表达调控序列的制作方法

专利名称：表达调控序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业，特别涉及开发新的细菌细胞中受调控基因表达的方法。
背景技术：
对于许多基于开发重组细菌，特别是大肠杆菌的生物工程方法而言，通过加入相对简单而廉价的化合物诱导克隆基因的表达是一个非常吸引人的想法。显然，天然的L-氨基酸是用作这类诱导物的非常良好的候选物。但是，据发明者所知，色氨酸酶基因的调控区域是通过往培养基中加入色氨酸而诱导的独特的天然系统[Landick R.，Tumbough C.L.，Yanofsky C.″转录衰减″/″大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella.)细胞和分子生物学″(第二版，F.C.Neidhardt-主编)，(1996)，第1263-1286页]。相反，存在几个当细胞中氨基酸过剩时使受调控基因表达减少的系统(特别是色氨酸操纵子阻遏物-操纵基因系统[Platt，T.″大肠杆菌色氨酸操纵子上基因表达调控″/″操纵子″(Miller，J.H.，Reznikoff，W.S.-编)，冷泉港实验室(1978)，第263-302页]，氨基酸操纵子转录的衰减[Landick R.，Tumbough C.L.，Yanofsky C.″转录衰减″/″大肠杆菌和沙门氏菌细胞和分子生物学)″(第二版，F.C.Neidhardt-主编)，(1996)，第1263-1286页])。
在氨基酸操纵子中，转录衰减的分子机理基于在所谓的“衰减子”区域形成可变mRNA二级结构的可能性，其依赖“前导”肽的翻译，前导肽的基因位于操纵子的第一个结构基因上游。该前导肽基因的编码部分富含有义氨基酸密码子(那些其生物合成由相应操纵子的蛋白质产物提供的氨基酸的密码子对于色氨酸操纵子，有色氨酸密码子，对于组氨酸操纵子，有组氨酸密码子，对于苏氨酸操纵子，有苏氨酸和异亮氨酸密码子等)。
图1中以大肠杆菌色氨酸和组氨酸操纵子的衰减区域为例介绍了已良好地建立的转录调控的详细情况。从图1可以看出，可变mRNA二级结构可以在相应的DNA片断转录时形成相应于色氨酸前导区形成发夹t1∶t2和t3∶t4或其替代物t2∶t3，类似地，相应于组氨酸前导区形成h1∶h2、h3∶h4和h5∶h6，或h2∶h3和h4∶h5。发夹t3∶t4和h5∶h6为典型的ρ-非依赖型转录终止子，因此它们在转录的延长期的形成导致转录在相应操纵子的衰减子区域终止进而阻止操纵子中结构基因的表达。
由于mRNA二级结构形成过程与mRNA合成过程相结合，因而在色氨酸衰减子中当前导肽未被翻译时，逐步地形成发夹t1∶t2和其后的t3∶t4(其另一种形式一发夹t2∶t3不能形成，因为t1∶t2已在先形成)。类似地，在合成组氨酸衰减子mRNA但不翻译相应的前导肽的情况下，发夹h1∶h2、h3∶h4和其后的h5∶h6的较快形成，阻止了其替代物h2∶h3和h4∶h5的形成。如前述，发夹t3∶t4和h5∶h6的形成导致在相应的衰减子区域的终止。在反应混合物中不存在任何翻译因子，由纯RNA聚合酶体外转录相应的DNA的过程中，或在体内常规氨基酸饥饿情况下，可以实现这种状况。
当有义氨基酸过剩(更为确切地说，相应的负载tRNA过剩)或在细菌细胞中处于缺陷状态时，体内前导肽的翻译可能会出现更加复杂的情况。已表明，起始衰减子mRNA转录的RNA聚合酶停在位于紧邻于发夹1∶2下游的区域的暂停位点(可能这种发夹的形成是这种暂停的必要但不是充足的条件)[Chan，C.L.，Wang，D.，Landick，R.″多重相互作用稳定了单一暂停转录中间体，其中由发夹到3′末端间隔区可区分出暂停和终止途径″/分子生物学杂志.268(1997)54-68]。翻译前导肽N-末端部分的核糖体释放出RNA聚合酶，然后继续进行转录的延长，从而可以形成mRNA-2∶3可变发夹。以下事件取决于有义氨基酸的负载tRNA的细胞内浓度，因为此时必须通过核糖体翻译相应的前导肽基因的密码子。
在有义氨基酸饥饿的情况下，核糖体暂停在有义密码子处且不会破坏发夹2∶3，而RNA聚合酶合成大体上可以形成终止子发夹(对于色氨酸衰减子为t3∶t4，而对于组氨酸衰减子为h5∶h6)的mRNA的下游片断，但它不折叠，因为存在该可变发夹(t2∶t3-对于色氨酸衰减子，而结构h2∶h3、h4∶h5-对于组氨酸衰减子)，然后延长转录并合成操纵子结构基因的mRNA。
在有义氨基酸过剩的情况下，前导肽高效翻译，因此最初破坏发夹1∶2的核糖体也破坏发夹2∶3，并停在前导肽的终止密码子处。后者最终导致终止子发夹形成且使转录终止于衰减子区域。

发明内容
本发明的目的是创建新的原核人工调控系统，该系统通过增加细胞内有义氨基酸浓度来增加受控基因表达。
本发明人利用基于依赖前导肽翻译效率而形成可变mRNA二级结构的天然调控机理，成功地创建了一种依赖细胞内氨基酸浓度的新的人工调控系统。与天然氨基酸操纵子的衰减子不同的是，该新系统在有义氨基酸胞内浓度过剩的情况下使受控基因的表达并不减少而是增加。同时，在有义氨基酸饥饿时，受新表达调控序列调控的基因表达水平降低。已公知的转录调节、氨基酸操纵子转录的衰减已用作该新系统的先祖，但该新系统与其先祖不同的是，在有义氨基酸过剩的情况下，不是降低而是增加受控基因的表达水平。
本发明提供了下述表达调控序列，表达调控方法和使用该表达调控序列的生产方法(1)一种依赖细胞内氨基酸浓度来调控连接于表达调控序列下游的靶基因的表达的表达调控序列，其中，在含有包括表达调控序列、连接在表达调控序列上游的启动子和连接在表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体的细菌中，通过增加细胞内氨基酸浓度而降低在表达调控序列中的终止频率、起始于启动子的转录频率，以增加靶基因的表达。
(2)根据(1)的表达调控序列，它包括编码含有所述氨基酸和ρ-非依赖型终止子的前导肽的区域，其中在氨基酸饥饿的情况下，在翻译过程中当前导肽的翻译停在该氨基酸的密码子处时，在表达调控序列转录物上形成ρ-非依赖型终止子的碱基对结构，以增加在表达调控序列中的终止频率、以及转录的频率。
(3)根据(2)的表达调控序列，它包括不少于3的奇数个区段，其中每个区段可以与其相邻区段形成碱基对结构，并且在表达调控序列的转录物中，当除了末端区段以外的区段各自与其两个相邻区段之一形成碱基对结构时，该区段与其两个相邻区段的另一区段不形成碱基对结构；在上游末端的第一区段和与翻译前导肽的核糖体相互作用的区域重叠；在前导肽翻译过程中，与第一区段相邻的第二区段和与第二区段相邻的第三区段形成碱基对结构；由下游末端区段和其相邻区段形成的碱基对结构是ρ-非依赖型终止子的碱基对结构。
