专利名称：海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子及其应用。
背景技术：
植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用元件的调控。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能指导酶与模板的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。按其作用方式及功能，可将植物基因工程中常用的启动子分为3类，即组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。棉花是重要的经济作物，棉纤维是主要的纺织原料。随着可耕地面积的减少，环境的恶化，棉花的生产受到很多种生物和非生物因子的影响，尤其是我国枯、黄萎病，给棉花生产造成很大的损失。通过传统的育种方法已经很难满足现代农业需求，所以通过基因工程的方法来改良现有品种将是今后育种的主要方法。目前，通过转基因改良农作物，所使用的启动子大多是组成型启动子。常用的组成型启动子有花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合酶(N0Q启动子和章鱼碱合酶(0CQ启动子。35S启动子是使用最多最频繁的启动子。由于组成型启动子在转基因作物的不同时期和不同部位均能表达，因此，在转基因作物中也存在一系列问题。Kohli等(1999)的研究表明，CaMV 35S 启动子中有19bp左右的回文序列的重组热点。根据这一结论，Cummins等Q000)和张艳华等Q003)列出CaMV 35S启动子的潜在风险(1)如果35S启动子插入到原来整合到植物基因组中的隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒；( 如果该启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成；C3)当转基因植物被动物或人类食用时，CaMV 35S启动子可能会通过基因的水平插到某一致癌基因上游，活化并且导致癌症的发生。魏伟等000 研究还发现，组成型启动子CaMV35S启动抗虫基因表达，可能会降低棉花植株体内杀虫物质浓度，同时还消耗棉株大量的能量，影响其杀虫效果，甚至导致转基因棉花在正常环境下都会出现生长延滞的现象。因此，寻找特异性或诱导型启动子驱动相关基因的表达，可能有利于上述问题的解决。组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，并往往表现出发育调节的特性。组织特异性启动子启动外源基因在转基因植物中的特定组织中表达，不但可以降低植物耗能、减轻对植物形态和生长发育的影响，还可以提高外源基因在特定部位的表达浓度，增强转基因的效果。与组织器官特异性启动子相比，诱导型启动子有着独特的优点可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，让其接受诱导信号，诱导目的基因的表达；也可解除胁迫， 让目的基因的表达停止，可快速诱导基因转录的“开”与“关”。采用诱导型启动子使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达。本发明所克隆的是受体类似蛋白激酶的启动子，类受体蛋白激酶(receptor likeprotein kinase,RLKs)属于蛋白激酶的一个亚家族，位于细胞膜上，作为信号分子的受体， 能够感受外界刺激，参与胞内信号转导过程，在植物生长发育过程中起着重要的作用。受体蛋白激酶参与了植物许多由激素和胞外环境信号引起的生理生化过程，如，自交不亲和、调节胚乳和花粉的发育、花的脱落、油菜素类固醇信号反应、环境胁迫及植物抗病等。在已克隆的抗病基因中水稻的)(a21、拟南芥的PBS1、大麦的RPG1、番茄的PTO都含有受体蛋白激酶保守结构域。然而，关于受体蛋白激酶相关基因从启动子结构、功能及作用机制角度上进行阐述，进展缓慢，目前报道较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克隆一个海岛棉受体类似蛋白激酶基因((ibRLK) 的启动子序列。