专利名称：无花基因与纯营养生长植物株系建立及其建立的技术系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可导致种子植物丧失花器官发生与形成能力的基因—无花基因、基因表达盒及其植物表达载体；以此基因所建立的纯营养生长植物株系，以及无花基因与纯营养植物株系建立的技术系统。
本发明所属技术领域为植物基因工程；应用技术领域为植物种质创新、林业及绿化系统建立、环境保护、经济植物栽培。
对于人工栽培的某些种子植物来讲，其生殖生长并非完全必要。这是因为1.大量植物并不是靠有性繁殖，而是靠扦插、嫁接和组织培养等技术繁殖。原因是无性繁殖可以保持原有植株的优良特性，生产效率高；2.其生殖生长要消耗大量的营养物质和能量，减缓植物的生长速度；3.某些植物的花(粉)、果(毛)、种子(毛)，为过敏原、污染源，污染环境、危及人们的身体健康、特别是对于环境绿化植物尤为重要。
目前，已知创造植物新性状的技术途径有两条1.物理、化学诱变；2.基因工程技术。物理、化学诱变可以造成遗传物质染色体的缺失、易位、附加等或基因的突变，导致某些基因正常功能的丧失，引起某些性状变异。由于控制花发生与形成的基因多之又多、且有多条代偿途径，因此物理、化学诱变很难获得其他任何形状都正常，唯独无花的突变体。植物任何性状变异都可以在其有性后代中保存或积累，唯没有性器官的变异不能遗传、积累，因其不能产生有性后代(周业恒等，1993；鲍时来等，1999)。以基因工程技术可以创造出没有花粉(雄性不育)(Mariani等，1991；Mariani等，1992)或其他花器官发育不全、发育不成熟的新性状(Lucia Colombo等，1997；Giuseppe Leonardo Rotino等，1997)，但迄今未见到无花的纯营养生长植物株系的报道或专利。
本发明以现代基因重组技术建立的种子植物无花基因，及其在此基础上建立的纯营养生长植物，可以从根本上解决种子植物的花(粉)、果(毛)、种子(毛)问题。建立的纯营养生长植物除不会开花之外，还具有速生而优质的新特征。
阻止花的发生与形成可以在分子水平上进行，也可以在细胞水平上进行。在分子水平上阻止花的发育，理论上行得通，但实际上难以实现。因为控制花发育的基因有很多，而且又有多条代偿途径，不可能同时对多种基因进行抑制；抑制了这条途径，还有一条替代途径。本项发明是利用一种花发育早期组织细胞特异的细胞致死因子基因在茎端营养分生组织细胞中建立一条所谓的“趋花清除”机制，即该组织中一旦出现趋向于成花方向的细胞，就会被立即清除；出现一个清除一个；出现多少清除多少，一个不留。这种阻止方式不是一种基因或阻止另一种基因，而是一种基因阻止所有具有“趋花”特性的组织或细胞，干净、彻底、完全，没有后患。
无花基因的建立依赖两项关键技术的发展1.高度特异性抑制或摧毁靶标细胞、组织--花发育早期阶段的细胞、组织--花序分生组织、花分生组织、花原基，而不伤及其他细胞和组织；2)抑制或摧毁靶标细胞、组织的方式、手段或技术类型。目前这两项关键技术都取了突破。
近几十年来，在研究植物从营养生长如何过渡到生殖生长、营养分生组织如何转换为花序分生组织的过程中已积累了许多丰富资料，揭示了花器官发生与形成的细胞与分子生物学机制(刘良式等，1998)。
已知，植物体处于地面上的组织器官，包括叶、花、芽等均从营养茎端分生组织发育而来。当植株发育到性成熟并接受到开花信号之后，便启动开花程序，即一系列与花发育相关的基因开始在部分营养茎端分生组织细胞中程序性表达，并使这些组织细胞发育、特化为花序分生组织，再由花序分生组织分化为花分生组织，继而发育成花原基、花器官，最终形成花(刘良式等，1998)。
这些基因是在这些特化或将被特化的细胞中主动自行表达的，并控制这些细胞的发育方向，具有严格时间、空间特异性，即组织、器官与发育阶段、发育时期特异性(见附图5)。
已发现的与花序分生组织发育相关的基因有TERMINAL FLOWER 1(TFL1)(Alvarez等，1992)等。
与花分生组织发育相关的基因有APETALAI(AP1)(Alejandra等，1992)，LEAFY(LFY)(Huala和Sussex，1992)，Nicotiana FLO/LFY(Nfl)(Kelley等，1995)，FLORICAULA(FLO)(Coen等，1990)，SQUAMOS A(SQU A)(Huijser等，1992；Fishleigh等，1987)等。
与花原基、花器官分化相关的基因(A、B、C类基因)有AP1，APETALA3(AP3)(Bowman等，1989；Jack等，1994)，PISTILLATA(PI)(Hauhgn和Somerville，1988；Bradley等，1994)，DEFICIENS(DEF A)(Sommer等，1990；Pollock和Treisman，1990；Wynme和Treisman，1992)，GLOBSA(GLO)(Trobner等，1992)，Califlower(CAL)(Bowman等，1993)，AGAMOUS(AG)(Yanofsky等，1990；Pruitt等，1987；Bowman等，1988，1989，1991)，PLENA(PLE)(Bradley等，1993)等。
介于花分生组织类别基因与花器官类别基因之间的居间调节基因有FIMBRIATA(FIM)(Simon等，1994)，Unusal floral organs(UFO)(Wilkinson和Haughn，1994)等。
这些与花发育相关的基因表达的组织器官与发育阶段、发育时期特异性主要是由其调控这些基因的启动子所决定的，换句话讲，这些基因的启动子均具有各自基因表达的组织器官与发育阶段、发育时期特异性。
这些基因及其启动子的功能、表达时空特异性、结构与序列的发现为特异性抑制或摧毁靶标细胞、组织—花序分生组织、花分生组织、花原基，阻止花的发育提供了可能。