(4)根据(3)的表达调控序列，其中，第一区段与前导肽的氨基酸密码子重叠。
(5)根据(3)或(4)的表达调控序列，其中区段数为5。
(6)根据(3)-(5)的任一表达调控序列，其中各区段的序列或其部分和相邻区段的序列或其部分构成反向重复序列。
(7)根据(2)-(6)的任一表达调控序列，其中，ρ-非依赖型终止子能够在埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)或沙雷氏菌属(Serratia)细菌中发挥功能。
(8)根据(7)的表达调控序列，其中，ρ-非依赖型终止子能够在埃希氏杆菌属细菌中发挥功能。
(9)根据(7)或(8)的表达调控序列，它顺次包括来自上游侧的5段区段an1-an5，其中区段an1和an2，以及前导肽的编码区来自大肠杆菌的色氨酸操纵子的衰减子序列，区段an4和an5来自大肠杆菌的组氨酸操纵子的衰减子序列，而区段an3来自色氨酸操纵子和组氨酸操纵子的衰减子序列的组合。
(10)根据(9)的表达调控序列，该前导肽经修饰为含有不少于2个色氨酸残基。
(11)一种调控靶基因表达的方法，包括下述步骤在培养基中培养含有包含(1)-(10)之任一定义的表达调控序列、连接在该表达调控序列上游的启动子和连接在该表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体的细菌；和改变该表达调控序列调控表达所依赖的细胞内氨基酸浓度，以调控靶基因的表达。
(12)一种生产靶物质的方法，包括步骤培养能够生产该物质的细菌以产生该物质并收集该物质，其中该细菌含有包含(1)-(10)之任一定义的表达调控序列、连接在该表达序列上游的启动子和与该靶物质的生产有关且连接在该表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体；并改变该表达调控序列调控表达所依赖的细胞内氨基酸浓度，以调控靶基因的表达。
(13)根据(12)的方法，其中，通过所述细菌合成或降解氨基酸来改变细胞内氨基酸浓度。
根据本发明，提供了一种通过增加细胞内有义氨基酸的浓度而增加被调控基因表达的表达调控序列。根据本发明的表达调控方法，可以通过增加细胞内有义氨基酸的浓度而增加靶基因的表达。根据本发明的生产方法，可以通过增加细胞内有义氨基酸的浓度而增加靶物质的产量，从而有效地生产该靶物质。


图1是天然衰减子和本发明表达调控序列(人工抗衰减子)的结构和特性的说明图。
图2是天然衰减子和人工抗衰减子的详细结构。A和B分别表示所建议的延滞于“前导”肽的“有义”密码子(A)并终止于终止密码子(B)的核糖体所保护的mRNA部分的″下游″区域。C表示由大肠杆菌RNA聚合酶驱动的DNA转录的暂停位点。
图3是人工抗衰减子的基本结构图。带叉的圆标记表示与天然序列相比的核苷酸变化。BI∶BamHI，Bg∶BglII，NI∶NdeI，XI；XbaI，XI*；XbaI(dam-)。
图4是实施例1中的质粒构建图。
图5是来自质粒PDR540的Ptac启动子结构。用网状点标出用于PCR的″上游″(III)和″下游″(IV)引物序列。
图6是化学合成的an3∶an4(an4∶an5)片断结构和将该片断插到克隆载体的方法。
图7是天然大肠杆菌色氨酸操纵子的衰减子区域的结构。前导肽由大写的斜体字母表示。
图8显示了包括噬菌体T7基因10的核糖体结合位点(RBS)和色氨酸操纵子前导区之间融合物的中间体的结构。前导肽由大写的斜体字母表示。
具体实施例方式
<1>表达调控序列本发明的表达调控序列为依赖细胞内氨基酸(有义氨基酸)浓度来调控连接在表达调控序列下游的靶基因的表达的表达调控序列，其中，在含有包括表达调控序列、连接在表达调控序列上游的启动子和连接在表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体的细菌中，通过增加细胞内氨基酸浓度而降低在表达调控序列中的终止频率、起始于启动子的转录频率，以增加靶基因的表达。
有义氨基酸是不受限制的，只要其氨酰基tRNA可以合成且该合成的氨酰基tRNA可以用于翻译本发明表达调控序列所应用的细菌的蛋白质即可。优选的有义氨基酸为色氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、或缬氨酸。
靶基因的实例包括氯霉素乙酰转移酶基因(cat)，氨基酸操纵子，其蛋白质产物与氨基酸、核苷和核苷酸的生物合成有关的基因；和编码外源蛋白质产物的基因。
启动子的实例包括Ptac和任何其它受调控的和组成型原核启动子。
含有DNA构建体的细菌的实例包括埃希氏杆菌属、沙门氏菌属和沙雷氏菌属细菌。
可以根据常规的基因工程技术(例如，参见分子克隆，第二版，冷泉港出版社(1989)，日本专利申请公开2-207791等)进行表达调控序列和DNA构建体的构建，以及含有DNA构建体的细菌的制备。
还可以根据常规基因工程技术测定通过增加细胞内氨基酸浓度而降低在表达调控序列中的终止频率、起始于启动子的转录频率，以增加靶基因的表达。在细胞内有义氨基酸的浓度方面，如果已知细菌细胞内和细胞外浓度的关系，则不需要直接测定细胞内浓度并可以根据细胞外浓度如培养基中的浓度来估算细胞内浓度。也不需要直接测定表达调控序列中的终止频率及起始于启动子的转录的频率，测定靶基因表达的增加就够了。靶基因表达增加的测定可以通过测定靶基因的基因产物的数量，或当该基因产物具有活性时，测定该基因产物的活性来确定。
例如，在一个关于通过增加细胞内氨基酸浓度而降低在表达调控序列中的终止频率、起始于启动子的转录的频率，以增加靶基因的表达的实施方案中，当细胞内有义氨基酸的浓度不高于某一水平时，起始于启动子的转录终止于该表达调控序列，当细胞内有义氨基酸的浓度高于某一水平时，该转录延长，由此表达靶基因。
本发明的表达调控序列优选包含编码前导肽的区域，该前导肽含有义氨基酸和ρ-非依赖型终止子，其中在有义氨基酸饥饿的情况下，在翻译过程中当前导肽的翻译停在有义氨基酸的密码子(有义密码子)处时，在表达调控序列转录物上形成ρ-非依赖型终止子的碱基对结构，以增加在表达调控序列中的终止频率、以及转录频率。
前导肽的长度通常为14-32个残基。前导肽通常含有占总氨基酸残基的14-57％，优选30-45％的有义氨基酸残基。有义氨基酸的比例增大，则通过细胞内有义氨基酸浓度的调控变得精确。
ρ-非依赖型终止子具有可以形成碱基对结构(发夹)的序列，并在形成碱基对结构时终止转录。ρ-非依赖型终止子优选能够在埃希氏杆菌属、沙门氏菌或沙雷氏菌属细菌中发挥功能。