采用在线软件Neural Network Promoter Prediction预测转录起始位点 (Transcriptional start site, TSS)，采用 PlantCARE、PLACE 等生物信息学分析软件对启动子区中潜在的顺式调控元件进行预测。根据预测结果发现在-l/_644bp中包含启动子的核心元件，在-644bp/-1476bp中包含一个与病菌诱导相关的顺式调控元件W-box， 在-1467bp之后包含一些其他的响应元件。通过设计三对引物，构建含核心元件和不同调控元件区的三个启动子缺失载体，载体为35S-pCAMBIA1301-N0Rs。按照激酶基因的起始密码子ATG的A为+1，则三个载体包含的序列分别为-l/-644bp，-l/-1476，-l/-1890，并分别将其命名为1301-1，1301-2，1301-3。三个重组载体转化拟南芥，转基因后代经过⑶S染色， 定量检测其在各种生物和非生物胁迫后⑶S活性的变化。同时将pCAMBIA1301 (CaMV 35S) 植物表达载体转化到拟南芥中并筛选获得转基因植株，以此作为对启动子表达活性进行分析的阳性对照。本发明公开了一种海岛棉受体类似蛋白激酶基因((ibRLK)启动子，长度为 3183bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。从第1313bp至第3183bp(^ 1890bp)为该启动子功能研究涉及的序列，第3183bp后接受体类似蛋白激酶的起始密码子atg。启动子 1890bp区域的分析如下.-1890 AGGTTGGTCTGGCTCGGGATAAAAATTTGAAATGAGAAACTTGGAAAAATTGTTCTTTTG-1830 TTTTGGTTTATTTTTGTAAGGTTTGTGTGAACTGCCTGACAATACTCACCATGGATTATTGATA-BoxGATA-Box- 1 7 7 0 CTTGCTTCTTAG ^Α ^ TAGCAGTATTT ^Α ^ GACAGACAGACAGACAGGTAGGTAATATA-1710 TATATAGGGTAGTAGTTGTTGTGCCCCATCCGTTTAATTGATGTATTCTGTAATTAAAAA-1650 AAATTGCGAAAGAGGGATCTTGCATTTTCTTTATTATTATTACTATTATTATTGACTAAG-1590 GTTTTTTATTCTAAGACTTTAAGGTCTTCGCAAACAAATTTTTTTCCCTTGCATTCCTTTMYC-consensus AGM0TIFNTMYB2-1530 TAAACTTAAC |catctg| GATTTATTAAATGAGTTAAC iagatccaa丨 AGAAACAAACACAATAMYBIAT-1470 AAGTCCCGATTACACAATAATCAAAAAAGAAAATAAAAGGTCGCCTAAAATA Kaacc^ TARoot-motif
-1410TGCTTTGAAAACCGCTAAAACTGATG Ktatt| TTAGGAGCTTCAAAATTAATCCTAATTAC-1350CCAGCTGATTTGATCCCAAGTAGCCTCCTCTCTTCATCTTTTATCATTTTTATTTCAGTTBox-fflTCA-elementRoot-motif-1290tctggaagaa |ttgaccctctttttt| ctcaaagtatttttaccccttacgtcttaa ^TATTlRoot-motifRoot-motif- 1 2 30 GATTACTAAAGTTA ^tat^ TCATGCCATTT ^TAT^ TAATTAAGGATTTAAAGTTTAGGGTABRE-1170ttaattatctaagcatttaattaactcaaccatacctt |cacgtg| tagttttcatggtgaa-1110TAATACAAGGCTTTTGATGTTGAATGTTAATCAAGATATTTCATTGAAAATTATGACTGA3-AFl Rinding Site-1050aggaagcgg kagagataat^ caactcttaattggtaaattacactaattagtcattaaat-990TATGGGTAAGTTTTCATTTTTGTCACTTACTAAAAAAGTTATAGTTTGATCATTAAATTA
