起到积极的作用，药典制定了鼠源病毒检测的标准。其中规定的鼠源病毒检测方法有细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction Real Time PCR)1 ,
便,且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 5’ _3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。迄今为止，实时荧光定量PCR技术检测小鼠仙台病毒方面还未见有报道，无疑有着很广阔的发展空间。
发明内容
为了解决现有小鼠仙台病毒检测方法的不足，本发明提供了一种实时荧光定量 PCR检测小鼠仙台病毒的引物、探针及其方法，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。本发明的一个目的是提供一对用于检测小鼠仙台病毒的引物。本发明提供的引物，是由具有序列表中的SEQ ID NO 1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO :2的下游引物组成的一对寡核苷酸。序列表中的SEQ ID NO :1由21个碱基组成；序列表中的SEQ ID NO 2由19个碱
基组成。本发明人设计了多对PCR引物，经过长期大量的实验从众多引物对中筛选出了由上述上游引物和下游引物组成的引物对。其扩增片断大小为lOObp。该引物对小鼠仙台病毒具有高度的保守性，且与小鼠基因组不具有显著的同源性，使用该引物进行PCR扩增，可实现准确定性、定量检测。本发明的另一个目的是提供一种用于检测小鼠仙台病毒的探针，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO 3的核苷酸序列，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述探针中荧光报告基团可选自包括但不限于FAM、VIC、J0E、HEX中的任意一种， 优选为FAM ；所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse，优选为TAMRA。所述序列表中的SEQ ID NO 3由25个碱基组成。本发明的再一个目的是提供一种用于检测小鼠仙台病毒的方法，所述方法使用上述提及引物及探针进行实时荧光定量PCR检测。优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括仙台病毒RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。优选地，所述实时荧光定量PCR的退火温度为60°C。优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件为48°C，15min ;95°C，IOmin ;95°C， 15sec，60°C，40sec，共 40 个循环。优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为扩增含序列表中SEQ ID NO 4
4所示的碱基同源序列的PMD18-T载体，得到IOObp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于检测小鼠仙台病毒的标准曲线。本发明的又一个目的是提供一种用于检测小鼠仙台病毒的试剂盒，所述试剂盒含上述提及的引物探针。优选地，所述试剂盒的反应体系还包括仙台病毒RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。优选地，所述RT-PCR扩增试剂为 2 X Taqman PCR Mix,40 X TaqmanRT-Enzyme MIX, 也可直接使用 Taqman RNA-Ct I-Step kit。优选地，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得扩增含序列表中SEQ ID NO :4所示的碱基同源序列的PMD18-T载体，得到IOObp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得RNA即标准品。本发明的还一个目的是提供上述提及的引物或探针在检测鼠源生物制品中仙台病毒残留时的应用。与现有检测方法相比，本发明提供的荧光定量PCR方法检测小鼠仙台病毒具有以下优点1、简单快速现有的药典小鼠仙台病毒检测方法为细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验，从生物学效应角度检测生物制品中小鼠仙台病毒的潜在感染，需时长 (1 4周时间)，而本发明从核酸角度对仙台病毒进行检测，从样品RNA提取开始到获得结果只需要6小时左右，其中本发明荧光定量PCR使用的是一步法反应体系，操作更为简便快速，只需1小时45分钟的时间。并且，本发明对操作实验室环境要求不高，规避了以前抽检产品可能产生的漏洞，可在企业实现批批检测，进一步提高了生物制品质控质量；2、灵敏度高现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠仙台病毒的潜在感染，其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理，残留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小，而本发明从病毒核酸角度进行检测，相对前述药典规定方法而言，提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光定量PCR检测鼠源生物制品中仙台病毒时，可以准确定量，目标RNA在IO2 IO7浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达至Ij 20copies/y 1 (lOOcopies/reaction)；3、重复性、准确性和特异性本发明中的引物和探针根据小鼠SEV基因组序列设计，且与小鼠基因组无同源性，检测特异性强，重复性好；4、准确性更高本发明使用的是RNA标准品，更贴近病毒的天然状态；同时，在进行检测时标准品和样品都是RNA，在提取和扩增体系上具有一致性，弥补了使用DNA标准品无法衡量在RT步骤中的检测效率的缺陷，准确性更高；5、回收率高本发明从提取步骤开始(而不只是荧光定量PCR过程)衡量了整个方法的可行性。行业内通用标准要求检测方法的回收率要达到50%以上，本发明实时荧光定量PCR方法回收率均达到了 80%以上，是一种理想的可替代现有药典规定的检测方法。
