重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物制药领域，重点涉及利用基因工程技术手段对灵芝免疫调节蛋白融合蛋白制备与应用，经过一系列实验表明，融合蛋白的体内半衰期延长的效果与rLZ-8比较极其显著，生物活性方面融合蛋白较rLZ-8提升作用及其明显，特别是在治疗白细胞减少症和抗肿瘤方面融合蛋白较rLZ-8增强白细胞数量和抗肿瘤的作用极其显著。
【专利说明】重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组融合蛋白的构建、表达、纯化与应用，具体涉及用于治疗化疗导致的白细胞较少症和肿瘤等症的重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白的制备及其应用。
【背景技术】
[0002]灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)源自于松杉灵芝的菌丝体，其结构特征如下:包括一个N端的形成二聚体所需的重要结构域和一个C端的FNIII结构域，rLZ-8的N-端结构域由一个a-helix和一个β-strand组成,LZ-8单体上的N端a-helix和β-strand与另一单体上相同的结构域通过空间交换形成了重要的二聚体结合结构域，呈哑铃状。已有文献报道LZ-8具有免疫调节(专利申请号201110222012.5)和杀伤肿瘤细胞(专利ZL200810050206.X)的生物学活性。
[0003]目前，造成蛋白类药物半衰期较短的原因主要有:①蛋白质水解是绝大多数蛋白质的代谢方式之一，机体组织中蛋白水解酶的存在会使蛋白质药物活性降低；②肾脏是小分子蛋白质分解代谢过程中最重要的器官，相对分子质量小于69000Da的绝大多数蛋白质分子都能通过肾小球滤过作用而被排出体外肝脏在蛋白质药物代谢过程中也具有重要作用，药物通过扩散和载体转运等形式被转运至肝细胞中，然后再被微粒体酶P450、胞液中的蛋白酶或溶酶体所降解；而对于更大分子的肽和蛋白质则是通过受体介导的内吞作用被肝细胞摄取后被降解。由于灵芝免疫调节蛋白二聚体分子量不足26kDa，可能造成体内清除率高，药代动力学参数难以满足其新药开发的要求，因此，通过基因水平融合等技术手段延长LZ-8在体内的作用时间，为其在临床治疗中的应用奠定坚实的基础。为了延长蛋白类药物的半衰期，近几年各国学者主要从蛋白类药物的白蛋白融合、化学修饰、微囊化、构建突变体、糖基化等方面进行研究。`随着研究的不断深入和进展，长效蛋白药物的新品种不断涌现。
[0004]基因融合技术是将不同的基因连接起来从而表达具有复合功能的融合蛋白，通过基因融合技术增加多肽和蛋白药物分子量或改变药物与受体的亲和性等原理可以延长药物的半衰期。构建融合蛋白的原则为:将一个蛋白的编码基因的终止密码子去除，然后连接上带有终止密码子的另一个蛋白的编码基因，即实现两种蛋白的编码基因的融合，进而同时表达两种蛋白。融合蛋白基因稳定性高，可调控表达且制备简单，产物均一，对蛋白、多肽药物活性影响小等是目前研究长效多肽、蛋白药物的一种良好的途径。
[0005]目前研究的较为广泛的融合基因有人血清白蛋白基因、人免疫球蛋白(IgGl、IgG4)基因等。人血清白蛋白(Human Serum Albumin,简称HSA)是人血衆中的蛋白质,其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kDa。在血浆中其浓度为42g/L，约占血浆总蛋白的60%。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等；同时维持血液正常的渗透压。在临床上人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂。
[0006]人免疫球蛋白(IgG)是人体血液中最丰富的蛋白，其半衰期可达21天。已有报道显示将IgG的Fe片段与其他蛋白融合，可显著增加其他蛋白在体内的生物活性和半衰期，其中大多数实验者选择IgGl、IgG4这两种亚型的Fe段作为融合对象，这种方法已经广泛应用于一些临床上很重要的细胞因子和可溶性受体，如sTNF- a R、LFA3、CTLA-4、IL_2、IFN- α等，并获得了成功。