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-90ATAGCATACGTATGCCGTCTATGCCGTGAAAGACTTGGAAGAGAAAGCAGCGATAGTGTT
-30 TGCCCAGAAACTCAATCTATAACACTAAACATG其中，末尾下划线部分为受体类似蛋白激酶基因的起始密码子，以起始密码子ATG 的A为+1。灰色背景序列为预测的基础启动子序列(TATA-box和CAAT-box)。较大的加粗黑体字母A为预测的转录起始位点。方框内的序列为光响应相关的调控元件、生长及调控相关的调控元件和与激素及逆境响应相关的调控元件。本发明从海岛棉海71 中克隆受体类似蛋白激酶基因((ibRLK)的启动子，并验证其功能的技术路线是1.利用已经克隆的受体类似蛋白激酶5'端序列，设计sefa-PCR(SelIf-Formed Adaptor PCR)引物。sefa-PCR由南京农业大学生命科学院微生物系王世明博士设计开发的一种新的 PCR 技术(Wang SM, He J, Cui ZL, et al. Self-Formed Adaptor PCR :a simple and efficient method for chromosome walking. Applied And Environmental Microbiology, 2007，73，5048-5051)。该技术是通过在已知序列的5，端设计巢式引物，扩增上游未知序列的方法。以海岛棉海7124DNA为模板，进行PCR扩增。回收片段，将回收的片段连入PGEM-T easy Vector (Promega)。挑取10个阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序。2.采用在线生物软件Neural Network Promoter Prediction预测转录起始位点 (Transcriptional start site, TSS)，采用 PlantCARE、PLACE 等生物信息学分析软件对启动子区中潜在的顺式调控元件进行预测。3.根据分析结果以及研究目的设计三对引物，构建缺失表达载体， 如果命名激酶基因的起始密码子ATG的A为+1，则三个载体包含的序列分别为-l/-644bp，-1/-1476，_1/_1890，分别将其命名为 1301-1，1301-2，1301-3。所用载体为 35S-pCAMBIA1301-N0Rs。4.用拟南芥泡花的方法将构建好的载体转化拟南芥获得转基因种子。5.将转化获得拟南芥种子铺在含有20mg/L潮霉素的MS培养基上筛选。6.将筛选获得的转基因拟南芥用⑶S染色。7.转基因拟南芥用ABA、PEG、NaCl和黄萎病落叶型菌株VD8等逆境处理(具体处理方法见下面具体实施方式
)，定量测定GUS活性。上述海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子作为靶基因的应用。有益效果本发明海岛棉受体类似蛋白激酶基因((ibRLK)的启动子是从海岛棉海71M中得到的。转基因后代经过GUS染色，发现该启动子主要在根中维管束和叶片中的叶脉中优势表达。用PEG，NaCl，黄萎病菌，ABA处理转基因后代，⑶S基因的表达活性显著提高。该启动子具有组织特异表达的特性，同时具有诱导表达启动子的特性。因此以该启动子作为研究目标，可以探索植物抗逆的机制，同时，利用该启动子转化作物可以使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达，可以降低植物耗能、减轻对植物形态和生长发育的影响，还可以提高外源基因在特定部位的表达水平，增强转基因的作用效果。
图Isefa-PCR结果。M :marker，泳道1为第一轮PCR结果，泳道2为第二轮PCR结果。