关于在翻译过程中，当前导肽的翻译停在有义密码子处时，在表达调控序列的转录物上形成ρ-非依赖型终止子的碱基对结构的方法，举例如下使表达调控序列包含不少于3的奇数个区段，其中每个区段可以与其相邻区段共同形成碱基对结构，并且在表达调控序列的转录物中，当除了末端区段以外的区段各自与其两个相邻区段之一形成碱基对结构时，该区段与其两个相邻区段的另一区段不形成碱基对结构；在上游末端的第一区段和与翻译前导肽的核糖体相互作用的区域重叠；与第一区段相邻的第二区段在前导肽翻译过程中和与第二区段相邻的第三区段形成碱基对结构；由下游末端区段和其相邻区段形成的碱基对结构是ρ-非依赖型终止子的碱基对结构。
在这个实施方案中，有必要使核糖体停在有义氨基酸的密码子处而阻断第一区段和第二区段之间的碱基对结构的形成。由于核糖体的质量的原因，核糖体覆盖从所停留的有义氨基酸密码子的上游约17bp至所述有义氨基酸密码子的下游约13bp的区域。与核糖体相互作用的区域是指受核糖体覆盖的区域。如果第一区段和与翻译前导肽的核糖体相互作用的区域重叠，则预计可通过使核糖体停在有义氨基酸的密码子处充分地阻断第一区段和第二区段之间的碱基对结构的形成。例如，如果有义氨基酸的密码子刚好出现在前导肽的终止密码子之前而从有义氨基酸密码子到第一区段起始点的距离在约13bp之内，则可以阻断第一区段和第二区段之间的碱基对结构的形成。
第一区段与前导肽上的有义氨基酸的密码子重叠。
在这个实施方案中，当由于有义氨基酸饥饿而使第一区段受核糖体阻断时，则形成第二和第三，第四和第五区段...之间的碱基对结构，而最终的碱基对结构用作终止转录的终止子。另一方面，如果提供充足的有义氨基酸且核糖体以足够的速率沿mRNA移动至终止密码子以进行转录过程，导致核糖体阻断至第二区段，则在第三和第四区段...之间形成碱基对结构以阻止终止子的形成。
在本发明的表达调控序列中，优选RNA聚合酶的暂停位点存在于编码前导肽C-末端区域的区域，或编码该前导肽的区域的下游，更优选在第二区段至第三区段的区域。当不存在暂停位位点时，如果与转录有关的翻译不够充分，则可能不会充分调控靶基因的表达。
在本发明的表达调控序列中，优选RNA聚合酶的暂停位点存在于编码前导肽C-末端区域的区域，或编码该前导肽的区域的下游，更优选在第二区段至第三区段的区域。当不存在暂停位点时，如果与转录有关的翻译不够充分，则可能不会充分调控靶基因的表达。
例如区段的数目为5。
各个区段的核苷酸序列可以是可与其相邻区段形成碱基对结构的区段。例如，各个区段的序列或其部分和相邻区段的序列或其部分可以构成反向重复序列。构成反向重复的序列可以不是连续的。换句话说，它可以在其序列内含有不形成碱基对的部分。在除了末端区段之外的区段中，在与其相邻区段之一构成反向重复序列的部分和与其相邻的另一区段构成反向重复序列的部分之间存在至少部分重叠就足够了。
表达调控序列的一个实例顺次包含5个从上游侧的区段an1-an5，其中区段an1和an2，以及编码前导肽的编码区来自大肠杆菌色氨酸操纵子的衰减子序列，区段an4和an5来自大肠杆菌的组氨酸操纵子的衰减子的序列，而区段an3来自色氨酸操纵子和组氨酸操纵子的衰减子序列的组合。
本文所用的术语“来自”是指具有与天然序列相同或类似的序列。获得序列的方法是不受限制的。可以从生物材料中分离或通过化学合成。类似的序列可以是在天然序列中取代、缺失或插入一种或多种核苷酸的序列并且该序列可以形成等同于在天然序列中形成的碱基对结构。
在优选的表达调控序列的实例中，优选前导肽被修饰为含有不少于2个色氨酸残基。这些色氨酸残基优选是连续的。
参照优选的表达调控序列的实例描述本发明。为了方便起见，下文中将表达调控序列称作人工抗衰减子。
人工抗衰减子的生物特性如图1所示。从图1可以看出，在有义氨基酸饥饿和核糖体停在相应的前导肽密码子的情况下，未受破坏的抗衰减子的发夹an2∶an3可以导致形成作为典型的ρ-非依赖型转录终止子一部分的发夹an4∶an5。另一方面，在有义氨基酸过剩的情况下，前导肽的充分翻译可以破坏人工抗衰减子中的发夹an2∶an3，然后形成可变发夹an3∶an4，该发夹阻止在远侧(下游)基因转录之前的终止，因为终止子发夹an4∶an5不能形成。
在两种已知的天然大肠杆菌色氨酸和组氨酸操纵子的衰减子基础上设计构建出人工抗衰减子。至于人工抗衰减子的前导肽，使用了天然色氨酸操纵子(trpL)的前导肽基因，并且在其结构部分具有两个调控色氨酸密码子。另一方面，与相应的天然组氨酸衰减子区域一样，在人工抗衰减子的3’-非翻译区域将形成可变mRNA的二级结构。
在图2中是作为基础的两个天然衰减子(色氨酸和组氨酸)的编码部分和3’-未翻译区域的核苷酸序列，以及相应的人工抗衰减子区域的序列。由图2可以看出，来自天然色氨酸衰减子和来自人工抗衰减子的直至″+85″(将前导肽编码部分的ATG中的A看作″+1″而得到该数字)的结构相一致。因此可以推测，在转录延长过程中，RNA聚合酶在″+66-+67″位置暂停；在色氨酸饥饿情况下，翻译前导肽的核糖体对发夹an1∶an2进行破坏；以及在细胞中色氨酸过剩的情况下，发夹an2∶an3的额外破坏可以刚好以与天然色氨酸衰减子相同的方式在人工抗衰减子的调控区发生。另一方面，抗衰减子的远侧部分明显不同于组氨酸衰减子的相应区域，这部分作为第二先祖。
已在可以形成终止子发夹an4∶an5的区域作了最小的改动。但是，如在天然组氨酸衰减子中一样，在人工抗衰减子上已可能形成可变发夹an3∶an4(该区域的二级结构与天然组氨酸衰减子的h4∶h5同源)，而该发夹的形成可以阻止人工抗衰减子上转录的终止。与天然组氨酸衰减子相比，在抗衰减子中不存在形成h3∶h4发夹的DNA片断，并且其生物学特性发生改变在有义氨基酸饥饿的情况下，形成ρ-非依赖型转录终止子而不是其细胞内浓度增加。证明人工抗衰减子特性的结果如下述。
如图3图示，已采用常规基因工程技术(包括PCR驱动的天然色氨酸衰减子片断的扩增和寡核苷酸化学合成等等)合成人工抗衰减子。已经获得两种不同类型的人工抗衰减子。天然trpL核糖体结合位点(RBS)用于人工抗衰减子一第一型抗衰减子-I的前导肽的翻译起始。更有效的噬菌体T7基因10的RBS已插入到第二抗衰减子-II前导肽基因5’-区域。已在载体质粒上高效启动子Ptac的下游和具有其自身RBS的cat基因结构的上游的克隆了这两种人工抗衰减子。编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的cat基因用作报道基因，其表达水平可以提供关于所创建的依赖细胞内有义氨基酸-色氨酸浓度的调控元件的功能效率信息。