[0007]鉴于上述【背景技术】，本发明采用了基因重组技术将灵芝免疫调节蛋白分别与人血清白蛋白、人免疫球蛋白IgG的Fe段进行融合，构建真核表达体系，经过表达、纯化得到目的蛋白，并对目的蛋 白进行了相关生物学活性与药学研究，结果表明灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)与HSA融合蛋白在药学与生物学活性以及病理应用方面有明显差异。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法，探讨其在治疗化疗药所致白细胞减少症等症及在抗肿瘤药物中的应用。
[0009]融合蛋白序列:本发明的灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)与HSA融合蛋白rLZ-8-HSA，其特征在于包含灵芝免疫调节蛋白和HSA ;其氨基酸序列为:SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNL GVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSMKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF⑶KLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID N0.1)，其中灵芝免疫调节蛋白多肽的C端与人血清白蛋白多肽之间连接肽的氨基酸序列为GGGGSS ；
本发明提供的灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)与人IgGlFc段的rLZ-8- Fcl融合蛋白，特征在于包含灵芝免疫调节蛋白和IgGlFc段；其氨基酸序列为:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSG RNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGS SEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID N0.2)，其中灵芝免疫调节蛋白多肽的C端与人血清白蛋白多肽之间连接肽的氨基酸序列为GGGGSS ；
本发明提供的灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)与人IgG4Fc段的rLZ-8-Fc4融合蛋白，特征在于包含灵芝免疫调节蛋白和IgG4Fc段；其氨基酸序列为:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSG RNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQffNGGGGS SYTQRFKDKAKLTAVTSANTAYMELSSLTNEDSAVYYCSIIYFDYADFIMDYWGQGTTVTVSTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQXSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLXGKEYKCKVSXKGLPSSIEKTISXAXGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSXWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID N0.3)，其中灵芝免疫调节蛋白多肽的C端与人血清白蛋白多肽之间连接肽的氨基酸序列为GGGGSS ；
工程菌株的构建与目的蛋白表达及纯化:分别构建了 LZ-8融合蛋白的核苷酸序列的载体；采用电转化技术得到以毕赤酵母作为融合蛋白胞外表达的宿主细胞；优化了毕赤酵母发酵条件提高了融合蛋白的表达量；采用重力柱亲和层析、分子筛、固定化金属鳌合亲和层析(IMAC)法、疏水层析(HIC)、阴离子交换层析等方法纯化目的产物，得到不同融合蛋白的纯度均达到99%以上，为后续的药学实验提供了原料药。