已发现多种基因，其表达物能够抑制或破坏正常的细胞信号传递、能量或物质代谢，导致细胞的生长、分裂、分化受阻，甚至死亡，如DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，其中细胞致死因子则是最有效、彻底的一个手段。来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶(RNase)基因Barnase(Hartley等，1988)，是一种理想的细胞致死因子基因。众所周知，生物的中心法则为DNA-RNA-Protein。这一基因在细胞中特异表达，产生的RNase，可以有效降解、破坏细胞中的RNA，导致细胞的自杀、死亡。此外，来源于拟南芥三种RNase基因RNS1、RNS2、RNS3(Bariola等，1994；Taylor等，1993)，也都是理想的细胞致死因子基因。这种细胞致死因子基因为摧毁靶标细胞、组织—花序分生组织、花分生组织、花原基，提供了武器或手段。也使利用基因工程技术构建无花基因得以实现。
以花发育早期阶段细胞、组织特异启动子(TFL1、AP1、LFY、NFL、CAL、AGL等)、细胞抑制或致死因子基因编码序列及终止子融合成的构建物即为无花基因。无花基因在植物中有效表达，可以有效抑制或催毁花发育早期阶段细胞或组织，从源头阻止了花器官的发生与形成，从而导致植株无花。
本发明提供一种可以导致种子植物丧失生殖器官发生与形成能力的基因-无花基因、以此基因建立的纯营养植物株系，以及建立这一基因、植物株系的技术系统。其发明内容包括1.植物无花基因；2.纯营养生长植物株系；3.植物无花基因与纯营养生长植物株系建立的技术系统。1.植物无花基因1.1关于无花基因的定义无花基因实质上是花发育早期阶段细胞或组织特异表达基因启动子控制的细胞致死因子基因。在此，花发育早期阶段细胞、组织、器官，系指花序分生组织，花分生组织，花原基。这种基因在种子植物中特异表达，可以在花发育早期阶段阻止花的发生与形成，导致其植株无花，以其作用将其称为“无花基因”。应该说明，无花基因并非正常概念上的基因，而是一种自然界并不存在，完全由人工重组构建的一种完整的“无花基因”的基因表达盒。
1.2关于无花基因的组成、结构与序列无花基因是由花发育早期细胞、组织、器官特异表达基因的启动子、细胞致死因子编码基因与终止子三部分构成。
花发育早期细胞、组织、器官特异表达基因的启动子包括并不限于已发现的花序分生组织、花分生组织、花原基特异启动子或居间调节基因启动子及其衍生序列。本发明优选的两个启动子为TFL 1(GenBankAB005235)、AP1(GenBankAC008262)基因的启动子。
细胞抑制因子基因包括并不限于已发现的细胞抑制因子基因。本发明优选的细胞致死因子基因为Barnase(GenBankX12871)基因的编码序列。
其终止子包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列，和一个mRNA切割后加工序列，一个类似多聚腺苷酸化信号序列及多聚腺苷酸化序列。这些调节和控制序列可以是质粒载体中天然固有的，或在其被转化到适当的克隆宿主之后，在dNTP及适当的DNA合成酶和DNA连接酶的存在与作用下，利用各种已知的技术加入的。在本发明的实施方案中，我们使用了来源于农杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因的Nos-Ter(GenBankAF485783)终止子。
为增加无花基因的表达强度，我们在启动子与编码基因序列之间添加了衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的Ω翻译增强序列。
根据本发明的一个优选实施方案，无花基因采用了拟南芥TFL 1基因启动子、BARNASE基因的编码序列以及NOS-Ter终止子，其结构如附
图1所示，其序列如SEQ ID NO1。(见附软盘)另一优选实施方案为拟南芥AP1基因启动子、BARNASE基因的编码序列以及NOS-Ter终止子，其结构如附图2所示，其序列如SEQ ID NO2。(见附软盘)1.3关于无花基因的功能无花基因的主要功能无花基因在植物中特异表达，可以有效摧毁花序、花分生组织或花原基，阻止花器官的发生与形成，导致植株无花，从而建立起无生殖器官的纯营养生长植物株系。
1.4关于无花基因适用的植物种类及范围适用于所有种子植物，其中主要包括因其无花、无果、无种子而导致的直接或间接产生生态、环境、社会与经济效益的植物。
1.4.1无花、无果(毛)、无种(毛)污染的环境绿化用植物，如悬铃木、杨树、柳树等1.4.2用材树种，如杨树、泡桐等。
1.4.3生态系统用植物，如杨树、柳树、泡桐、紫穗槐、沙棘等1.4.4叶用植物，如烟草、桑树、香椿等。
1.4.5根用植物，如薯类、藕、山药、地黄、百合等。
1.4.6韧皮纤维用植物，如麻类作物等。
1.4.7次生代谢物用植物，如橡胶、漆、中药材等。2.无花基因建立的技术系统无花基因的建立包括花发育早期组织器官特异启动子、细胞抑制因子编码序列、基因终止序列的克隆。无花基因的启动子、终止子可以采用PCR或其它技术合成。无花基因的编码序列，来源于原核生物的可以采用PCR或其它技术合成；来源于真核生物的可以采用RT-PCR或其它技术合成。
可使用本领域已知的方法将合成的无花基因的片段连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Gene 103 1985)，pUC118、pUC119，以及衍生于pUC18的专门用于克隆PCR合成片段的pMD-18T载体。尤其是植物表达载体pBI101、pBI121、pBI131系统(Jefferson，et al.，EMBOJ.16 3901，1987)，pCAMBIA1301、pCAMBIA3301(CAMBIA公司生产)等等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述本发明无花基因的克隆载体是pMD-18T及表达载体pCAMBIA1301、pCAMBIA3301。