而且，已在相同载体的基础上构建了多种调控重组质粒。第一种质粒带有天然色氨酸操纵子-trpL的衰减子。第二种带有-潜在的转录终止子-形成终止子发夹an4∶an5的抗衰减子的3’-末端DNA片断。第三种质粒带有较长的3’-末端DNA片断，它不能形成终止子发夹an4∶an5，因为在mRNA合成期间必须首先形成潜在的可变发夹an3∶an4。
文献中已知，大肠杆菌色氨酸操纵子中的天然trpL(不同于其它氨基酸操纵子的衰减子)是相当微弱的衰减子″生长培养基中存在或不存在色氨酸一般不影响色氨酸衰减子的通读；通读发生的10倍的变化仅发生在突变型细菌极度色氨酸饥饿时或细菌由含色氨酸培养基转移至不含色氨酸的培养基的瞬间发生″转录衰减″/在″大肠杆菌和沙门氏菌细胞和分子生物学″(第二版，F.C.Neidhardt-主编)，(1996)，第1263-1286页)。后者可能是因为在相应的前导肽结构部分仅存在与有义氨基酸串联密码子。由于人工抗衰减子前导肽的编码部分和天然trpL相同，必须使用特定的模型系统以测定该新系统的调控性能。已在带有所需重组质粒的trp细胞中测定了报道基因CAT的酶活性，再在色氨酸饥饿条件下生长，然后如果需要的话，在培养基中加入色氨酸。所得结果如表1所示。
表1.在带有含受试调控元件的重组质粒的菌株中进行的CAT活性测定

从表1可以看出，CAT活性水平并不依赖于将色氨酸加到带有不含trpL编码部分的质粒的细胞中。而且，可以根据关于编码″终止子″和″抗终止子″发夹的调控质粒的所得结果，评价依赖于可变mRNA二级结构形成过程的CAT活性所达到的水平上的理论差异。与在人工抗衰的3’-部分的ρ-非依赖型转录终止相比，在″抗终止子″形成的情况下可以实现1/20倍的转录增加。
可以推测，在利用具有天然色氨酸衰减子的质粒情况下，CAT活性的测定水平在色氨酸饥饿的情况下已提高了该水平，比将色氨酸加到正在生长的质粒-载体细菌后的水平要高。实际获得的CAT活性水平(17单位)不能与最高水平(60单位)相比。这是因为，首先，在细菌生长情况下的色氨酸饥饿不保证trpL通读转录的最大效率；其次，cat基因的5’-非翻译区位于其自身RBS的直接上游，在利用天然trpL和其它受试结构的情况下是不同的，因此CAT翻译起始效率也可以是不同的。
已获得关于带有人工抗衰减子的质粒的主要结果。从表1可以看出，对于两种质粒-载体细菌菌株而言，在将色氨酸加到正在生长的细菌中之后可以看到CAT活性水平升高。而且，利用高效的噬菌体T7基因10的RBS进行前导肽的翻译起始，获得接近于理论最大值的CAT的累积水平(51单位比60单位)。后者可以由以下事实解释需要改进前导肽的RBS，以在由相当强的启动子Ptac(比天然色氨酸操纵子的启动子更强)转录人工抗衰减子的情况下，完成实现可变mRNA二级结构形成的分子机理所需的全转录-翻译相结合(对于天然的原核氨基酸操纵子上的衰减转录而言是典型的)。
可以在所得结果的基础上作出以下结论1.可以利用可变mRNA二级结构形成过程来调控转录由于利用人工“组氨酸样”尾，表达水平可以实现多达20倍的差异。
2.所得的人工“抗衰减子”系统是功能活性的2.1.天然色氨酸前导肽编码部分的存在可以促进依赖细胞内色氨酸水平的mRNA二级结构折叠。
2.2.将Ptac-启动子用于与优化的前导肽翻译起始相结合的转录(利用噬菌体T7 S10 RBS代替天然trpL的RBS)的情况下，发现了过剩色氨酸的最佳“活化剂”效应。
3.可以推测该研制的系统可以用作创建实际可诱导调控元件的基础可以在增加抗衰减子区域的前导肽结构部分的有义(色氨酸)氨基酸密码子的数量后，在培养基中加入过量的色氨酸而将其诱导。
<2>用于调控靶基因表达的方法本发明的表达调控方法是一种调控靶基因表达的方法，它包括步骤
在培养基中培养含包括本发明的表达调控序列、连接在该表达调控序列上游的启动子和连接在该表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体的细菌；并改变该表达调控序列调控表达所依赖的细胞内氨基酸浓度，以调控靶基因的表达。
该DNA构建体和含有该DNA构建体的细菌可以如以上关于表达调控序列中所述。
培养条件是不受限制的，只要细菌可以存活。根据细菌适当选择条件。
改变细胞内有义氨基酸浓度的方法的例子为在培养细菌的培养基中改变有义氨基酸浓度的方法，改变细胞中有义氨基酸的合成或降解数量的方法。可以通过测定靶基因的基因产物数量确定靶基因表达改变，或当该基因产物具有活性时可以测定该基因产物的活性。
<3>生产靶物质的方法本发明的方法是一种生产靶物质的方法，它包括步骤培养能够生产该物质的细菌以产生该物质并收集该物质，其中该细菌含包括本发明的表达调控序列、连接在该表达序列上游的启动子和与该靶物质的生产有关且连接在该表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体；并改变该表达调控序列调控表达所依赖的细胞内氨基酸浓度以调控靶基因的表达。
靶物质的实例包括CAT和其它原核酶、外源蛋白质产物、氨基酸、核苷酸和核苷、维生素和其它生物活性物质。
能够生产靶物质的细菌的实例包括埃希氏杆菌属、沙门氏菌属和沙雷氏菌属的细菌。
培养条件不受限制，只要能够生产靶物质的细菌能够生产该靶物质。根据细菌适当选择条件。
培养通常在需氧条件下进行10-50小时。培养温度通常控制在28-37℃，pH通常在培养期间控制在6.6-7.4。可以将无机或有机、酸性或碱性物质以及氨气等等用于调节pH。
培养基可以是含有碳源、氮源、有机离子和可选择的其它有机组分的普通培养基。
作为碳源，可以使用糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖或淀粉水解产物；醇如甘油或山梨醇；或有机酸如富马酸、柠檬酸或琥珀酸。
作为氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵；有机氮如大豆水解产物；氨气；或氨水。
可允许添加的所需的物质如维生素B1或含有适量的有机微量营养物的酵母提取物。与以上不同的是，如果需要的话，可以加入少量的磷酸、硫酸镁、铁离子、镁离子等等。
通常可以组合离子交换树脂法、沉淀法和其它已知方法，从培养物如细胞和培养基中收集靶物质。
DNA构建体可以如以上关于表达调控序列所述，只要将与靶物质的生产有关的基因用作靶基因即可。与靶物质生物有关的靶基因的实例包括用于靶物质的生物合成基因、用于产生能量和相关的物质的基因如用于靶物质生物合成的中间体、用于此目的的调控基因等等。其具体的实例包括L-色氨酸生物合成的基因、L-丝氨酸生物合成基因(特别用于L-色氨酸生物合成)、pntAB基因、H+-腺苷三磷酸酶(ATPase)基因。