[0010]药学实验方面:将不同的融合蛋白与rLZ-8作对照进行活性检查实验，经过ELISA法检测得出结论，结果说明融合蛋白rLZ-8-HSA的生物学活性较融合前rLZ_8生物学活性高，有显著差异，具有统计学意义；而rLZ-8- Fcl与rLZ-8-Fc4的生物学活性没有达到融合前rLZ-8活性指标，具有显著差异；将不同的融合蛋白与rLZ-8作对照进行体内半衰期实验，经过ELISA法检测得出不同的融合蛋白的体内半衰期均得到显著提高，约为rLZ-8的3倍；同时将不同的融合蛋白与rLZ-8作对照进行治疗白细胞减少症实验，经过动物全血细胞分析仪检测白细胞数，结果表明不同的融合蛋白和rLZ-8在治疗白细胞减少症疗效明显差异；其中，在同一剂 量下，融合蛋白rLZ-8-HSA促进白细胞生长周期更短，在同一治疗周期下，融合蛋白rLZ-8-HSA促进白细胞生长数量更多；说明HSA更适合作为rLZ_8的融合对象，能够明显增强LZ-8 在治疗白细胞减少症方面的应用；通过融合蛋白rLZ-8-HSA抑制黑色素瘤细胞生长实验表明，在同一剂量(以LZ-8量计)下，融合蛋白rLZ-8-HSA有效抑制黑色素瘤细胞的生长，与融合前rLZ-8治疗效果比较具有明显差异；同时在融合蛋白rLZ-8-HSA抑制肝癌细胞生长的实施例中可以看到，在同一治疗周期内，融合蛋白rLZ-8-HSA治愈率有明显的提高，是发明人始料未及的；本发明还提供融合蛋白rLZ-8-HSA对治疗血小板减少症的实施例，从中可以看出，与模型组比较，在给药初期rLZ-8-HSA药物组已明显刺激小鼠血小板增生，差异极其显著，在给药中期时恢复到正常水平，在治疗由注射抗血小板血清导致的血小板减少症实验动物模型也取得了很好的效果。
[0011]本发明有益效果如下:本发明中提供的融合蛋白，其体内半衰期的较rLZ-8出现显著延长；由于基因融合技术构建融合蛋白，会产生蛋白融合后影响目的蛋白的生物活性，而本发明构建的融合蛋白rLZ-8-HSA的生物活性经过试验证明其生物活性明显优于融合前的rLZ-8 ;且本发明构建的rLZ-8-HSA融合蛋白毕赤酵母工程菌种发酵工艺简单，产量高，表达产物单一，易纯化，为工业化生产提供了有利条件；由于采用毕赤酵母表达系统存在表达产物在发酵液中易降解等问题，本发明通过控制发酵工艺条件，大大减少了毕赤酵母发酵表达过程中对目的产物的降解，提高了产率；本发明采用体内试验证明体内半衰期较融合前rLZ-8出现显著延长的同时在治疗白细胞减少症研究中的最低给药剂量和起效时间均优于融合前rLZ-8 ;采用黑色素瘤与肝癌作为抗肿瘤研究的代表，分别开展了体内和体外实验，在黑色素瘤与肝癌实施例中可以看到两种实验方式的治疗效果均明显优于融合前rLZ-8，这是发明人始料未及的；在治疗血小板减少症的实施例中可以看出，与模型组比较，在给药初期rLZ-8-HSA药物组已明显刺激小鼠的血小板增生，差异极其显著，在给药中期时恢复到正常水平，这也是目前发现的rLZ-8融合蛋白所能达到的最佳效果。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1诱导表达66h与72h各融合蛋白表达情况
图注:泳道I样品为蛋白Marker ;泳道2样品为HSA标准品；泳道3样品为rLZ_8 ;泳道4样品为诱导72h rLZ-8-HSA上清液；泳道5样品为诱导66h rLZ-8-HSA上清液；泳道6样品为诱导72h rLZ-8- Fcl上清液；泳道7样品为诱导66h rLZ-8-Fcl上清液；泳道8样品为诱导72h rLZ-8-Fc4上清液；泳道9样品为诱导66h rLZ-8_Fc4上清液。
[0014]图2不同融合蛋白Western Bolt鉴定图谱
图注:泳道I样品为蛋白Marker ;泳道2样品为rLZ_8 ;泳道3样品为rLZ_8_HSA ;泳道4样品为rLZ-8- Fcl ;泳道5样品为rLZ-8_Fc4。
[0015]图3 rLZ-8-HSA融合蛋白分子筛纯化色谱图 图4不同融合蛋白与rLZ-8蛋白体内半衰期对比
【具体实施方式】
[0016]实施例1 rLZ-8融合蛋白工程菌株构建与表达
构建部分:根据酵母密码子`偏好性分别合成了目的片段rLZ8-HSA、rLZ8_Fcl、rLZ8-Fc4序列，存于puc57质粒中。设计包含酶切位点StuI和KpnI的引物。引物合成如下:
⑴ LZ-8-HSA:5’ CATAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3’
