用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物基因工程领域中用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套 产品及其应用。
【背景技术】
[0002] 近十年来出现了 3种新的研究手段，可W帮助科研人员对各种细胞和各种生物体 内的几乎任意基因进行人工操作。运种新技术就是我们常说的"基因组编辑技术（genome editing)"，包括锋指核酸酶狂inc-finger nucleases, ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶 (transcription activator-Uke effector nucleases, TALEN)和规律成簇间隔短回文重 复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats), CRISPR)。
[0003] 锋指核酸酶和转录激活样效应因子核酸酶都是嵌合体，都是由经过设计的、序列 特异性的 DNA 结合元件（programm油le, sequence-specific DNA-binding modules)和 非特异性的DM切割结构域结合而成的。ZFN和TALEN都可W对DM进行各种遗传修饰， 运两种核酸酶的作用机制都是先对DNA双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口值NA double-strand break, DSB)，然后激活细胞内的非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ)修复机制，运是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制，或者同源重 组化omology-directed r巧air,皿R)修复机制，运是一种高保真的修复机制，不容易出现 突变，利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。运种由序列特异性的DNA结合结 构域与非特异性的dm切割结构域组合而成的人工核酸酶就是运种基因组编辑技术的重 要组成部分。运些嵌合式的核酸酶能够W极高的效率、极高的精确度对基因组进行人工修 饰，切割DNA产生DSB，然后利用NHEJ或皿R等DSB修复机制完成我们所需要的各种人工修 饰。由于科研人员们对锋指蛋白和TALE蛋白等蛋白的DNA结合结构域的设计能力越来越 强，所W运种基因组编辑技术的应用范围也一再地被拓展。运些既简单又灵活的核酸酶在 遗传工程学领域里发挥了极大的作用，其重要性也在与日俱增，已经站到了遗传工程工作 的最前线。
[0004] CRISPRs是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，运一模式出现在超 过40%的细菌和90%的古生菌中。研究表明，CRISH?与一系列相关蛋白、前导序列一起， 能为原核生物提供对抗隧菌体等外源基因的获得性免疫能力。
[0005] 起初，很多研究人员假定运些奇怪的重复序列是毫无意义的，但是2005年，=个 生物信息学团队报告，间隔区DNA通常和隧菌体的基因序列相匹配，表明CRISPR在微生物 免疫中可能发挥了作用。马里兰州美国国家生物技术信息中屯、的化gene Koonin和他的同 事提出，细菌和古生菌获得了隧菌体DNA，之后将其作为RNA分子（能阻止外来DNA的匹配） 的一个模板保存起来，就像真核细胞利用一个被称作核糖核酸干扰（RNAi)的系统摧毁RNA 一样。2007年，Rodolphe Barrangou、化ilippe Horvath和其他人证明，他们能通过添加 或删除和隧菌体DNA相匹配的间隔区DNA，改变嗜热链球菌对隧菌体攻击的抵抗力，运一发 现使得杜邦公司能够为食品生产培育更强壮的菌株；他们同时也发现了其中隐藏的基本原 理：遭遇隧菌体入侵时，CRISPR会作出反应，此时细菌把间隔区DNA和DNA回文序列转录成 一串长的RNA分子，tracrRNA (-个额外的RNA片段）和Cas9蛋白一起作用产生crRNA (源 自间隔区的RNAs)。2011年，化a巧entier在《自然》杂志上提出，化s9蛋白、tracrRNA和 crRNA -起W某种方法攻击和crRNA配对的外来DNA。不仅是食品科学家和微生物学家，很 多领域的研究人员都意识到细菌免疫系统的重要性，因为它具备一个非常有价值的特性： W某个特定的基因序列为目标。许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、 斑马鱼、细菌、果蛹、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因，从而证明了运个技术的广泛适 用性。
[0006] 在W上提到的=种精确操纵基因的技术中，CRISPR的功效和易用性在各方面都更 胜一筹。在切割目标DNA方面，CRISPR系统要比TALE化更高效，且能比TALE化处理更多 的基因。Zhang化ng和他的同事的实验显示，CRISPR能立刻锁定和切割人体细胞中的两个 基因。在与马萨诸塞州怀海德生物医学研究所发育生物学家Rudolf化enisch的合作中， Zhang分裂了小鼠胚胎干细胞中的5个基因，运些工作为培育转基因小鼠打下了基础，运是 生物医学研究的一个关键工具。他的团队发现，运能简单地将化s9蛋白信使RNA和两个 向导RNAs注入老鼠的卵子或受精卵中。此外，通过对化s9蛋白基因进行改构和利用一对 曲NA引入不同的切割位点，CRISPR的脱祀效应问题也被克服。至此，CRISPR技术本身走向 完善，并开始进入了应用阶段。
[0007] 人血清白蛋白是人血浆中的主要成份，血清白蛋白在肝脏中合成后分泌进入血 液，临床上主要用于：1、失血创伤、烧伤引起的休克；2、脑水肿及损伤引起的烦压升高；3、 肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；4、低蛋白血症的防治；5、新生儿高胆红素血症；6、用于 屯、肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征。由于医用蛋白 如今主要由人血提取，而有限的血液资源极大地限制了白蛋白的生产和使用，供给仍然远 远不能满足市场需求。如果能制备出表达人血清白蛋白的转基因动物，将有望获得新的更 充足的人血清白蛋白来源。
【发明内容】
[000引本发明所要解决的技术问题是如何制备人血清白蛋白。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪 的成套产品。
[0010] 本发明所提供的用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品，含有人血清 白蛋白基因的重组载体、能产生化s9蛋白的mRNA的生物材料和能产生sgRNA的生物材料； W11] 所述人血清白蛋白基因编码al或曰2的蛋白质：
[0012] al、氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白质；
[0013] a2、在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有人血清白蛋白活性的由al衍生的蛋白质；
[0014] 所述sgRNA在猪基因组中识别的祀标DNA序列为SEQ ID No. 3所示的核巧酸序列。
[0015] 其中，SEQ ID No. 1由609个氨基酸组成。
[0016] 上述成套产品中，所述人血清白蛋白基因为如下所述的核酸分子：
[0017] 1)其编码序列是沈Q ID No. 2的第1020-2849位的DM分子或cDNA分子；
[0018] 2)与1)限定的核巧酸序列具有75%或75% W上同一性，且编码所述人血清白蛋 白的DNA分子或cDNA分子；
[0019] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核巧酸序列杂交，且编码所述人血清白蛋白的 DNA分子或cDNA分子。
[0020] 上述用于编码所述人血清白蛋白的核酸分子，本领域普通技术人员可W很容易地 采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述人血清白蛋白的核 酸分子的核巧酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述人血 清白蛋白的核酸分子的核巧酸序列具有75%或者更高同一性且编码所述人血清白蛋白，均 是衍生于本发明的核巧酸序列并且等同于本发明的序列。
[0021] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 2的第1020-2849位核巧酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更 高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉 眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比 (% )表示，其可W用来评价相关序列之间的同一性。
[0022] 所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SD