具体而言，如果在产L-色氨酸细菌中，将L-色氨酸用作有义氨基酸，而作为靶基因的L-丝氨酸生物合成基因连接于本发明表达调控序列的下游，则当细胞内L-色氨酸的累积量增加时，L-丝氨酸生物合成基因的表达增加。细胞内L-色氨酸累积量增加的时间也是作为L-色氨酸生物合成的底物之一的L-丝氨酸减少的时间。因此，L-丝氨酸生物合成基因的表达仅在L-丝氨酸减少时增加。另一方面，L-丝氨酸生物合成基因不可能总是在生产L-色氨酸的细菌中高度表达，因为高浓度的L-丝氨酸对细胞生长有害。因此认识到本发明的表达调控序列用于在L-色氨酸-生产细菌中提高L-丝氨酸生物合成基因的表达时非常有用。
能够生产靶物质并含有DNA构建体的细菌可以通过能够生产靶物质的细菌包含DNA构建体或赋予含有DNA构建体的细菌生产靶物质的能力而得到。可以根据常规基因工程技术使细菌包含DNA构建体。可以根据已知方法赋予生产靶物质的能力。例如，当靶物质为CAT时，可以使用引入编码氯霉素乙酰转移酶DNA的方法。
改变细胞内有义氨基酸浓度的方法的例子有改变培养细菌的培养基中有义氨基酸浓度的方法，改变细胞内有义氨基酸的合成和降解数量的方法。优选改变细胞内有义氨基酸的合成和降解数量的方法，因为靶物质的生产可以与用于靶物质生产的中间体等的生产结合。靶基因表达改变的确定可以通过测定靶基因的基因产物数量，或当该基因产物具有活性时，测定该基因产物的活性。
实施例实施例1.带有天然衰减子和人工抗衰减子及其片断的重组质粒的构建1.载体质粒pML-Ptac-ter_thrL-cat的构建用以下方式构建带有ColE1样复制子、作为选择性标记的ApR-基因、tac启动子(Ptac)(Russel D.R.，Bennett G.，基因20(1982)231)、合成的大肠杆菌苏氨酸操纵子(ter_thrL)前导肽的ρ-非依赖型转录终止子和Ptac下游的cat-基因结构部分的质粒载体pML-Ptac-ter_thrL-cat。将从Ptac开始转录的基因cat用作进一步实验的报道基因。
1.1.pML-pp-载体的构建两种质粒用作构建pML-pp-载体的起始质粒。第一个质粒是前述的质粒pML24(Trukhan等人Biotechnologiya(俄文)4，No.3(1988)325-334)。第二个质粒是可商购得到的(MBI″Fermentas″，立陶宛)载体pUC57(GenBank/EMBL入藏号Y14837)。在图4中显示了基于常规基因工程方法(Sambrook等人，分子克隆实验室手册″.(1989)第二版，冷泉港实验室出版社)的pML-pp-载体的构建图。
1.2.在质粒pML-pp-载体中插入化学合成的ter_thrL由具有以下结构的两种化学合成的寡核苷酸的退火而构建了合成的大肠杆菌苏氨酸操纵子前导肽的ρ-非依赖型转录终止子I-5′-ctagaaagcttaacacagaaaaaagcccgcacctgacagtgcgggctttttttttcgaccactgcagg→3′(SEQ ID NO4)，和II-5′-gatccctgcagtggtcgaaaaaaaaagcccgcactgtcaggtgcgggcttttttctgtgttaagcttt→3′(SEQ ID NO5)。
在合成的寡核苷酸退火之后，构建了双链DNA片断，该双链DNA片断带有典型的经XbaI-和BamHI处理DNA之后获得的单链“粘性”末端。
根据常规方法，采用T4多核苷酸激酶将该片断磷酸化，并克隆到由XbaI和BamHI切割的质粒pML-pp-载体上。由插入片断的限制酶切分析和DNA测序建立所需质粒与所测得的质粒结构之间的联系。
1.3.Ptac的分子克隆将PCR驱动的DNA扩增用于分子克隆杂合启动子(Ptac)。为此目的，化学合成了两种寡核苷酸。
III-5′-gcttaggtaccctccccatccccctgttgac-3′(SEQ ID NO6)，和IV-5′-ctgtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3′(SEQ ID NO7)；将可商购得到的带有Ptac-启动子的质粒pDR54O(Pharmacia，瑞典)用作PCR模板。
如图5所示，这些寡核苷酸带有启动子的上游(III)和下游(IV)序列。而且它们带有可被多个限制性内切核酸酶(KpnI和XbaI)(见图5)识别的序列，以利于以下的分子克隆。用KpnI和XbaI处理扩增的DNA片断，然后在已事先由相同的限制酶切割(参见1.2项)的载体质粒上进行克隆。所选择的重组质粒命名为pML-Ptac→ter_thrL→cat，它用作进一步实验的载体。
2.用天然和人工转录调控元件构建质粒上述的质粒pML-Ptac→ter_thrL→cat用作创建所有有用质粒的载体。而且已化学合成了一组寡核苷酸olig15′-cagagctctagaagttcacgtaaaaagggtatcgac-3I(SEQ ID NO8)；olig25′-gtatcgcatatgaaagcaattttcgtactgaaagg-3′(SEQ ID NO9)；olig35′-gtctgagatctagtatctgattgctttacgcatggtg-3′(SEQ ID NO10)；olig45′-atcataggatcctaattttgttcaaaaaaaagcccgctcatt-3′(SEQ ID NO11)；oligs5′-cgactgtctagaacggtacagaaagcccccggcagat-3′(SEQ ID NO12)；cat3′5′-agctcaccgtctttcattgccatacgg-3′(SEQ ID NO13)；cr5′5′-acatgcggtaccgatcccgcgaaattaatacg-3′(SEQ ID NO14)。
如下述，这些寡核苷酸用作PCR驱动的DNA扩增的引物。另一组寡核苷酸olig65′-cagagctctagaagatctgcccgactgcgtacaacggtacagaaagcccccggcagatcacctgc-3′(SEQID NO15)；olig75-cgggggcttttttattgcgcggttgataacgggatccagcgta-3(SEQ ID NO16)；olig85′-tacgctggatcccgttatcaaccgcgcaataaaaaagcccccggcaggtgatctgccgggggctt-3′(SEQID NO17)；