5’ CGGGGTACCGAATTCCTATTACA 3’
⑵ LZ-8-Fcl:5’ GTTAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3’
5’ TAGGGTACCTCATTTACCAGGGG 3’
⑶ LZ-8-Fc4:5’ CCGAGGCCTTCTGATACTGCTT 3’
5’ GATGGTACCTCACGGAGCATGAG 3’
通过PCR得到目的片段，PCR条件为:开始95 V 30s，然后95 V 30s, 58 V 30s，72°C 2min，共 30 个循环，最后 72°C IOmin 16°C，待机。
[0017]1%琼脂糖电泳鉴定目的片段分别在在2184bp(LZ-8-HSA)、1064bp(LZ- 8_Fcl)、774bp (LZ-8-Fc4)。将 pPICZ α A 载体和目的片段按照 GENEART Seamless Cloning andAssembly Kit试剂盒说明书操作，载体和目的片段摩尔比是1: 3，与5X缓冲液，IOX酶混合液反应30分钟。取IOul连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5 alpha中，37°C培养I小时后，涂博来霉素抗性的LB平板。挑取单菌落37°C摇床培养过夜。菌液12000g离心弃上清，质粒小提试剂盒提取重组质粒，测序。用双酶切和电泳鉴定转化子是否正确，最后用5’A0X和3’ AOX引物证实序列的正确性。
[0018]取重组质粒用SacI酶线性化，37°C，I小时左右。X33毕赤酵母接种到YPD培养中30°C，300rpm摇床培养过夜。扩大培养到5OOmL，OD6c?达到1.3左右，制备酵母感受态，冰浴30min后至冰浴无菌水重悬，40C，1500g离心5min，重复2次。换冰浴IM山梨醇重悬，4°C，1500g离心5min,分装每管80ul酵母感受态,加入IOug的线性化质粒。冰浴5分钟。转移到电转杯中，1.5kV，50 μ F，25mA条件电转化。30°C摇床培养2小时，涂博来霉素Zeocin抗性的YPDS平板，30°C培养3天。
[0019]筛选部分:无菌条件下在博来霉素Zeocin抗性的YPDS平板上分别挑选每种融合蛋白工程菌20个单克隆，挑菌置于IOmL YPD液体培养基中于30°C，300rpm摇瓶培养12小时，1500g, 5min离心弃上清，换BMGY培养基于30°C，300rpm摇瓶培养18小时，1500g, 5min离心弃上清，换BMMY (1%甲醇)培养基，每24小时补加1%甲醇，诱导表达72小时。1500g，5min离心，_20°C保存上清，经SDS电泳及Western Bolt鉴定定量与定性说明目的蛋白的表达，以此筛选高表达工程菌株。
[0020]实施例2融合蛋白纯化工艺
由于融合蛋白有公共的LZ-8结构，所以以该结构的特点和性质，分别摸索了重力柱亲和层析、分子筛、固定化金属鳌合亲和层析(IMAC)法、疏水层析(HIC)、阴离子交换层析等方法纯化，具体方法如下:
rLZ-8-FcUrLZ-8-Fc4 纯化方法:
微滤:将发酵液10000转/分离心得到上清，再用孔径大小为IOOKd的中空纤维柱纯化(微滤)，除去小分子的盐类和糖类，得到8L含色素、核酸、蛋白的黄色澄清液。
[0021]rProtein A Gravi Trap重力柱亲和层析:配制缓冲液A相:0.22M磷酸盐缓冲液，pH 7.7,0.15M氯化钠，配制缓冲液B相:0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 4.0,0.22 μ m抽滤，超声脱气；采用A相磷酸盐缓冲液平衡色谱柱，体积10ml。分别将预处理的rLZ-8-Fcl、rLZ-8-Fc4发酵液IOml上样`，反复结合两次。(样品处理:90ml发酵液+IOml IOX磷酸盐缓冲液，0.22 μ m过滤除菌保存)，采用A相磷酸盐缓冲液冲色谱柱，洗脱未结合。B相柠檬酸盐缓冲液洗脱样品，体积10ml。放置2min，弃掉Iml的色谱柱内体积，用1.5ml离心管接收样品，保留检测。使用5次之后，需要再生，加入5ml 6M盐酸胍，放置2min，再用A相冲洗色谱柱。