图2转基因拟南芥PCR检测。PC 阳性对照，NC 阴性对照，载体1301-3包含最长启动子序列1890bp，1301-2为次长启动子序列构建的载体，1301-1为最短启动子序列构建的载体，1301为空载体。图3转基因拟南芥GUS染色结果。所用转全长启动子的其中一个阳性克隆，1 转基因后代3天苗龄染色结果，2 7天苗龄染色结果，3 15天苗龄染色结果，4 根，5 成熟叶片，6 茎，7 气孔，8 叶片⑶S染色在显微镜下观察结果，9 根⑶S染色在显微镜下观测结果。图4转基因对照拟南芥⑶S染色结果。1和2为非转基因⑶S染色结果，3和4为转空载体阳性对照，5 阳性对照根部染色结果，6 阳性对照叶脉染色结果，7和8为阳性对照在显微镜下观察结果，7 叶片，8 气孔。图5含不同启动子调控元件区域的载体转基因后代中GUS活性测定结果。图6三个缺失表达载体转基因后代用PEG，NaCl，黄萎病菌，ABA处理后，⑶S活性的测定结果。 图7(ihRLK基因上游序列的顺式元件预测。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 第一轮SEFA-PCR 扩增反应体系为
IOxLABufFer II(MgCl2 Plus ) 1.5μ1 dNTPs(each 10 mM)2.5μ1
LADNA 聚合酶(5 U/μ )0.2μ1
SP3(25pM)0.4μ1
Genomic DNA1 μ
ddH209.4μ1
总体积15μ1。反应程序为A -MVImin ；94"C30sec ；37 "C3minRamp to 70°C at 0. 2°C /S。PCR反应A结束后，取出PCR管，加入2. 5 μ 1的SPl后继续进行PCR ；B :94V30sec
70"C5. 5min,94 °C30sec。PCR反应B进行25cycle，然后进行PCR反应C 8cycleC 94°C 30sec50 °C 30sec70 °C 5min。第二轮SEFA-PCR 扩增PCR反应体系为
IOxLABuffer II(MgCl2 Plus ) dNTPs(each 10 mM) LADNA 聚合酶((5 U/μΙ) SP2(25pM )
第一步PCR产物 ddH20
总体积反应程序为
95 "C5min
94 °C40s、
58°C40s J 30 cycles
72 °C3min
72 °CIOmin应用以上描述的实验方法，根据已克隆的受体类似蛋白激酶5'端的非翻译调控序列设计槽式引物SPl，SP2和SP3，设计3'端sefa-PCR引物如下SPl 5' -GCAAACACTATCGCTGCTTTCTC-3‘；SP2 5' -CCTGGTTGAACGGCTTAGTGA-3‘；SP3 5' -TGATCACCTGTCCCTGGNNNNNNNNNGAAAGA-3'。SP3为简并引物，N为简并碱基。以海岛棉海7124DNA为模板，进行PCR扩增。扩增的第一轮和第二轮产物同时电泳，由结果可知第二轮产物稍大于第一轮产物(图1)，因此回收第二轮产物，克隆于PGEM-T fesy载体并进行序列测定。测序结果表明3'端序列与已知的序列完全重叠。随后在测序得到的序列5'端设计引物与基因3'端特异引物配对，以海7124DNA为模板，扩增获得的序列回收，测序，结果包含基因的完整ORF框和SEFA-PCR的方法得到的序列。由此可知， SEFA-PCR的方法得到的序列是受体类似蛋白激酶5'端的非翻译调控序列，共获得基因起始密码子上游3183bp序列。
1.5μ1 2.5μ1 0.2μ1 0.4μ1 0.25μ1 10.25μ1 15μ1。
实施例2:采用在线生物软件Neural Network Promoter Prediction预测转录起始位点 (Transcriptional start site, TSS)，采用 PlantCARE、PLACE 分析测序结果。我们预测到两个转录起始位点，分别是-221处的A和-1664处的A，分析得分分别是 0. 91 和 0. 99。在-247/-251 位置上有一个 TATA-Box (ATATA)，在-257/-261 和-289/-293位置处各有一个CAAT-Box，它们均为高等植物基础启动子所必有的表达调控元件。在-366/-371，和-1127/-1132 位置处有两个 ABRE，在 _752/_756，-1276/-1280，-15 75/-1579位置各有一个W-Box，在-613/-620位置有一个与木质部相关基因启动子区域的顺式元件。