1、图1为实时荧光定量PCR定量曲线；2、图2为实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施例方式以下所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。实施例1小鼠仙台病毒专用引物和探针的设计仙台病毒RNA共由15383个核苷酸组成，编码6个病毒结构蛋白和一个非结构蛋白，6 个结构蛋白为 L(Iarge)，P (RNA polymerase), NP (nucleocapsid)， HN(hemagglutinin—neuraminidase)，F(Fusion)禾口 M(membrane)。一个非结构蛋白 C 是病毒特有的蛋白。其基因排列次序为，3’ -Leader-NP-P+C-M-F-HN-L-Leader-5’，在3’端和 5’端各有一段前导序列。通过比对GenBank内不同株系SEV的基因组，选取病毒非结构蛋白中保守的同源序列即SEQ ID NO :4所示核苷酸序列。针对找出的保守的同源序列区域设计实时荧光定量PCR检测专用引物和探针序列，扩增出的目的片段大小为100碱基。其中优选的引物、探针序列为上游引物QSEV-IOObp-F :5，-GAAAGAGATGGCTACATTGTT_3，，即 SEQ ID NO :1 所示核苷酸序列；下游引物QSEV-IOObp-R 5，-AAACACATAACTCGCGTCT-3，，即 SEQ ID NO 2 所示核苷
酸序列；所述探针QSEV-IOObp-P 5，-AGTCTTGGTGTAATCCAGTCTGCTC-3，，即 SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列；所述探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团TAMRA标记。用设计的引物、探针进行同源性比对后发现其只对小鼠仙台病毒具有高度保守型，与小鼠基因组/EST、及其他近缘病毒不同源，其特异性较高。实施例2阳性RNA标准品的制备首先制备含有同源序列SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的pMD18_T载体，以其为载体扩增得IOObp的DNA片段，回收进行体外转录反应，反应结束后消化DNA模板并纯化RNA， 定量后作为阳性RNA标准品。1、体外转录模板的制备合成SEQ ID NO :4所示核苷酸序列，并将其插入pMD18_T载体中制备而成 (由hvitrogen公司合成)，命名为pMD18T_SEV。以pMD18T_SEV为模板，用上游引物 SEV-IOObp-F :5，-TAATACGACTCACTATAGGGCATCTATG-3，和下游引物 SEV-IOObp-R 5，-TTTGCAAACACAATAC-3，进行扩增，扩增出IOObp的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收后，作为体外转录的模板。2、体外转录制备大量RNA在RNase free的EP管中配制反应体系，具体配制比例如下所示
权利要求
1.用于检测小鼠仙台病毒的引物，其特征在于，所述引物是由具有序列表中的SEQID NO 1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO 2的下游引物组成的一对寡核苷酸。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO 3的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’ 端连接有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、J0E、HEX 中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Ecl ipse。
5.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
6.一种用于检测小鼠仙台病毒的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1中所述的引物及权利要求2 5任一所述的探针进行实时荧光定量PCR检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括 RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的退火温度为 60 "C。
9.根据权利要求6 8任一所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应条件为:48°C, 15min ；95°C, IOmin ；95°C，15sec，60°C，40sec，共 40 个循环。
10.根据权利要求6 9任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为扩增含序列表中SEQ ID N0:4所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到IOObp 的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到检测小鼠仙台病毒的标准曲线。
11.一种检测小鼠仙台病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1中所述的引物及权利要求2 5任一所述的探针。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系还包括 RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR扩增试剂为2X Taqman PCR Mix、40XTaqman RT-Enzyme MIX。
14.根据权利要求12或13任一所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得扩增含序列表中SEQ ID NO 4所示的碱基同源序列的pMDIS-T载体，得到 IOObp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA即标准品。
15.权利要求1中所述的引物或权利要求2 5任一所述的探针在检测鼠源生物制品中仙台病毒残留时的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测小鼠仙台病毒的引物、探针及其方法，所述引物是由具有序列表中的SEQ ID NO1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO2的下游引物组成的一对寡核苷酸，与所述引物配合使用的探针具有序列表中的SEQ ID NO3的核苷酸序列。用本发明的方法及试剂盒检测小鼠仙台病毒具有快速简单、灵敏度高、特异性强且回收率高的优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/70GK102337358SQ201110340728
公开日2012年2月1日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者周志文, 李萃, 王刚, 蒋立新, 谭淑萍 申请人:舒泰神(北京)生物制药股份有限公司