[0022]分子筛层析:用Superdex 75填料填装柱(GE公司，XK16/70型，即内径16mm，高度70cm)，填料高度60cm。用100 μ Ll%丙酮进样检测，测定柱效为10000左右。蛋白按照流速2mg/mL浓度5mL上样，然后用pH7.5, NaH2PO4 -Na2HPO4 (50mM)缓冲液进行洗脱(如图3)，收集峰进行取样，进行电泳和HPLC检测。
[0023]实验结论:经过精细纯化后，蛋白HPLC检测纯度为99%以上，SDS-PAGE电泳一条带。
[0024]rLZ-8-HSA 的纯化方法:
步骤(1):用固定化金属鳌合亲和层析(IMAC)法纯化rLZ-8-HSA填料IMAC Sepharose6Fast Flow I升购自于GE公司，装填XK50/30柱子，填料高度15cm，用纯化水置换保存液，用I倍柱体积的0.1M硫酸铜溶液过柱，用4倍体积纯化水冲掉未被吸附的铜离子。然后使用缓冲液A:20mmol/L磷酸盐、0.6mol/L氯化钠、pH7.3,平衡层析柱。把含人血白蛋白的发酵上清液加入磷酸盐、氯化钠、使之的达到20mmol/L磷酸盐、0.6mol/L氯化钠、pH7.3。然后使用AKTA? Purify层析系统上样，流速50ml/min。上样后，用缓冲液A洗漆，至吸收值达到基点。用缓冲液B:20mmol/L磷酸盐、0.6mol/L氯化钠、0.3M咪唑、pH7.5来洗脱目标蛋白，收集缓冲溶液B的洗脱峰。
[0025]步骤⑵:用疏水层析(HIC)进行纯化，对步骤⑴收集的B缓冲溶液洗脱峰进行疏水层析纯化。用苯基疏水层析介质Phenyl Sepharose? 6Fast Flow (high sub)(GE公司)来装填直径5cm的层析柱，柱高15cm。介质在使用前需用3倍柱体积的缓冲液C:50mmol/L磷酸盐、0.5M氯化钠、pH6.5平衡。向步骤(1)得到含目标蛋白的B缓冲溶液的洗脱液中加入去离子水，稀释至0.5M NaCI的浓度，用磷酸调pH值至6.5。用AKTA?Purify层析系统上样，流速50ml/min，上样结束后，用2倍柱体积的缓冲液C: 50mmol/L磷酸盐、
0.5M氯化钠、pH6.5继续洗脱。收集流穿峰和用缓冲液C的洗脱峰。与疏水层析柱结合的部分，用2倍柱体积的去离子水洗脱，流出液丢弃。将疏水层析柱收集液，加入终浓度为0.1M的四硼酸钠和氯化钙溶液，调节pH至9.0，处理0.5-24小时，然后1000Orpm离心20min，取上清液，用MILLIP0RE公司的IOK超滤膜脱盐。
[0026]步骤(3):阴离子交换层析精制样品,装Q Sepharose?High Preformance填料于一根直径2.6cm、高15cm的层析柱子中，填料体积80毫升。用2倍柱体积的去离子水洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液E (50mMPB,pH7.0)平衡。上样后使用2个柱体积的缓冲液E洗涤。然后用0-0.5M NaCI经10倍柱体积梯度洗脱，收集主峰。
[0027]实验结论:经过精细纯化后，蛋白HPLC检测纯度为99%以上，SDS-PAGE电泳一条带。
[0028]实施例3不同融合蛋白促小鼠脾细胞增值比较
采用WST-1方法检测融合蛋 白对小鼠脾细胞增值作用的影响，反映出其生物学活性的强弱，本发明采用BALB/C雌性小鼠，体重在20-22g，拉颈处死小鼠，无菌条件下取脾脏，置于预先加入5ml含10%小牛血清的DMEM的平皿中；用镊子分别将脾捣碎，并用纱布过滤组织悬液以除去组织块，制备脾细胞细胞悬液；取100微升细胞悬液加入900微升2%冰醋酸溶液于显微镜下计数。用含2%小牛血清的DMEM调整细胞浓度为5X 106/ml ;分别配制相同摩尔浓度梯度的融合蛋白和rLZ-8，设3个梯度浓度，每个浓度设置9个孔，100微升/孔。加细胞浓度为5X 106/ml的细胞悬液100微升/孔。振荡混匀后放入37°C、5% CO2孵箱孵育24h ;孵育后加入WST-1，20微升/孔。放入37°C、5%C02孵箱继续孵育3小时后，测OD450(BIO-RAD酶标仪)。实验结果见表1。
[0029]表1.不同融合蛋白促细胞增值生物活性(X土s n=9)
AZ 8Allfel.1LZ-8-Fe4
5Am4mdJi ojiSttflji a jiiiflji ijsma-- us_jf