2.1关于无花基因组成元件的来源及克隆2.1.1启动子种子植物花发育早期特异启动子，可以是天然的，也可以是人工合成的，或者为人工修饰改造的。根据本发明的一个优选实施方案，所说的TFL1、AP1启动子序列是以PCR方法从拟南芥基因组中克隆、合成的。然后将克隆片段插入到pMD-18T载体中测序，以确认PCR序列的可靠性。
实施例一 TFL1基因启动子的克隆TFL1启动子设计长度为翻译起始密码子ATG之前至5’端1.3kb，其5’端酶切位点为XbaI，3’端酶切位点为BamHI，PCR合成引物为TFL1 F1 5′-GGCTCTATCACTCTAGTTCCC-3′
TFL1 F2 5′-GGATCCTTTCTTTTGTTAACTTAGAGG-3′TFL1 R2 5′-TCTAGACCAAATCTGCGATATGTTTC-3′模板制备以拟南芥幼嫩叶片为材料，采用CTAB法制备。TFL1启动子的PCR合成反应系统及扩增程序如下TFL1(巢式PCR)第一次PCR反应体系扩增程序buffer 5μL94℃1min TFL R2 0.5μL 72℃10min模板1μL 4℃ 30min水 34.5μL------------------------50μL第二次PCR反应体系扩增程序buffer 5μL 94℃1min TFL R2 0.5μL72℃10min模板1μL 4℃ 30min水 34.5μL-----------------------50μL实施例二AP1基因启动子的克隆AP1启动子设计长度为翻译起始密码子ATG之前至5’端1.9kb，其5’端酶切位点为XbaI，3’端酶切位点为BamHI，PCR合成引物为AP1 F0 5′-AGATGTAACAAAGGCGAAGA-3′AP1 R0 5′-TAGGGTTCACTTCACTACGG-3’AP1 F1 5′-GGTCTAGAAGGCCACGAGCTTAGATTCTTT-3
AP1 R15′-GGGGATCCATTTTTGATCCTTTTTTAAGAAACTTCTTACTC-3′模板制备以拟南芥幼嫩叶片为材料，采用CTAB法制备。AP1启动子的PCR合成反应系统及扩增程序如下AP1(巢式PCR)第一次PCR反应体系扩增程序buffer 5μL 94℃1min AP1 R0 0.5μL72℃10min模板 1μL 4℃ 30min水 34.5μL-----------------------50μL第二次PCR反应体系扩增程序buffer5μL 94℃1min AP1 R10.5μL 72℃10min模板 1μL 4℃ 30min水34.5μL----------------------50μL2.1.2编码序列无花基因的编码序列，即细胞生长、分裂、分化抑制因子，可以是天然的，如来源于拟南芥的三种RNase基因RNS1、RNS2、RNS3；来源于微生物的解淀粉芽孢杆菌的Barnas基因；也可以是人工合成的。根据本发明的一个优选实施方案，所说的Barnase基因的编码序列是以PCR方法合成的。将PCR产物克隆于pMD-18T载体中，测序。
实施例三BN基因编码序列的克隆
BN编码序列设计长度为333bp，其5’端酶切位点为BamHI、NcoI，3’端酶切位点为SacI，PCR合成引物为BN F 5′-GGGGATCCATGGCACAGGTTATCAACACG-3′BN R 5′-GGGAGCTCTTATCTGATTTTTGTAAAGGT-3′模板制备吸取培养过夜的菌液4μL，加6μL水，99℃10min作模板。BN基因编码序列的PCR合成反应系统及扩增程序如下模板从培养的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)平皿中挑一个菌落，37℃液体培养过夜→4μL菌液+6μL水→99℃10min作模板反应体系 PCR程序模板 10μL94℃1min Buffer 5μL 72℃10mindNTP 4μL 4℃ 30mn水 29.75μL------------------50μL2.1.3终止子可以来源于植物，也可以来源于某些植物的病原菌，如根瘤农杆菌Ti质粒胭脂碱(Nopaline)基因终止子NOS-ter。根据本发明的一个优选实施方案，无花基因的终止子采用NOS-ter，系来自早前已存在于表达载体pBI121之中的GUS基因的NOS-ter。
2.1.4无花基因表达盒的构建无花基因表达盒的构建实质上是以事前设计好的程序，依次将其启动子、编码序列、终止子插入到克隆载体的相应位点。根据本发明的一个优选实施方案，首先将NOS-ter终止子用EcoRI、SacI酶切出，插入到pUC119质粒的相应位点(A)；再以XbaI、BamHI酶将存在于pMD-18T中的AP1启动子切出，插入到A中相应位点(B)；最后，以SacI酶切存在于pMD-18T中的Bamase序列，补平，再以BamHI将Bamase的编码序列切出，插入到B中的BamHI与SmaI位点之间。
2.2无花基因表达载体的建立为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组的融合表达载体还进一步含有可选择标记和报告基因。所使用的选择标记和报告基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记和报告基因是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中。本发明优选表达载体为pCAMBIA1301。该载体带有根瘤农杆菌Ti质粒的T-DNA的左、右边界LB、RB，使之可以以农杆菌介导方法转化植物。该表达载体在植物中的选择标记是潮霉素抗性基因(Hygromycin phosphotransferase)，报告基因为葡萄糖苷酶基因(GUS)，并且含有LacZ蓝白斑筛选标记及用于插入目的基因的多克隆位点(MCS)，以便于无花基因的插入。