olig95′-tctgtaccgttgtacgcagtcgggcagatcttctagagctctg-3′(SEQ ID NO18)，直接用于该新的人工抗衰减子的3′-末端部分的构建过程(见以下)。
2.1.质粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat的构建在pML-Ptac→ter_thrL→cat的基础上，插入由化学合成的寡核苷酸(olig6，olig7，olig8和olig9)创建的双链DNA片断，代替启动子Ptac和cat-基因结构部分之间的ter_thrL(见图6)，而构建了该质粒。为此目的，根据建议的方法，采用T4多核苷酸激酶(″MBI Fermentas″，立陶宛)将最初650ng的olig7和650ng的olig9磷酸化。两种混合物含有在30μl″y+/Tango″缓冲液(″MBI Fermentas″，立陶宛)中的430ng的olig6与650ng的磷酸化olig9，和430ng的olig8与650ng的磷酸化olig7，100℃下将其加热5分钟，然后在75℃下退火5分钟。随后将其混合在一起，在60℃下加热5分钟并在20℃下退火10分钟。然后加入5单位的T4 DNA连接酶(UMBI Fermentas″，立陶宛)和0.5μl的100mM ATP，并在22℃下保温4小时，并在+4℃下保温过夜。68℃下将混合物加热10分钟并将其上样至凝胶-电泳。采用低熔点琼脂糖技术分离明显可见的DNA带。依照制造商建议，采用XbaI(＂MBI Fermentas″，立陶宛)处理所得的双链DNA片断(长108 bp)。将360ng的该片断连接至50ng由大肠杆菌(dam-)链制备并由XbaI切割的载体pML-Ptac→ter_thrL→cat上。在载体质粒pML-Ptac→ter_thrL→cat和在其基础上得到的重组质粒必须用限制酶XbaI切割的所有情况下，必须由大肠杆菌(dam-)链提供质粒DNA，因为这些质粒的XbaI-限制位点与GATC-序列重叠，这是Dam驱动的DNA修饰的目标，因而XbaI不能切割从大肠杆菌(dam+)菌株中纯化的质粒DNA。采用3个单位的T4 DNA连接酶在+4℃下连接过夜。根据常规方案，用BamHI(″MBI Fermentas″，立陶宛)处理所得混合物。在最后步骤，用60μl体积的T4 DNA连接酶缓冲液稀释DNA混合物，并于+4℃下用5个单位的T4 DNA连接酶处理过夜。将所得混合物转化至菌株HB101并筛选菌落以获得所需构建体。因此，得到质粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat，并通过限制酶切分析和根据常规Sanger法进行DNA测序证明了它的结构。我们推测，所得的质粒带有被转录的DNA片断，可以形成抗终止子发夹an3∶an4(终止子发夹an4∶an5不能形成，因为an3∶an4在先合成)。
2.2.质粒pML-Ptac-an4∶an5-cat的构建上述的质粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat作为构建下一重组DNA的起始质粒它被用作为编码最后的，an4∶an5，新调控区域发夹的片断而进行PCR驱动的DNA扩增的模板。在该PCR中，寡核苷酸olig5和cat3′用作引物(见图6)。这些核苷酸的第一部分相应于较早克隆的编码发夹an4∶an5的片断的起始部分，但它还含有5’-末端附近的由XbaI识别的核苷酸(见图6)。第二个寡核苷酸，cat3′相应于cat-基因的编码部分的片断(位置+219-+245，如果来自CAT的ATG起始密码子的A编号为″+1″的话)(见图6)。用XbaI处理由PCR得到的双链DNA片断，将其与由相同的限制酶切割的载体质粒pML-Ptac→ter_thrL→cat连接，然后进行BamHI处理并用T4 DNA连接酶将产物环化。由此得到名为pML-Ptac-an4∶an5-cat的所需质粒。
2.3.质粒pML-Ptac-trpL-cat的构建为了在Ptac-启动子的转录调控下构建带有天然大肠杆菌色氨酸操纵子前导肽基因(基因trpL)的质粒，将已测定了其全基因组序列的来自菌株大肠杆菌MG1655的染色体DNA用作PCR的模板。相应于trpL-基因的5′和3′-末端部分的寡核苷酸olig1和olig4(见图7)用作DNA扩增的引物。从图7中可以看出，这些引物还带有侧翼XbaI和BamHI(相应地在olig1和olig4上)识别位点以便于以下的操作。用XbaI和BamHI处理长175bp的双链DNA片断，然后将其克隆到由相同的限制酶切割的载体质粒pML-Ptac→ter_thrL→cat上。所得的质粒命名为pML-Ptac-trpL-cat，该载体质粒带有天然trpL-基因它替代了载体上的ter_thrL。
2.4.质粒pML-Ptac-anti_att-I-cat的构建将上述的质粒pML-Ptac-trpL-cat用作创建下一重组DNA的模板。在该方法中，将上述的寡核苷酸，olig1以及olig3用作引物。olig3相应于天然trpL-基因的中央部位，并在其5′-末端还带有BglII-识别位点(见图7)。在PCR驱动的DNA扩增之后，用XbaI处理所得的长133bp的双链片断，并将其与由相同的限制酶切割的载体质粒pMLPtac-an3∶an4(an4∶an5)-cat连接，然后由BglII水解产物并用T4 DNA连接酶环化产物。将所得的在Ptac-启动子和cat-基因结构部分之间带有人工抗衰减子的质粒命名为pML-Ptac-anti_att-I-cat。
2.5 质粒pML-Ptac-anti_att-II-cat的构建用以下方式构建带有人工抗衰减子的重组质粒，该人工抗衰减子含有位于天然大肠杆菌色氨酸操纵子前导肽编码部分上游的噬菌体T7基因10的高效核糖体结合位点(RBS)。最初，由PCR得到双链DNA片断，该PCR使用olig2(见图7)和olig3作为引物而将质粒pML-Ptac-trpL-cat的DNA作为模板。NdeI的限制性位点重建于前导肽的ATG-起始密码子的上游(ATG-密码子的核苷酸是NdeI所识别的序列CATATG的一部分)。将所得的由NdeI切割的DNA片断与可商购得到的(UNovagenfl，USA)用NdeI处理的质粒载体pET-22b(+)连接。质粒pET-22b(+)在XbaI和NdeI限制位点之间带有T7基因的RBS。连接反应的产物用作下一步构建的PCR模板。新的寡核苷酸cr5′(见图8)和前面所用的olig3用作该PCR的引物。用XbaI和BglII处理所得的长210bp的双链DNA片断，并在质粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat上根据构建pML-Ptac-anti_att-I-cat所用的方案进行克隆。因此，得到新的名为pML-Ptac-anti_att-II-cat的质粒，该质粒带有人工抗衰减子和处在色氨酸前导肽基因5′-未翻译区的噬菌体T7基因10的RBS。通过限制酶切分析和常规Sanger法测序证明了所有带有人工转录调控元件的质粒结构。