1.197iflji ojiiiaji olmmo? utoaji*
is.pxio^iii, isrnmnl? 械 jiftgiatomijtmjs*
注:与 rLZ-8 组比较，*/7 <0.05。
[0030]由表1可以看出，随着蛋白浓度的增加，融合蛋白对脾细胞增值作用也在增加，在同一蛋白浓度下，不同融合蛋白与rLZ-8增值作用比较可以看出，rLZ-8-HSA的促脾细胞增值作用高于rLZ-8组，有显著差异具有统计学意义。而融合蛋白rLZ-8-Fcl与rLZ-8-Fc4对小鼠脾细胞的增值作用明显减弱；实验结果说明，LZ-8与HSA融合后的活性位点没有受到融合的影响，而LZ-8与IgG- Fcl和IgG-Fc4的融合后，蛋白活性受到了影响，阻碍了 LZ-8活性的发挥。
[0031]实施例4.不同融合蛋白半衰期检测
采用体重在18-22g左右的BALB/c小鼠作为实验鼠，每组10只小鼠，以融合蛋白100g/kg (LZ-8量计)的剂量静脉注射给药，设计时间段为2、4、6、8、10小时后在不同时间段进行采血检测，得出结果，做出药物浓度与时间的曲线图(图4)由实验结果可以看出，随着药物进入小鼠体内时间的延长，血液中药物浓度出现不同程度的下降，其中，可以看到融合后蛋白的半衰期与融合前rLZ-8的半衰期比较有极其显著的增加O°〈0.0001)，大大延长了血液中的药物浓度，提高rLZ-8在小鼠体内的半衰期。
[0032]实施例5.融合蛋白rLZ-8-HSA治疗白细胞减少症的研究
采用Wistar大鼠作为实验动物，共18只，体重100g左右。试剂配制方法如下:rLZ_8用无菌生理盐水配制。分为60 μ g/kg>30 μ g/kg>15 μ g/kg剂量组；rLZ-8_HSA融合蛋白用无菌生理盐水配制。分为60 μ g/kg、30 μ g/kg、15 μ g/kg (以LZ_8量计)剂量组；金嘉赛强【重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)】，生产批号:20130403 ;75μ8/支，用无菌生理盐水配制成13.5 μ g/mL，0.1mL/只，注射用环磷酰胺(CP)，生产批号13020225 ；200mg/支。用无菌生理盐水配制:20mg/mL,0.1mL/只，即20mg/kg。
[0033]正常对照组，rLZ-8低剂量组，rLZ-8中剂量组，rLZ-8高剂量组，rLZ-8-HSA融合蛋白的低中高剂量组 ，阳性对照组(金磊赛强)。除正常对照组(给予等量生理盐水)外，每组大鼠均给予环磷酰胺尾静脉注射，20mg/mL，0.1mL/只，连续3天。于第三天，大鼠尾静脉取血，细胞分析仪检测白细胞数。造模成功后按上述分组分别给予相应剂量rLZ-8、三种融合蛋白、阳性药(金磊赛强)治疗，正常对照组和CP组给予等量生理盐水，于治疗第I天，第3天和第7天分别大鼠尾静脉取血，检测白细胞数。对比治疗前后白细胞数变化，分析药物疗效。
[0034]表2.rLZ-8对白细胞低下大鼠模型的影响(n=10)
【权利要求】
1.重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白(rLZ-8-HSA)，其特征在于灵芝免疫调节蛋白的C末端与人血清白蛋白之间由连接肽连接，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所/Jn ο
2.如权利要求1所述的融合蛋白rLZ-8-HSA在制备治疗化疗药所致白细胞减少症药物中的应用。
3.如权利要求1所述的融合蛋白rLZ-8-HSA在制备治疗抗黑色素瘤、肝癌药物中的应用。
4.如权利要求1所述的融合蛋白rLZ-8-HSA在制备治疗血小板减少症药物中的应用。
5.如权利要求2、3、4所述药物，其特征在于该药物制剂核心成分是由权利要求1所述的融合蛋白和任选的药学可接受的辅剂组成。
6.如权利要求5所述的药物制剂给药途径为口服和非肠道给药，其中，口服包括口服液，片剂，丸剂和胶囊；非·肠道给药包括外用药和注射剂。
【文档编号】C07K19/00GK103524628SQ201310479016
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】孙非, 梁重阳, 张喜田 申请人:张喜田, 孙非