根据本发明的一个优选实施方案，无花基因表达载体的建立，是以XbaI、EcoRI酶将无花基因表达盒从pUC119中切出，插入到pCAMBIA1301的相应位点。(见附图2、4)3.纯营养生长植物株系建立程序以无花基因转化建立纯营养生长植物株系适用于所有的种子植物。纯营养生长植物株系的建立实质上是通过基因转化，将植物无花基因转入种子植物体内，并有效表达而实现的。
3.1无花基因的转化方法将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不限于1.使用农杆菌(Agrobacterium)作为植物病原体所介导的农杆菌转化法(Agrobacterium Mediated transformation)、2.物理法，如基因枪法(Particle Bombardment & particle gun & Gene gun)、电击融合法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoreti)等。3.化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等。4.种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法。5.以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。本发明的一个优选实施方案采用农杆菌介导转化法。
这里应该特别指出的是，虽然在本发明下述实施例中以转基因烟草的产生举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味着本发明制备的无花基因的DNA序列及携带该DNA序列的重组融合载体只用于转化和生产不开花的转基因烟草。
因此，使用具有本发明所描述的特征的无花基因表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的纯营养生长植物株系，均包括在本发明之内。
给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
农杆菌介导转化无花基因实例3.1.1 LBA4404感受态细胞的制备挑取LBA4404单菌落接种于5ml YEB(含利福平100μg/ml，链霉素25μg/ml)中，28℃，250rpm培养过夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培养基中，继续培养至OD值约为0.6。将菌液转至无菌离心管中，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用2ml 20mM的重悬菌体，按每管200μl分装于无菌小离心管中。
3.1.2重组质粒转入LBA4404细胞在200μL LBA4404感受态细胞中分别加入2μg重组质粒pCAMBIA1301 DNA，置冰浴5分钟，然后转至液氮中冷冻8分钟，迅速于37℃水浴中温育5分钟后，加入800μL YEB培养基，28℃ 250rpm预表达培养4-5小时，然后涂铺于含有卡那霉素的YEB固体平板，28℃培养24-48小时。则长出的农杆菌菌落带有相应的转化质粒。
3.1.3烟草的转化(1)农杆菌的准备28℃过夜分别培养带有植物表达载体的农杆菌50ml，5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀，用液体MS培养液洗涤一次，再用MS重悬至OD600＝0.2-0.4。
(2)浸染取烟草无菌苗叶片，用刀切成边长约0.5厘米小方块，在农杆菌悬液中浸泡5-10分钟，然后用灭菌滤纸吸干。
(3)共培养将叶块摆放在不加抗生素的共培养培养基中(上面垫二层滤纸)于25％避光共培养3天。
(4)选择培养将叶片继代到选择培养基中在光照培养箱中(光照12小时，黑暗12小时)培养至抗性芽的出现。
(5)抗性小苗的获得将愈伤移至生根培养基，每隔二周继代培养一次，最后种植到培养钵。
3.2转基因植物株系的鉴定方法转基因植物株系的鉴定方法可以分为分子水平、组织化学水平及植株生物学特性鉴定三个水平。
3.2.1分子水平鉴定A PCR鉴定取1-3克烟草鲜叶片，加等量的用液氮研磨，将粉末置于50ml离心管中，加入20mlDNA提取缓冲液(100mM Tris.HCl pH8.0 500mM NaCl，10mM β-巯基乙醇，50mM pH8.0)，剧烈振荡1分钟，加入4ml 10％SDS，轻轻混匀，于65℃加热10-20分钟，至颜色翠绿，加入冰冷5M KAC 4ml，冰上放置30分钟，然后在4℃，12000rpm离心15分钟，吸上清，用0.6倍异丙醇沉淀后，用处理，纯化备用。
以转基因烟草的基因组DNA为模板，分别用无花基因的特异性引物进行如下PCR反应在0.2ml的Eppendorf管中加入H2O 30.5μL10×PCR buffer 5.0μLMgCl2(25mM) 3.0μL4×dNTP(各2.5mM) 5.0μLPrimer1(20pmol/μL)5.0μLPrimer2(20pmol/μL)2.5μL烟草DNA1.0μL