实施例2.检测含具有天然trpL、人工抗衰减子及其片断的重组质粒的菌株中Cat蛋白质累积水平。
根据常规实施方案，将前述的质粒(见实施例1)pML-Ptac-an4∶an5-cat、pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat、pML-Ptac-trpL-cat、pML-Ptac-anti_att-I-cat、pML-Ptac-anti_att-II-cat引入菌株大肠杆菌TG1(supE、hsd、thi、Δ(lac-proAB)、F′(traD36、proAB+、laclQ、lacZΔM15])和大肠杆菌B7248(trpB-Tnl0，StrR)并在加入氨苄青霉素(100μg/ml)的培养基中选择质粒载体细胞(Sambrook等人，“分子克隆实验室手册”.(1989)第二版，冷泉港实验室出版社)。所得的细胞培养物在37℃和良好的通风条件下，在含有液体培养基的试管中生长。关于培养基，加入氨苄青霉素的L-肉汤用于TG1-驱动的质粒-载体菌株，而含有氨苄青霉素(100μg/ml)、硫胺素(5μg/ml)和色氨酸(10μg/ml)的极限M9-培养基用于在大肠杆菌B7248的基础上构建的菌株。用相同的培养基将过夜的B7248-驱动的培养物稀释50倍，并继续培养2-4小时直至600nm处的光密度为1(OD600＝1)。将各培养基分成两部分并将色氨酸(200μg/ml)加到这两部分之一。继续培养1小时，然后离心收集细胞，用生理溶液洗涤，并重悬在1/10初始体积磷酸钙缓冲液中。然后超声处理细胞，4℃下离心收集碎片。根据制造商所述的方案，采Bio-Rad Coumassie R250试剂测定上清液中的蛋白质浓度。根据常规方法测定氯霉素乙酰转移酶活性(Schottel JL，Sninsky JJ，Cohen SN″翻译调控区的变化对细菌基因表达的影响由lac启动子转录的cat基因用作模式系统″基因，28(1984)177-193)。在这些实验中，5，5′-二硫-双(2-硝基苯甲酸)-Ellman试剂)(″Sigma″)用作具体的试剂。所得结果如正文的表1所示。
进行SDS-PAGE (0.1％SDS-12.5％ PAAG电泳)以目测检验大肠杆菌TG1驱动的质粒-载体菌株累积的CAT。各菌株的生长如上述。将各培养物分成两部分。往这些培养物上添加IPTG(直至0.4mM的最终浓度)并培养2小时。然后收集细胞，将其重悬于SDS-加样缓冲液(60mM Tris-HCl pH6.8/2.3％ SDS/10％甘油/5％β-巯基乙醇)，并煮沸15分钟。将作为试样的10-20μl所得悬浮液加到PAAG上，并根据Laemmli所述的方法进行电泳(Laemmli V.K.//″在装配噬菌体T4头部期间结构蛋白质的切割″，自然227(1970)680-685)。用考马斯蓝给凝胶染色以检测分离的蛋白质。相应的所得凝胶的带型如图3所示。
序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>表达调控序列<130><150>RU 2001104817<151>2001-02-22<160>18<210>1<211>118<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>1atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt cctgaaacgg gcagtgtatt 60caccatgcgt aaagcaatca gatacccagc ccgcctaatg agcgggcttt tttttgaa118<210>2<211>153<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>2atgacacgcg ttcaatttaa acaccaccat catcaccatc atcctgacta gtctttcagg 60cgatgtgtgc tggaagacat tcagatcttc cagtggtgca tgaacgcatg agaaagcccc 120cggaagatca ccttccgggg gcttttttat tgc 153<210>3<211>169<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰减子<400>3atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt cctgaaacgg gcagtgtatt 60caccatgcgt aaagcaatca gatactagat ctgcccgact gcgtacaacg gtacagaaag120cccccggcag atcacctgcc gggggctttt ttattggcgg ttgataacg 169<210>4<211>69<212>DNA<213>大肠杆菌(Eshcerichia coli)<400>4ctagaaagct taacacagaa aaaagcccgc acctgacagt gcgggctttt tttttcgacc 60actgcagga 69<210>5<211>69<212>DNA<213>大肠杆菌(Eshcerichia coli)<400>5gatccctgca gtggtcgaaa aaaaaagccc gcactgtcag gtgcgggctt ttttctgtgt60taagcttta69<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gcttaggtac cctccccatc cccctgttga ca 32<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ctgtttctag atcctgtgtg aaattgttat ccgca 35<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8cagagctcta