专利名称：人乳头瘤病毒e6/e7融合基因及其高效表达载体和融合蛋白疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人乳头瘤病毒E6/E7融合基因，该基因的制备方法，含有该基因的高效表达载体的构建和表达载体，利用该基因所获得的融合蛋白，以及所述融合基因和表达蛋白在医学中及在制备治疗宫颈癌等肿瘤的药物中的应用。
国内外大量流行病学及临床研究已经证明，HPV16是引起妇女宫颈癌的主要病毒病因，在我国约有66％的宫颈癌患者由HPV16感染所致，其余为HPV18，33和58型所致。感染途径主要为横向水平传播(即多个性伙伴互相传播)和母婴垂直传播两种途径(中华肿瘤杂志，142932-296，1992)，与俄罗斯及日本等国报告的60％-78％基本一致(Int.J.Cancer，85313-318，2000；JPN，J，Cancer Res，8628-34，1995)。
随着分子生物学研究的迅速发展和深入。对HPV病毒的致癌机理有了更确切的了解。通常HPV病毒感染宿主细胞后，其DNA整合到细胞的基因组中，但以后多数基因如壳蛋白L1和L2及早期蛋白E1、E2、E4、E5被删除而从宿主DNA中丢失。E6和E7两个癌基因仍然整合在基因组中。研究工作已经证明，这两个基因的持续表达对于癌变及维持肿瘤的恶性表型是必需的(HPV and Cervical Cancer.Oxford UniversityPress，1994，London；Intl.J.Gynecol.Pathol.1916-28，2000；EMBO J，8513-519，1989)。因此，这两个基因已逐渐成为人们研究癌变机理及防治用新生物制品的热点。
研究者曾对壳蛋白L1进行了较多的研究观察。这种蛋白疫苗虽对HPV病毒的感染具有一定的预防作用，但对已感染者则无预防和治疗作用(Int.J.Cancer 81881-888.1999；J Natl Cancer Inst 93284-292，2001)。制备过程中存在最关键的技术难题是必须使用VLP(病毒样颗粒)。即产物必须经二次至三次超离心获得构型合适的VLP(J.Natl.Cancer Inst.93284-292，2001)。而超离心的仪器设备昂贵，且能处理的样品量少；用昆虫表达系统需要细胞培养，用滚动式培养瓶需一个个接种，耗时、耗材料，操作繁杂，易污染且表达量较低。用原核细胞表达的L1蛋白，虽然表达水平较高，经柱层析后，再经过超离心方法获得的构型合适的VLP收率太低，仅为上超离心时蛋白总量的万分之二至万分之五(Virology，243423-431.1998)。由于上述原因，给规模化批量生产带来了很多困难。
近年来，国外开始把E6和E7基因作为主攻方向。动物实验表明，单独使用以原核系统表达的E7蛋白有防治效果，单独使用E6蛋白也有55％左右的效果(Cancer Res，58724.1998)。已有研究证明，同时用E6和E7两种蛋白的效果明显优于单独使用其中一种(CancerRes.591184-1187，1999)。因此，研究者曾设想使用E6/E7的融合蛋白作为疫苗以期进一步提高防治效果。但由于E6基因本身或E6/E7的融合蛋白表达水平太低而无应用价值。国外报道用原核表达野生型E6/E7的融合蛋白，经IPTG诱导后，表达水平仅为菌体总蛋白的2.5％(CancerRes.591184-1187.1999)，且由于是未经改造的野生型癌基因产物，其安全性受到人们的质疑。含有E6和E7基因的病毒疫苗，或以质粒为载体的DNA疫苗，由于可能整合到细胞基因组中，也存在安全性问题。用合成多肽疫苗，成本高且还需先作HLA鉴定，使用范围受限制。
因此，本发明的一个目的是提供人乳头瘤病毒E6/E7融合基因，该融合基因至少包括HPV的E6基因的编码其1-120位的氨基酸的核苷酸序列(包括E6中完整的B-表位(1-23aa)和CTL-表位(29-38aa))，以及E7中完整的最关键的且已被证明确有抑癌活性的2个CTL-表位(11-20aa；49-57aa)及Th-表位(48-54aa)和3个B-表位(1-18aa；25-37aa；43-60aa)，即E7中的至少编码前1-60位氨基酸的核苷酸序列(也可以包括编码前60位以上的氨基酸的核苷酸序列，例如编码前70个氨基酸的核苷酸序列，直至编码总共98个氨基酸的核苷酸序列)。
其中E6基因的编码第50位的赖氨酸的密码子，E7基因编码第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密码子可采用定点突变方法进行基因突变，使其丧失导致抑癌基因失活的能力。
该基因的特点是能够在宿主中高效表达E6/E7融合蛋白。