Taq酶(3U/μL) 0.5μL----------------------------------------------50μL反应程序为94℃ 3分钟94℃ 30秒，46℃ 30秒，72℃ 60秒，30个循环72℃ 5分钟所用无花基因TFL1-BN-NOS.Ter引物为(20pmol/μL)F5’-GTC TCC CAA ATC ACT ACA A-3’R5’-CAT ATA ATT TCT GTT GAA-3’PCR扩增出478bp片段的为阳性克隆。
所用无花基因AP1-BN-NOS.Ter引物为(20pmol/μL)F5’-CGC AAA TCC TAA AGA AAC-3’R5’-GAT AAT CAT CGC AAG ACC-3’PCR扩增出699bp片段的为阳性克隆。
B PCR产物的Southern分析进一步进行PCR的Southern分析，a将植物DNA的PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳并照相。
b将胶置于小盘中加入200ml变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)振荡45分钟。
c弃去变性液，用蒸馏水漂洗数次，加入中和液(1M Tris，pH7.4，1.5M NaCl)200ml，振荡30分钟，然后更换新的中和液，继续中和15分钟。
d剪相应大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，于蒸馏水中均匀湿透后，将NC膜浸于10×SSC(20×SSC每1000ml含有NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g pH7.0)中，放置20分钟。
e使用Bio-Rad公司的转膜仪转膜1小时。
f去掉胶块，标记好加样孔位置，用6×SSC洗膜5分钟，然后紫外照射5分钟，以固定DNA。2×SSC洗膜，室温风干。
g将NC膜卷入杂交瓶中，加入20ml预杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，200μg/ml鱼精DNA)，使膜均匀浸润无气泡，然后置于分子杂交仪中68℃预杂交过夜。
h探针的标记采用公司随机引物试剂盒标记。取适量待标记片段，变性2分钟迅速置于冰上，在一新的Eppendorf管中，依次加入5×labling buffer 10μLdCTP、dGTP、dTTP混合物2μL变性模板 25μLBSA 2μLα-32P-Datp 5μL酶1μL加H2O至总体积 50μL轻轻混匀，室温反应60分钟。95％变性2分钟置于冰上。加入2μL 0.5MEDTA。
i向预杂交完毕的袋中加入变性探针30-50μL，重新封好继续于68℃杂交8-10小时。
j取出杂交膜用2×SSC，0.5％SDS洗膜30分钟，用2×SSC，0.1％SDS洗15分钟，再用0.1×SSC，0.5％SDS于42℃洗膜30分钟-数小时，中间更换新的洗膜液。
k 0.1×SSC洗膜2分钟，用吸水纸吸去水珠，用保鲜膜包好膜，暗室中压片。
1-70℃自显影3-6小时后洗片。
3.2.2组织化学鉴定转基因烟草的GUS分析取转基因烟草的叶片，切几个小块(0.5mm2)，放到1.5mlEppendorf管中并加入15μL GUS底物，于37℃处理过夜。然后用95％乙醇脱色2小时，70％乙醇继续脱色数次，每次1小时以上。观察是否出现蓝色反应。结果证明，大部分转基因植株呈现的GUS阳性反应。
3.2.3转基因植株开花特性的鉴定A将经过分子、组织化学鉴定的转基因植株与对照材料同时植于温室，以观察其开花习性。
B对于栽植后多年才能开花的植物，将经过选择、Southern分子杂交鉴定的转化株系直接嫁接于成年树上，并设对照，以最终确定其开花及其它生物学特性。一般1-2年时间，即可鉴定出转化植株是否为真正的无花株系。
3.3可以建立无花种子植物的种类所有的种子植物都可以建立其纯营养生长株系，其种类同1.4。4.以无花基因建立的纯营养生长株系的特性4.1无花(粉)、无果(毛)、无种子(毛)，可以完全避免其对环境的污染及对人们身体健康的危害。
4.2速生、生产效率高这一特征包括两个层次。其一，可以提高总生物量因其生殖生长被抑制，使其营养生长更旺盛，枝繁叶茂，可以产生更多的物质和能量，提高了其总生物量；其二，纯营养生长植株的营养生长量等于其总生物量因其生殖生长被抑制，使得节约下来的原本应该用于生殖生长的营养物质和能量，用于营养生长，其营养生长量等于其总生物量。
4.3优质营养体的速生与优质在纯营养生长植物株系中得以兼顾。这种速生而优质是建立在牺牲生殖器官而不是牺牲质量为前提的、建立在原有优质基础上的速生。
4.4只能靠无性繁殖因建立的无花株系，无花，无果，无种子，不能进行有性生殖，种群的扩大只能靠扦插、埋根、嫁接、组织培养等无性繁殖。
4.5安全建立的无花株系因无生殖系统，既不会发生基因的漂移，也不会发生基因扩散。
4.6上述5种特性是一种新的种质，可以在其个体及其克隆世代中一直保持下去。
总之，本发明涉及一种可导致种子植物丧失花器官发生与形成能力的基因--无花基因，包含所说无花基因的基因表达盒及其植物表达载体，被所说的表达载体转化的植物细胞、植株--纯营养生长株系及其克隆系、衍生系，无花基因和纯营养植物株系建立的技术系统。以此基因建立的纯营养植物株系具有无花、速生而优质、安全的特性，但其繁殖只能通过克隆的方式进行。
序列表SEQ ID NO1的信息(i)序列特征A)长度1935碱基对B)类型核苷酸C)链型双链D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)结构TFL1启动子-Barnase-Nos.terA)启动子TFL1基因启动子7-1316 5’端XbaI 3’端BamHI、NcoI。
B)编码序列Barnase基因编码序列1323-1658 5’端BamHI、NcoI 3’端SacI。
