一种改造的trail基因序列、表达方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种改造的TRAIL基因序列，改造后的野生型TRAIL编码cDNA序列见SEQ?ID?NO2；改造后的突变体TRAIL编码cDNA序列见SEQ?ID?NO3；改造后的突变体TRAIL基因编码氨基酸序列见SEQ?ID?NO4。将上述的改造的TRAIL基因序列的编码cDNA克隆于表达载体pTWIN1上。本发明还公开了将上述的改造的TRAIL基因编码氨基酸序列用作抗肿瘤药物的用途。本发明与现有TRAIL表达载体构建及表达分析文献对比，以非融合方式表达TRAIL蛋白，可溶性表达比例最高为90%以上；本发明方法构建的工程菌具有好的放大和产业化前景。
【专利说明】—种改造的TRAIL基因序列、表达方法及应用【技术领域】[0001]本发明主要涉及基因工程药物领域，特别是涉及到调整蛋白质N端编码氨基酸序列，改造TRAIL胞膜外段蛋白质编码基因碱基序列，得到一改造后的TRAIL胞膜外段野生型序列及一改造后的TRAIL胞膜外段突变体序列；采用经NdeI和PstI双酶切的去除了 Intein区域(约1549bp)的pTWINl载体连接，得到了几乎完全可溶的目的蛋白表达。将表达宿主菌大规模培养，采用三步层析方法纯化，制备出纯度超过95%的目的蛋白，目的蛋白在体外具有较强的抗肿瘤活性。新方法表达的TRAIL野生型及突变体蛋白极具发展潜力和优势，可能发展成为新型诱导肿瘤细胞凋亡药物。【背景技术】[0002]肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis-1nducing ligand, TRAIL)为肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)超家族的成员，其基因序列分别于 1995 年由 Wiley 等人(Wiley et al.1995)和 1996 年由 Pitti 等人(Pitti et al.1996)独立克隆获得，后者将其命名为凋亡素2配体(Apo21igand, Apo2L)。后来的研究证实Apo2L 与TRAIL实为同一种蛋白，因此习惯上可将其称为Apo2L/TRAIL。[0003]人Apo2L/TRAIL 的编码基因定位于染色体 3q26 (Miriani and Krammer.1998), 完整的Apo2L/TRAIL的cDNA序列编码全长为281个氨基酸的前体蛋白，其相对分子质量为32.5kDa。天然的Apo2L/TRAIL蛋白表现为II型跨膜蛋白，分细胞外C端区域、跨膜区、 细胞内N端区域等三部分。Apo2L/TRAIL的N端l_14aa为短小的胞内段，无信号肽序列； 第15-40位aa为疏水区，形成跨膜结构；C端第41-281位aa为胞外区，保守性强。C端能形成几个β折叠，再形成典型的β夹心结构，进而形成同源三聚体的亚单位，胞外区为蛋白发挥功能的主要结构区。Apo2L/TRAIL前体蛋白在特定的蛋白酶作用下水解形成可溶性 TRAIL,其第 114_281aa 为蛋白质的可溶性片段(Miriani and Krammer.1998)。[0004]人Apo2L/TRAIL的C端(胞外区)序列与TNF和Fas配体一样高度保守，人TRAIL 分子的胞外区与Fas配体、肿瘤坏死因子α、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β的同源性分别为 28%、23%和22% (Wiley et al.1995)。TRAIL与TNF家族其他成员最独特的区别在于其第 137-152位形成一个12-16个aa的插入环(AA’ loop)，此结构可插入受体的TRAIL结合位点，保证受体与TRAIL的特异性结合。结构突变研究证实，此插入环在TRAIL细胞毒性中起着关键的作用。晶体结构研究表明，Apo2L/TRAIL分子为一个同源三聚体分子，内部含有一个Zn原子，Zn原子同时与三个配体亚单位的第230位半胱氨酸连接，通过相互作用以维持分子的稳定(Hymowitz，et al.2000)。TRAIL是TNF家族中唯一的具有一个Cys残基的成员，Zn原子的结合对于同源三聚体的稳定性和生物活性至关重要(Bodmer et al.2000 ； Hymowitz, et al.2000)。Jean等研究证实,如将第230位半胱氨酸(Cys)突变 为丝氨酸或丙氨酸后，TRAIL将形成无活性的二聚体结构，与受体的亲和力将下降200倍，严重影响TRAIL 诱导细胞凋亡的活性(Jean et al.2000)。[0005]TRAIL的功能首先是作为生物体先天性或获得性免疫的调节剂，其次在细胞外源性凋亡途径过程中发挥重要作用，作为免疫监视在抗肿瘤过程中发挥重要作用。