该融合基因通过以下步骤来制备(A)获取E6、E7基因；(B)将E6基因的编码第50位的赖氨酸的密码子，E7基因编码第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密码子进行定点突变；(C)将以上定点突变后的E6基因的编码1-120位氨基酸的核苷酸序列与定点突变后的E7基因的核苷酸序列融合。
本发明的另一个目的是提供上述融合基因的高效表达载体的构建及所述高效表达载体，包括用所述融合基因制成重组质粒，再将重组质粒转化至宿主中。
本发明的又一个目的是提供利用上述融合基因获得的蛋白疫苗。
本发明还有一个目的是提供上述融合基因和融合蛋白在医学中的应用。
本发明更进一步的目的是提供上述融合蛋白在制备治疗和/或预防宫颈癌等癌症的药物中的应用。
本发明的人乳头瘤病毒E6/E7融合基因可用于制备安全、有效、且高效表达的用于防治宫颈癌的蛋白疫苗。为宫颈癌的防治提供新的生物工程制剂。基因经突变及其它改造后其表达水平占细菌总蛋白的40％左右，比国外已报导的2.5％高15倍左右，且安全，有效，易大批量生产。经检索国内外尚未见到类似的报导。
图2蛋白疫苗对实验动物的防癌作用(详细实验方法见正文)1，蛋白疫苗+IFA佐剂组；2，IFA佐剂组；3，生理盐水组图3蛋白疫苗对肿瘤生长的抑制作用(详细实验方法见正文)1，蛋白疫苗+IFA佐剂组；2，IFA佐剂组；3，生理盐水组
2、E6和E7基因的定点突变由于E6基因所编码的蛋白中第50位的亮氨酸(Leu)是导致抑癌基因P53失活的关键位点，通过定点突变将其改变为甘氨酸(Gly)。又由于E7蛋白中第24位的半胱氨酸(Cys)和第26位的谷氨酸(Glu)是导致抑癌基因Rb失活的关键位点。将这两个氨基酸均采用定点突变的方法将其改变为甘氨酸(Gly)。突变后的E6和E7基因分别命名为mE6和mE7。
3、mE6ΔcmE7Δ融合基因的合成首先以上述mE6为模板用PCR方法扩增其1-120位的氨基酸的编码序列共360个碱基对，并在其5′端加上EcoR1位点。然后用PCR分段延长法在mE6Δ的3′端逐步加上mE7的前60个氨基酸(1-60位氨基酸)。并在3′端加上Notl位点。经序列分析证明所获得的融合基因序列正确无误，保留了突变的位点。命名为HPV16-mE6Δ/mE7Δ(见SEQ ID No.1)。由此构建的融合基因保留了E6中完整的B-表位(1-23aa)和CTL-表位(29-38aa)(Clin，Exp.Immunol，115397-403，1999；J.Immunol.1545934-5939.1995)和E7中完整的最关键的且已被证明确有抑癌活性的2个CTL-表位(11-20aa；49-57aa)及Th-表位(48-54aa)和3个B-表位(1-18aa；25-37aa；43-60aa)(J，Immunol，1545934-5943，1995；Eur.J.Cancer，35946，1999；J.Immunother，21399.1998；Virology，231155-166，1997)。二、高效表达工程菌的构建及产物的鉴定将上述获得的HPV16-mE6Δ/mE7Δ融合基因片段用EcoRI和Notl酶切后，再定向克隆到PET30a(+)载体中(Novagen公司)转化大肠杆菌DH5a，在含有50ug/ml卡那霉素的LB-平皿上，37℃培养过夜，挑取阳性克隆，用常规方法提取重组质粒，经酶切鉴定。再将含目的基因重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。在含50ug/ml卡那霉素的LB-平皿上，于37℃培养过夜。随机挑选80个单菌落观察表达情况。表达条件为用新鲜LB培养液(含50ug/ml卡那霉素)。挑取单菌落在无菌环境中接种于5ml培养液(含50ug/mL卡那霉素)的试管中，37℃于摇床上培养过夜。次日按1∶50的比例接种于20ml培养液中，37℃摇培约3-4小时，待生长至O.D.600为0.5-0.7时，加入1mM(终浓度)IPTG诱导3-5小时。然后取1ml菌液于4℃，4000转/分，离心5分钟，弃上清加入常规用蛋白裂鲜液，超声破碎后，按常规方法进行SDS-PAGE电泳(10％)。电泳完毕后，用考马斯亮兰染色液染色2小时，再用脱色液脱色后，可明显看到一条约30KD的蛋白带。该蛋白带在未加诱导剂的对照管中几乎看不清楚。经用抗HPV16E6及E7(SantaCruz公司产品)分别进行Western blot分析鉴定，证明该蛋白为E6和E7的融合蛋白，且分子量与预计相符。再用同样条件进行发酵，取不同时间点(1至5小时)的样品经SDS-PAGE电泳分析，同时与已知浓度的BSA为参照标准同时进行电泳。经染色及脱色后，用自动成象扫描仪进行光密度计算。当发酵培养时间为5小时，目的蛋白产物为菌体总蛋白的40％左右。比国外报导的全长野生型E6/E7融合蛋白产物表达水平占菌体总蛋白的2.5％高15倍左右(Cancer Research，59184-1187.1999)。不同时间取样后产物表达水平的电泳结果见