ATG 1323-1325 TAA 1656-1658C)终止子Nos.ter1665-1929 5’端SacI 3’端EcoRI(iv)其它信息种子植物无花基因1(花序分生组织特异表达核糖核酸酶基因)表达盒(v)序列描述SEQ ID NO11 TCTAGACCAA ATCTGCGATA TGTTTCTTTC AAATAGCCTC TGAGCTAGGC51 CTGGGCATTC AGTTTCGGTT CGGTTGCGCA TGGTTTCGGT TATTTCGGTT101 ATAGTAATAT AAGAACCATT TGGATATTTG AGGAATTTTG GTTCGGTTCG151 GTTCGGATAT CTTTCGGTTC GGTTCGGTTT GGATATTAAA CTTGGTAACC201 ATAAATAAAC TAAAACCGAA ATAACCGACT AAAAACCGAA ACAACCAAAA251 AATTTGACCA ATAACCGATA TAGAACGTAC GTAAAAAAGA GAAATATTCA301 CAACTCACAA AGATGGTCCA TACTCTCCAT AATATTAAAA CACCTGATTC351 ACAACTCACG AAATTCAACT TGCAAACTAA TAAAGAGAAA AACATAGTTA401 AGTGTCAATA CATACTGTGA TATATTATCT ATCATACATA TATGCTTTGG451 TTTTCATTTG GTTATCGGTT ATTAACCTAA CCGAAACCGA AACCGAAATC501 TAAGACATAT AATATTCAAC CGGTTATTTT AAGCTATCCA AACCTGAACC551 GAACCATGTT TTTCGGTTCG ATTCGGTTCG GTTAATCGGT TAGCGGTTTT601 TTTGCCCAGG CCTACTCTGA GCAATAATTG TATCCGGAGT TGTAATAGAA651 TCAAAGTACG ATGAGAGTGT TTTTATGACA AATATCTTAA TCTTGGCCAA701 TTATATGTTC TACTGAAATT CTTTTTGAAT TCATCGACCA GTGAGACTTA751 AAAATAGCTT TTTATTCGCC GAGGTATATA TAGCTAGGAA TTTTGTCGAA801 ATTTAGACGT TAGTGGGTTT TGTTCTTCGT GACACAAAAG ATATTCTATA851 TATTAACGAA ATCTAGCGAT CGATATGGTA TTTATATAAA GTCTTGGTCA901 TAGATAGGGG TTGAAACTTG AAACCATGCA TGATATGCCA ATGTTGCTGA951 AGCAGTCAAT GTTGCTGAAG AAGTCAAACG TAATTATATA GTGAATACCA1001 AAAAAGTGAT ATTTCTTAAT TCAATTAAAT ATAATTATAG TTTTAAATCA1051 CCTAAAATAA GTTACTTATT AAAACCCCCC AAATTTACTT TAATATAGTT1101 GGTGTACATG TTTGAGAAAG CAAACAAAAA GAAAAAGAAA AAGAAAAAAA1151 AAAGAGAAAG AGGTTAGTAC ACATAATTGG GAATTAATGT CTATTGATTC1201 TTTTATCTTT CTCTCTCTCT CTAAGACGGA AAACCCCTAT AAATAGATGT1251 CTCGGTCGTC TCTTTGTCTC CCAAATCACT ACAAATCTCT CTTTTCCTCT1301 AAGTTAACAA AAGAAAGGAT CCATGGCACA GGTTATCAAC ACGTTTGACG1351 GGGTTGCGGA TTATCTTCAG ACATATCATA AGCTACCTGA TAATTACATT1401 ACAAAATCAG AAGCACAAGC CCTCGGCTGG GTGGCATCAA AAGGGAACCT1451 TGCAGACGTC GCTCCGGGGA AAAGCATCGG CGGAGACATC TTCTCAAACA1501 GGGAAGGCAA ACTCCCGGGC AAAAGCGGAC GAACATGGCG TGAAGCGGAT1551 ATTAACTATA CATCAGGCTT CAGAAATTCA GACCGGATTC TTTACTCAAG1601 CGACTGGCTG ATTTACAAAA CAACGGACCA TTATCAGACC TTTACAAAAA1651 TCAGATAAGA GCTCGAATTT CCCCGATCGT TCAAACATTT GGCAATAAAG1701 TTTCTTAAGA TTGAATCCTG TTGCCGGTCT TGCGATGATT ATCATATAAT1751 TTCTGTTGAA TTACGTTAAG CATGTAATAA TTAACATGTA ATGCATGACG1801 TTATTTATGA GATGGGTTTT TATGATTAGA GTCCCGCAAT TATACATTTA1851 ATACGCGATA GAAAACAAAA TATAGCGCGC AAACTAGGAT AAATTATCGC1901 GCGCGGTGTC ATCTATGTTA CTAGATCGGG AATTC//SEQ ID NO2的信息(i)序列特征A)长度2542碱基对B)类型核苷酸C)链型双链D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)结构AP1启动子-Barnase-Nos.terA)启动子AP1基因启动子7-1923 5’端XbaI 3’端BamHI、NcoI。