同时启动子区域还包括一些与转录因子如MYB，MYC和WRKY等结合的区域，四个 Root-Motif，以及与光响应相关的调控原元件。实施例3:根据分析结果以及研究目的我们选取基因上游1890bp序列，设计三对引物，构建含不同启动子调控元件区域的缺失表达载体，所用载体为35S-pCAMBIA1301-N0Rs。用目标序列代替原始载体中的35S启动子。根据启动子序列设计的引物为FI 5' -CCGGAATTCTTTTAATTAGGGTAGACAG-3'；F2 5' -CCGGAATTCACAATAAAGTCCCGATTAC-3'；F3 5' -CCGGAATTCAGGTTGGTCTGGCTCGGGATA-3'；Rl 5' -GAAGATCTACCATGTTTAGTGTTATAGATTGAG-3'；构建的载体通过PCR扩增、酶切和测序验证，结果表明所构建的载体正确。实施例4:将构建好的载体转入农杆菌菌株GV3101，用农杆菌泡花的方法转化拟南芥，转化后收到的种子在含有20mg/L的潮霉素的MS培养基上筛选。将阳性克隆移栽，取阳性植株的叶片，提取DNA，分别用潮霉素基因引物和启动子序列特异引物扩增(图2)。对检测阳性的植株收种。实施例5:将收获的种子种植在含有20mg/ml的潮霉素的MS培养基上，选择阳性植株用GUS 染色，将小苗放在GUS染色液中37°C过夜。GUS染色液由50mmol Γ1磷酸钠缓冲液(ρΗ 7.0)、5mmol Γ1 K4Fe (CN)6,5mmol Γ1 K3Fe (CN)6UOmmol Γ1 EDTA、0. 1 % TritonX-100 和 1. Omg ml^X-Gluc组成，用0. 45 μ m滤器过滤除菌。染色结果表明⑶S报告基因的表达主要发生在转化植株的微管组织中，且集中在根、叶脉、叶柄和茎的导管组织处，在气孔处有非常微弱的表达。而在叶肉细胞、子叶和根毛等部位没有GUS基因的表达。相对于幼嫩叶片，成熟叶片中GUS基因的表达量有所降低(图 3)。这些结果与组成型强启动子即花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子驱动下的GUS基因表达(图4)明显不同，表明(^bRLK基因启动子是一个组织特异型启动子。实施例6:选择阳性植株种植在灭菌的培养基质中，四周后进行胁迫处理(1)高盐处理将拟南芥幼苗置于含有200mM NaCl MS溶液中，25°C恒温，分别处理0h，4h，》!，Ia1后取样，部分迅速置于液氮速低温后，-70°c保存备用；(2) ABA处理室温25°C条件下用200 μ M ABA溶液喷施拟南芥植株叶片，分别处理0h,2h,4h,6h, 8h后取样，迅速置于液氮速低温后，-70°C保存备用；(3)干旱处理将拟南芥幼苗置于含有20% PEG6000的MS溶液中，25°C恒温，分别处理0h，4h，8h，12h后取样，迅速置于液氮速低温后，-70°C保存备用；(4)对照处理未经任何处理的拟南芥幼苗置于MS溶液中，在相同生长环境条件下，在0h，2h，4h，6h，他，1 相对于其他胁迫处理同时取样，迅速置于液氮速低温后，-700C 保存备用。(5)病菌处理将拟南芥幼苗根部浸入含有IX IO7个/ml的孢子悬浮液，Imin后移栽到灭菌的培养基质中，同时相应接种水作为模拟对照，接种后植株保湿，分别在接种后 Oh,48h，96h，144h取样，迅速置于液氮速低温后，_70°C保存备用。实施例7:⑶S活性的测定7. 1样品准备取0. Ig保存于-70°C的材料于2. Oml离心管中，加入液氮，研成粉末，加600ul酶提取液。13000rpm 4°C离心lOmin，取上清，即为样品提取液，备用。7. 2 试剂配制提取缓冲液[50mmol/L Na3P04 (ρΗ7· 0)，lmmol/L EDTA, 0. 1 % TritonX-100, lOmmol/L]，β -—巯基乙醇，反应缓冲液[⑶S提取缓冲液，lmmol/ L4-methylumbelliferyl glucuronic^ 0-MUG)]、终止缓冲液(0. 2mol/L Na2C03)、考马斯亮蓝染液[IOOmg考马斯亮蓝溶于50ml 95%乙醇中，然后加入100ml磷酸，用H2O定容1L， 过滤后置于4°C保存]。