TRAIL的最大优点是可以选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞几乎没有毒性。研究资料表明，Apo2L/TRAIL无论在体外，还是体内对于各种来源的人肿瘤细胞系，包括结(直)肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、白血病以及多发性骨髓瘤等都具有诱导凋亡的作用(Ashkenazi et al.1999 ;Ashkenazi2002)。[0006]从TRAIL发现至今近20年时间里，TRAIL —直被作为一个重要的潜在抗肿瘤药物开发，TRAIL的临床试验在国外已 进入II期，在国内已完成III期。大量体内外试验均证实， TRAIL具有肿瘤特异性细胞毒性，尤其当它与小剂量化疗药物联用时即表现出明显的协同和增效作用。相反，研究发现机体中凋亡机制的缺失导致的TRAIL耐受与肿瘤细胞的快速生长和转移明确相关。[0007]长期以来，大肠杆菌一直是外源蛋白的首选表达系统。但由于外源蛋白在表达过程中容易被宿主细胞蛋白酶降解或者形成包涵体，其应用受到了限制。在很多情况下，表达蛋白形成非可溶性形式并聚集成所谓的“包涵体”，包涵体的形成妨碍有活性、结构正确的蛋白质获得，这种情况尤其发生在高水平蛋白表达的情况下。特定目的蛋白的可溶性与多种因素相关。首先影响蛋白质可溶性表达的因素是这个蛋白的氨基酸构成(WWW.biotech.0u.edu)。在大多数情况下，蛋白质表达的可溶性并不是“全或无”的现象。载体、宿主菌或发酵条件都可以用以调整可溶性目的蛋白和包涵体的比例。其中正确选择载体、宿主菌和发酵条件对于提高活性目的蛋白的量和比例会有显著帮助。[0008]TRAIL重组表达载体的构建及表达分析已经大量见诸报道，但表达产物大部分以包涵体形式存在，可溶性表达产物的比例较低。TRAIL蛋白需采用包涵体变性、复性方法纯化，包涵体纯化方法不仅操作繁琐、目的蛋白回收率低，而且不能直接获得具有正确构象的目的蛋白，目的蛋白复性困难，生物活性较低。这些不足之处使得TRAIL的生产效率较低、 生产工艺复杂、成本过高，大大影响了 TRAIL的应用开发。[0009]表1TRAIL原核表达研究文献分析[0010]
【权利要求】
1.一种改造的TRAIL基因序列，其特征在于，改造后的野生型TRAIL编码cDNA序列见 SEQ ID N02。
2.根据权利要求1所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，改造后的突变体TRAIL 编码cDNA序列见SEQ ID N03。
3.根据权利要求1所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，改造后的突变体TRAIL 编码氨基酸序列见SEQ ID N04。
4.根据权利要求1至3任一所述的改造的TRAIL基因序列的改造方法，其特征在于，包括以下步骤:设置连续或不连读的多个精氨酸序列；避免在编码一氨基酸三联密码子的后两位出现连续相同的两个碱基；提高编码前10个氨基酸基因序列碱基中GC含量的比例，使其处于 40-70%范围内。
5.根据权利要求1至3任一所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，将其编码cDNA 克隆于表达载体PTWINl上。
6.根据权利要求5所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，所述表达载体pTWINl 中切除Intein内含肽序列。
7.根据权利要求5所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，表达的诱导温度为 20。。。
8.根据权利要求5所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，所述表达载体采用 BL21 (DE3)宿主菌表达。
9.根据权利要求1至3任一所述的改造的TRAIL基因序列，其特征在于，所述改造的 TRAIL基因编码氨基酸序列分离纯化采用Ni+亲和层析、阳离子交换层析或阴离子交换层析。
10.一种权利要求1至3任一所`述的改造的TRAIL基因编码氨基酸序列用作抗肿瘤药物的用途。
【文档编号】C07K14/705GK103555729SQ201310479275
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】陈守春, 潘凤, 闫娟, 徐琦, 胡海洋, 黄先洲 申请人:成都华创生物技术有限公司