B)编码序列Barnase基因编码序列1930-2265 5’端BamHI、NcoI 3’端SacI。
ATG 1930-1932 TAA 2263-2265C)终止子Nos.ter 2272-25362272-2536 5’端SacI 3’端EcoRI(iV)其它信息种子植物无花基因2(花分生组织特异表达核糖核酸酶基因)表达盒。(v)序列描述SEQ ID NO21 TCTAGAAGGC CACGAGCTTA GATTCTTTTA GTTTTGCTCA ATTTGTTAAG51 TTTCTACTTT TCCTTTTGTT GCTTACTACT TTTGCTCATG ATCTCCATAT101 ACATATCATA CATATATATA GTATACTATC TTTAGACTGA TTTCTCTATA151 CACTATCTTT TAACTTATGT ATCGTTTCAA AACTCAGGAC GTACATGTTT201 AAATTTGGTT ATATAACCAC GACCATTTCA AGTATATATG TCATACCATA251 CCAGATTTAA TATAACTTCT ATGAAGAAAA TACRTAAAGT TGGATTAAAA301 TGCAAGTGAC ATCTTTTTAG CATAGGTTCA TTTGGCATAG AAGAAATATA351 TAACTAAAAA TGAACTTTAA CTTAAATAGA TTTTACTATA TTACRATTTT401 TTCTTTTTAC ATGGTCTAAT TTATTTTTCT AAAATTAGTA TAATTGTTGT451 TTTGATGAAA CAATAATACC GTAAGCAATA GTTGCTAAAA GATGTCCAAA501 TATTTATAAA TTACAAAGTA AATCAAATAA GGAAGAAGAC ACGTGGAAAA551 CACCAAATAA GAGAAGAAAT GGAAAAAACA GAAAGAAATT TTTTAACAAG601 AAAAATCAAT TAGTCCTCAA ACCTGAGATA TTTAAAGTAA TCAACTAAAA651 CAGGAACACT TGACTAACAA AGAAATTTGA AACGTGGTCC AACTTTCACT701 TAATTATATT GTTTTCTCTA AGGCTTATGC AATATATGCC TTAAGCAAAT751 GCCGAATCTG TTTTTTTTTT TTTTTGTTAT TGGATATTGA CTGAAAATAA801 GGGGTTTTTT CACACTTGAA GATCTCAAAA GAGAAAACTA TTACAACGGA851 AATTCATTGT AAAAGAAGTG ATTAAGCAAA TTGAGCAAAG GTTTTTATGT901 GGTTTATTTC ATTATATGAT TGACATCAAA TTGTATATAT ATGGTTGTTT951 TATTTAACAA TATATATGGA TATAACGTAC AAACTAAATA TGTTTGATTG1001 ACGAAAAAAA ATATATGTAT GTTTGATTAA CAACATAGCA CATATTCAAC1051 TGATTTTTGT CCTGATCATC TACAACTTAA TAAGAACACA CAACATTGAA1101 CAAATCTTTG ACAAAATACT ATTTTTGGGT TTGAAATTTT GAATACTTAC1151 AATTATTCTT CTCGATCTTC CTCTCTTTCC TTAAATCCTG CGTACAAATC1201 CGTCGACGCA ATACATTACA CAGTTGTCAA TTGGTTCTCA GCTCTACCAA1251 AAACATCTAT TGCCAAAAGA AAGGTCTATT TGTACTTCAC TGTTACRGCT1301 GAGAACATTA AATATAATAA GCAAATTTGA TAAAACAAAG GGTTCTCACC1351 TTATTCCAAA AGAATAGTGT AAAATAGGGT AATAGAGAAA TGTTAATAAA1401 AGGAAATTAA AAATAGATAT TTTGGTTGGT TCAGATTTTG TTTCGTAGAT1451 CTACAGGGAA ATCTCCGCCG TCAATGCAAA GCGAAGGTGA CACTTGGGGA1501 AGGACCAGTG GTCCGTACAA TGTTACTTAC CCATTTCTCT TCACGAGACG1551 TCGATAATCA AATTGTTTAT TTTCATATTT TTAAGTCCGC AGTTTTATTA1601 AAAAATCATG GACCCGACAT TAGTACGAGA TATACCAATG AGAAGTCGAC1651 ACGCAAATCC TAAAGAAACC ACTGTGGTTT TTGCAAACAA GAGAAACCAG1701 CTTTAGCTTT TCCCTAAAAC CACTCTTACC CAAATCTCTC CATAAATAAA1751 GATCCCGAGA CTCAAACACA AGTCTTTTTA TAAAGGAAAG AAAGAAAAAC1801 TTTCCTAATT GGTTCATACC AAAGTCTGAG CTCTTCTTTA TATCTCTCTT1851 GTAGTTTCTT ATTGGGGGTC TTTGTTTTGT TTGGTTCTTT TAGAGTAAGA1901 AGTTTCTTAA AAAAGGATCA AAAGGATCCA TGGCACAGGT TATCAACACG1951 TTTGACGGGG TTGCGGATTA