7. 3蛋白浓度的测定采用Bradford法(1976)。利用Promega公司提供的牛血清蛋白(BSA)贮存液(10mg/ml)配制 0 μ g/ml，5 μ g/ml，10 μ g/ml，15 μ g/ml，20 μ g/ml， 30 μ g/ml以及40 μ g/ml梯度液(每430 μ 1溶液中均含有30 μ 1提取缓冲液，以ddH20为溶剂)，每430 μ IBSA梯度液分别加入600 μ 1考马斯亮蓝染液，混勻，并于酶标仪中测定 595nm光吸收值。吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线；取30 μ 1样品提取液，加入400 μ 1 ddH20以及600μ 1考马斯亮蓝染液，混勻，并于酶标仪中测定595nm光吸收值，根据标准曲线计算样品蛋白质含量。7. 4⑶S荧光定量测定取60 μ 1样品提取液，加入60 μ 1反应缓冲液，混勻，于 37°C水浴锅中保温反应；分别在Omin, 5min, lOmin, 15min, 30min和60min各取20 μ 1样品并迅速转移到1. 5ml终止缓冲液中终止反应。利用酶标仪在激发光365nm，发射光455nm 条件下测定样品荧光值。以蒸馏水制备0. lymol/L 4-甲基伞形酮G-MU)作为荧光标准物，测定其荧光值，并以此计算样品中4-MU含量。利用Microsoft Office Excel软件画出不同时间对应样品4-MU含量的函数曲线(线形)，求出每分钟生成的4-MU含量即GUS活性反应初速度，再除以每个样品的蛋白含量，最终得到GUS反应活性单位为pmol 4-MU/mg protein/min。结果表明，缺失载体1301-2⑶S基因表达强度最高，载体1301-3的表达强度次之， 但与1301-2相比，差异较大。载体1301-1的启动子表达强度还不到1301-2的40%，1301-3 的表达活性约为1301-2的60%。三个载体的⑶S活性强度差异都达到显著性水平(图 5)。该启动子受到PEG NaCl，ABA和黄萎病菌等四种胁迫诱导因子处理后，表达活性明显上升。载体1301-1在ABA处理后⑶S蛋白活性开始上升，在处理4h后⑶S蛋白的活性达到高峰，上调2. 5倍。这表明该区段包含响应ABA诱导的区域。该区段同时对PEG，NaCl 和黄萎病菌等诱导因子也有响应，但对黄萎病菌和NaCl的响应较小，GUS活性上调分别为 1. 4倍和1. 7倍。各种胁迫处理载体1301-2后，⑶S活性的分别上调2. 5，2. 5，2. 5和3. 1 倍。1301-3载体与1301-2相比，⑶S活性下降很多，在用PEG，NaCl，ABA和黄萎病菌等诱导因子处理后，⑶S活性的上调倍数分别是3. 1，1. 5,3. 2和2. 9。以上结果表明在-l/_664bp 位置处存在对ABA，PEG, NaCl，黄萎病菌起诱导作用的响应元件，在-664/_1475bp区段包含对病菌诱导起增强效应的反应元件(图6)。
权利要求
1.海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子，长度为318;3bp，核苷酸序列如SEQID NO. 1 所示。
2.权利要求1所述海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子作为靶基因的应用。
全文摘要
本发明公开了海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子及其应用，该启动子长度为3183bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。受体类似蛋白激酶基因编码蛋白产物与植物胁迫反应的信号传导有关，基因的启动子是一个维管束特异的启动子，受生物和非生物诱导表达，可通过基因工程方法利用该启动子增强目标基因在维管束中表达水平，以改良棉花对黄萎病和非生物胁迫的抗性。
文档编号C12N15/113GK102373205SQ201110340220
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者张天真, 张朝军, 赵君, 郭旺珍 申请人:南京农业大学