抑制i型糖尿病ccr5基因表达的干扰序列及其重组载体与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种可以抑制I型糖尿病特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。本发明将构建的重组载体转染小鼠T淋巴细胞，可影响Th1/Th2细胞因子的分泌，在糖尿病前期的胰岛炎中起重要作用，阻止I型糖尿病的进程。本发明为I型糖尿病的治疗提供了新的手段。
【专利说明】抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列及其重组载体与 应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种可以抑制I型糖尿病特异性相关基 因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 在机体的免疫反应和疾病的发生发展过程中，一类免疫调节因子系统-趋化因子 及其受体起着重要的作用。趋化因子通过与细胞表面的受体结合而产生效应，其特异性受 体属于7次跨膜结构域G蛋白偶联受体（GPCRS)目前已发现近20种。趋化因子及其受体 参与广泛的病理、生理过程。
[0003] 趋化因子受体5 (CC-cheokine rec印tor5, CCR5)是CC亚族趋化因子的特异性受 体。CCR5基因位于3p21.3上，长1.9kb，编码352个氨基酸，具有G蛋白偶联受体家族（G - protein coupled receptors，GPCRs)所特有的七个跨膜区（transmembrine domains，TM), 呈α螺旋。自1996年人们克隆该基因并发现CCR5可以作为HIV的共受体（corec印tor) 参与HIV的感染，CCR5就引起人们极大的兴趣并一直是科学研究的热点之一，后来又陆续 发现在一些自身免疫性疾病如类风湿关节炎，多发性硬化、恶性肿瘤等的病程中CCR5可能 起着关键作用。
[0004] I型糖尿病（typeldiabetes mellitus，T1DM)是一种严重威胁人类健康的常见 代谢性疾病，I型糖尿病患者大约占总糖尿病患者的5 % - 10%。目前认为I型糖尿病 是T细胞介导的自身免疫性疾病，具体机制尚不清楚。遗传学的研究发现N0D鼠的致病 基因位于11号染色体上一个叫idd4的区域，而该区域恰恰也是CC亚家族基因所在位 点。有人研究了 Thl细胞和Th2细胞膜表面分子后指出，CCR5可以认为是Thl细胞特异 的表面标志之一 (Loetscher P, Uguccioni M, Bordoli L, et al. CCR5is characteristic of Thllymphocytes. [J]Nature, 1998, 391(6665) :344-345)。而目前公认 Thl 细胞分泌的多种 细胞因子（IL-2、INF-γ )可加重胰岛炎症反应；而Th2细胞分泌的细胞因子（IL-4、IL-6、 IL-10)则是I型糖尿病的保护因素。2000年Cameron等人研究发现，CCR5mRNA在糖尿病 N0D小鼠的脾脏和胰腺中均有表达，且ΜΙΡ-1 α表达明显上升；用IL-4治疗后小鼠 ΜΙΡ-1 α 和CCR5的表达下调。表明CCR5与ΜΙΡ-1 α参与了 I型糖尿病的病理过程。此外有报道 称CCR5-delta32突变的人群的I型糖尿病的发病率降低，或者发病时间推迟，但亦有报 道称 CCR5-delta32 突变与 TIDM 的发病无关。（Maier-Moore J S, Cafias C A, Tob0n G, et al. The CCR5delta32polymorphism(rs333) is not associated with Sjogren's syndrome or TypelDiabetes in Colombians. Clin Immunol. 2013 ; 148 (2) : 206-8.)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列（SiRNA、 ShRNA)，并构建含有I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列的重组载体。本发明的另一目的 是提供该干扰序列和重组载体在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
[0006] 本发明人研究发现：
[0007] -、在糖尿病N0D鼠 T细胞CCR5的阳性率为10. 46%，高于糖尿病前N0D鼠4. 9% (ρ〈0·05)，见图 1。
[0008] 二、RNAi抑制CCR5后Τ细胞分泌的细胞因子向Th2方向偏移，提示CCR5可以直接 调节T细胞细胞因子的分泌和Thl/Th2平衡即GFP+细胞IL - 2、IFN- γ和IL - 4分别为 6. 13±1. 02ng/ml、8. 45±1. 09ng/ml 和 1. 23±0. 25ng/ml，GFP -细胞 IL - 2、IFN - γ 和 IL - 4 分别为 10. 95±L 24ng/ml、0. 40±0· 08ng/ml 和 14. 38±0· 87ng/ml(n = 4，ρ〈0· 05) 即抑制CCR5使得Τ细胞分泌IL 一 2、IFN - γ减少而IL 一 4分泌增加，见图8。