TCTTCAGACA TATCATAAGC TACCTGATAA2001 TTACATTACA AAATCAGAAG CACAAGCCCT CGGCTGGGTG GCATCAAAAG2051 GGAACCTTGC AGACGTCGCT CCGGGGAAAA GCATCGGCGG AGACATCTTC2101 TCAAACAGGG AAGGCAAACT CCCGGGCAAA AGCGGACGAA CATGGCGTGA2151 AGCGGATATT AACTATACAT CAGGCTTCAG AAATTCAGAC CGGATTCTTT2201 ACTCAAGCGA CTGGCTGATT TACAAAACAA CGGACCATTA TCAGACCTTT2251 ACAAAAATCA GATAAGAGCT CGAATTTCCC CGATCGTTCA AACATTTGGC2301 AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC GATGATTATC2351 ATATAATTTC TGTTGAATTA CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG2401 CATGACGTTA TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT2451 ACATTTAATA CGCGATAGAA AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA2501 TTATCGCGCG CGGTGTCATC TATGTTACTA GATCGGGAAT TC附图的简要说明图1以TFL1基因启动子为启动子的无花基因(表达盒)示意2以TFL1基因启动子为启动子的无花基因表达载体结构示意3以AP1基因启动子为启动子的无花基因(表达盒)示意4以AP1基因启动子为启动子的无花基因表达载体结构示意5茎端分生组织发育、调节关系示意图说明1.符号说明|-|表示相互抑制作用→表示激活作用2.英文缩写说明TFL1Terminal flower 1基因AP1Apetala 1基因AP2Apetala 2基因LFYLeafy基因CALCauliflower基因VMVegetative meristm营养分生组织IMInflorescence meristm 花序分生组织FMFloral meristm花分生组织
权利要求
1.一类基于花发育早期组织细胞特异表达启动子与细胞致死因子基因重组的、可以导致种子植物丧失花器官发生与形成能力的基因--植物无花基因及其基因的表达盒(TFL1-BN-Nos.Ter、AP1-BN-Nos.Ter等基因)，如SEQ ID NO1、2所示的核苷酸序列及其克隆系或功能等同序列。
2.根据权利要求1无花基因的基因表达盒，如SEQ ID NO1、2，其特征为该基因表达盒由下列元件组成2.1花发育早期组织细胞特异表达启动子；2.2细胞抑制或致死因子编码序列；2.3终止子。
3.根据权利要求1、2所述的无花基因的表达盒，其中启动子如TFL1、AP1，其特征为花发育早期组织细胞特异表达基因的启动子，包括但并不限于花序分生组织、花分生组织、花原基特异表达及其居间调节基因的启动子，及其功能等同的启动子。
4.根据权利要求1、2所述的无花基因表达盒，其中编码序列，如解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因Barnase，或者功能等同的基因或序列，其特征为该序列的表达物是一种细胞抑制或致死因子。
5.根据权利要求1、2所述的无花基因表达盒，其中终止子如花椰菜花叶病毒Nopaline(Nos)基因的终止子，包括一个或多联终止子序列，一个融合基因转录产物的切割序列和一个融合基因转录产物的加工序列，一个类似多聚腺苷酸化信号序列，和一个多聚腺苷酸化序列所组成或功能等同的序列。
6.无花基因的植物表达载体，该载体的组成和结构特征为该载体适合于在植物细胞或整株植物中表达，含有权利要求1、2所述的无花基因的表达盒，具有如权利要求1～5之一所描述的特征。
7.以任何一种方法用携带根据权利要求1、2所述的无花基因的植物达载体转化的植物细胞，并由此获得具有纯营养生长的植物株系及其克隆系、衍生系，包括任何部分的植物组织或器官。
8.根据权利要求1～7所述，以无花基因创造的无花(粉)、果(毛)、种(毛)污染的环保绿化用植物，其中包括但不限于悬铃木、杉木、杨树、柳树。
9.根据权利要求1～7所述，以无花基因创造的速生(高产)而质地优良的茎用、根用、叶用、次生代谢物生产用及生态保护用植物。
10.根据权利要求1～9所述，以无花基因创造的无花、速生而优质的纯营养生长植物及其克隆系，包括但不限于扦插、埋根、嫁接或组织培养方式繁殖的材料。
11.根据权利要求1、2所述，以无花基因建立纯营养生长植物株系的方法。
全文摘要
本发明提供一类基于花发育早期组织细胞特异表达的启动子与细胞致死因子基因重组的、可以导致种子植物丧失花器官发生与形成能力的基因——植物无花基因(见附图1、2)、以此基因建立的纯营养生长植物株系及其建立的技术系统。这一纯营养生长植物株系因其无花、果、种子，避免了其对环境的污染及人身健康的危害；而节省下来的物质和能量可以用于营养器官的生长，导致其在保持原有质量上的速生，生产出更多优质的根、茎、叶产品。建立的纯营养生长植物株系可用于生态林、用材林、环境绿化系统的建立以及茎用、叶用、根用、次生代谢物用植物产品的生产。
文档编号C12N15/63GK1459504SQ0211787
公开日2003年12月3日 申请日期2002年5月24日 优先权日2002年5月24日
发明者陈占宽, 冯欣怡, 严海燕, 冯长访, 郅玉宝, 易明林, 陈净植, 郝建平, 宋莲芬 申请人:陈占宽