gaagttcacg taaaaagggt atcgac 36<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gtatcgcata tgaaagcaat tttcgtactg aaagg35<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10gtctgagatc tagtatctga ttgctttacg catggtg 37<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11atcataggat cctaattttg ttcaaaaaaa agcccgctca tt42<210>12<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12cgactgtcta gaacggtaca gaaagccccc ggcagat47<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13agctcaccgt ctttcattgc catacgg 27<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14acatgcggta ccgatcccgc gaaattaata cg 32<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰减子片断<400>15cagagctcta gaagatctgc ccgactgcgt acaacggtac agaaagcccc cggcagatca 60cctgc 65<210>16<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰减子片断<400>16cgggggcttt tttattgcgc ggttgataac gggatccagc gta 43<210>17<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰减子片断<400>17tacgctggat cccgttatca accgcgcaat aaaaaagccc ccggcaggtg atctgccggg 60ggctt 65<210>18<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰减子片断<400>18tctgtaccgt tgtacgcagt cgggcagatc ttctagagct ctg 4权利要求
1.一种依赖细胞内氨基酸浓度来调控连接于表达调控序列下游的靶基因的表达的表达调控序列，其中，在含包括表达调控序列、连接在表达调控序列上游的启动子和连接在表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体的细菌中，通过增加细胞内氨基酸浓度而降低在表达调控序列中的终止频率、起始于启动子的转录频率，以增加靶基因的表达。
2.根据权利要求1的表达调控序列，它包括编码含有所述氨基酸和ρ-非依赖型终止子的前导肽的区域，其中在所述氨基酸饥饿的情况下，在翻译过程中当前导肽的翻译停在该氨基酸的密码子处时，在表达调控序列转录物上形成ρ-非依赖型终止子的碱基对结构，以增加在表达调控序列中的终止频率以及转录频率。
3.根据权利要求2的表达调控序列，它包括不少于3的奇数个区段，其中每个区段可以与其相邻区段形成碱基对结构，并且在表达调控序列的转录物中，当除了末端区段以外的区段各自与其两个相邻区段之一形成碱基对结构时，该区段与其两个相邻区段的另一区段不形成碱基对结构；在上游末端的第一区段和与翻译前导肽的核糖体相互作用的区域重叠；在前导肽翻译过程中，与第一区段相邻的第二区段和与第二区段相邻的第三区段形成碱基对结构；由下游末端区段和其相邻区段形成的碱基对结构是ρ-非依赖型终止子的碱基对结构。
4.根据权利要求3的表达调控序列，其中，第一区段与前导肽的氨基酸密码子重叠。
5.根据权利要求3或4的表达调控序列，其中的区段数为5。
6.根据权利要求3-5中任一项的表达调控序列，其中各区段的序列或其部分和相邻区段的序列或其部分构成反向重复序列。
7.根据权利要求2-6中任一项的表达调控序列，其中，ρ-非依赖型终止子能够在埃希氏杆菌属、沙门氏菌属或沙雷氏菌属细菌中发挥功能。
8.根据权利要求7的表达调控序列，其中，ρ-非依赖型终止子能够在埃希氏杆菌属细菌中发挥功能。
9.根据权利要求7或8的表达调控序列，它顺次包括来自上游侧的5段区段an1-an5，其中区段an1和an2，以及前导肽的编码区来自大肠杆菌的色氨酸操纵子的衰减子序列，区段an4和an5来自大肠杆菌的组氨酸操纵子的衰减子序列，而区段an3来自色氨酸操纵子和组氨酸操纵子的衰减子序列的组合。
10.根据权利要求9的表达调控序列，该前导肽被修饰成含有不少于2个色氨酸残基。
11.一种调控靶基因表达的方法，包括下述步骤在培养基中培养含包括权利要求1-10的任一项所定义的表达调控序列、连接在该表达调控序列上游的启动子和连接在该表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体的细菌；和改变该表达调控序列调控表达所依赖的细胞内氨基酸浓度，以调控靶基因的表达。
12.一种生产靶物质的方法，包括步骤培养能够生产该物质的细菌以产生该物质并收集该物质，其中该细菌含包括权利要求1-10中的任一项所定义的表达调控序列、连接在该表达序列上游的启动子和与该靶物质的生产有关且连接在该表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体；并改变该表达调控序列调控表达所依赖的细胞内氨基酸浓度，以调控靶基因的表达。
13.根据权利要求12的方法，其中，通过细菌氨基酸的合成或降解来改变细胞内氨基酸浓度。
全文摘要
一种依赖细胞内氨基酸浓度来调控连接于表达调控序列下游的靶基因的表达的表达调控序列,其中,在含包括表达调控序列、连接在表达调控序列上游的启动子和连接在表达调控序列下游的靶基因的DNA构建体的细菌中,通过增加细胞内氨基酸浓度而降低在表达调控序列中的终止频率、起始于启动子的转录的频率,以增加靶基因的表达。
文档编号C12N15/00GK1375556SQ0211855
公开日2002年10月23日 申请日期2002年2月22日 优先权日2001年2月22日
发明者S·V·马什科, D·V·兹门科夫 申请人:味之素株式会社