[0009] 三、RNAi抑制CCR5后T细胞的细胞周期无明显变化，见图7。
[0010] 四、通过NOD. scid鼠过继实验，实验表明RNAi抑制CCR5后的T细胞在过继 5周后血糖值为7. 2±1.2mmol/l，明显低于对照组10. 7±1.8mmol/l(p〈0. 05)和空载 体组11.2±2. lmmol/l(p〈0. 05) ;10周后血糖值为12. 3±2. 9mmol/l，明显低于对照组 18.8±3.4mmol/l(p〈(X05)和空载体组 19.7±3.1mmol/l，（p〈0.05)。RNAi 抑制 CCR5 后 的T细胞在过继1周后，胰岛炎评分为0.31 ±0.46 (η = 90, p〈0. 01)，显著低于对照组 1. 56±0. 15,和空载体组1. 428±0. 04,表明CCR5RNAi后抑制T细胞早期趋化至胰岛，说明 其在糖尿病前期的胰岛炎中起重要作用，见图9、表1。
[0011] 本发明人的研究发现表明，CCR5可能主要通过影响Thl/Th2细胞因子的分泌和参 与早期的胰岛炎而影响I型糖尿病的进程，CCR5可能作为I型糖尿病潜在的治疗靶点。
[0012] 基于以上研究，本发明人设想在I型糖尿病早期应用针对CCR5的ShRNA(慢病毒 载体或腺相关病毒构建的CCR5-ShRNA以及直接合成的CCR5RNAi片段），下调CCR5的表达， 从而达到减缓I型糖尿病进程的目的。
[0013] 本发明的第一方面，是提供一种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列 (SiRNA、ShRNA)。
[0014] 本发明设计针对hCCR5 (GenBank Accession No. U57840)为靶点设计RNAi，靶序列 分别为
[0015] 1. GAGCGTGACTGATATCTAC(186-204)(SEQ ID NO:1)
[0016] 2. AGCTTCATAAGGCGCATGC(390-408)(SEQ ID NO :2)
[0017] 针对上述靶点，本发明设计、合成并筛选SiRNA，选择LOOP连接成短发夹ShRNA。
[0018] CCR5 - shRNA- 1
[0019] 5 ' -GATCCGAGCGTGACTGATATCTACTTCAAGACGGTAGATATCAGTCACGCTCTTTTTTGTCGACA-3'（SEQ ID NO :3)
[0020] 3'-GCTCGCACTGACTATAGATGAAGTTCTGCCATCTATAGTCAGTGCGAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5'（SEQ ID NO :4)
[0021] 转录合成的ShRNA:
[0022]
【权利要求】
1. 一种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列，其RNA序列如SEQ ID NO: 3或4所 /_J、1 ο
2. -种含有如权利要求1所述的抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列的重组载 体。
3. 根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，该重组载体采用GFP标记的U6启动 子的质粒载体pGenesil - 1。
4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，构建方法如下： A、 合成 CCR5-shRNA-l 片段： 选择合适的酶切位点BamH I和EcoR I，根据祀序列序列，设计其shRNA序列如下， 正义链如SEQ ID NO:3所示； 反义链如SEQ ID NO:4所示； B、 构建到真核表达载体pGenesil - IsiRNA，获得pGenesil - l_CCR5_shRNAl重组表 达载体。
5. -种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列在制备治疗I型糖尿病药物中的应 用。
6. -种如权利要求2至4任一所述的重组载体在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
【文档编号】C12N15/113GK104059918SQ201410290393
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】王栋, 郭满盈, 孙瑜, 郭葆玉, 邱磊, 许家军, 杨向群, 黄会龙, 张冉, 弓雪莲, 李玉泉, 刘镇 申请人:中国人民解放军第二军医大学