图1。由于克隆位点是EcoR1和Notl，该表达产物在5′端带有His-Tag和S-Tag。用类似方法生产的HPV6b-L2E7基因工程疫苗用于治疗尖锐湿疣已取得较好的效果，已通过二期临床观察(J.Infect.Deseases 1999179612-618)。三、蛋白产物的纯化(以100ml培养的细菌为例)1、收获细胞；待细胞(含上述重组质粒)在37℃摇床培养生长至OD600为0.5-0.7时，加入IPTG最终浓度为1mM。再继续培养3-4小时，4000g，4℃离心10分钟收集大肠杆菌。尽可能的吸弃上清。然后将细胞悬浮于4ml溶液I中，(500mM NaCl，20mM Tris-HCl，PH8.0)。悬浮均匀后置冰水浴中，超声破碎细胞(每次超声3秒，停3秒，共30次)。
2、包含体的收集；由于表达蛋白是在包含体中，将上述经超声处理的样品于16000g，4℃，离心15分钟。尽量弃尽上清，收集沉淀。将沉淀再悬浮于溶液I中，重复离心一次，以进一步除去杂蛋白。
3、将上述收集的沉淀即包含体。悬浮于5mL含有8M脲素的溶液I中，混合均匀，置冰水浴中1小时以溶解包含体。然后于16000g，4℃离心20分钟，保留上清，弃去不溶的物质。并用0.45um的过滤器过滤。备下步纯化用。
4、预先装好层析柱(10cm×0.6cm)内含2.5ml层析介质TALONTMMetal亲合层析树脂(Clontech公司)，并已用溶液I(含8M脲素)平衡好备用。把上述已经过滤的溶液小心沿管壁加入柱中，不要使树脂漂起。控制流速在25ml/小时(相当于柱床体积的10倍/小时)左右，即约0.5ml/分。
5、用25ml溶液I(含8M脲素)冲洗柱子，流速同上，以除去杂质蛋白。
6、用15ml溶液II(20mM咪唑，500mM NaCl，8M脲素，20mMTris-HCl，pH8.0)洗柱以进一步除去非特异性结合的杂蛋白。流速同上。
7、洗脱并收集蛋白；用10mL溶液III(400mM咪唑，500mM NaCl，8M脲素，20mM tris-HCl，PH8.0)洗脱目的蛋白。流速控制在0.3ml/分，分步收集，每管0.3ml。
8、走SDS-PAGE电泳，以检查目的蛋白收集情况。合并含目的蛋白的各管样品。
9、用sephadex G50凝胶过滤(1×35cm)脱盐，用生理盐水洗脱，分步收集。流速0.5ml/分，1ml/管。电泳检查各管中蛋白量，并同时用已知浓度的BSA走电脉，以估计含量。合并含目的蛋白的各管，用分光光度法测定蛋白含量(Lowry法)。
用以上方法经重复试验，目的蛋白回收率基本在50-60％。用1升发酵液，按比例放大上述各步骤，最终可得产品(纯度为95％左右)，150至180mg。四、融合蛋白疫苗免疫后使实验动物排斥癌细胞的攻击——防癌作用以C57B1/6小鼠(8周左右)为实验动物。用疫苗免疫动物后，用TC-1肿瘤细胞(来源于小鼠的肿瘤细胞，为用HPV16型E6和E7基因，及激活的Ras癌基因转化而成，参见Cancer Res，5621，1996，由美国Johns Hopkins大学吴博士惠赠)。接种动物，观察肿瘤发生及生长情况。具体实验方案如下实验动物30只随机分三组，每组10只。第一组，每只动物皮下注射含15ug蛋白疫苗的不完全福氏佐剂(IFA)100uL；第二组每只动物只注射同体积的IFA；第三组，每只动物皮下注射同体积的生理盐水。第一次免疫后10天，再免疫一次，剂量同上。第二次免疫后10天，给每只动物右侧腹部皮下接种1×105TC-1肿瘤细胞。每周观察两次肿瘤生长情况，测量肿瘤体积。以V＝a2b/2计算肿瘤体积，其中；V为肿瘤体积，a为短径，b为肿瘤长径。接种肿瘤细胞60天后，第一组(疫苗组)未见肿瘤生长；第二组(IFA组)和第三组(生理盐水组)所有动物都有肿瘤生长，肿瘤平均体积分别为465±25立方毫米和470±35立方毫米(图2)。表明注射疫苗后，能有效预防肿瘤生长。
研究工作已经证明，致癌的HPV病毒感染宿主后，其E6和E7基因一直整合在宿主细胞基因组中并表达，经过一个较长的过程，逐渐使宿主细胞发生增生，再渐渐演变成癌细胞，称为原位癌，然后再经分裂增殖并向周围侵润而长成肿瘤。因此，本实验证明此蛋白疫苗能阻断肿瘤的形成，而具有预防作用。可用于HPV16感染者高危人群的防癌工作。五、融合蛋白疫苗对肿瘤细胞生长的抑制作用——治疗，预防术后复发转移实验动物，肿瘤细胞同上。实验方案如下实验动物共33只，每只动物皮下接种1×105TC-1肿瘤细胞。20天后，检查肿瘤生长情况，经观察有30只动物均有可触摸到的小肿瘤(约5-8立方毫米)。其中有三只不能确定而弃去。将其随机分为三组，每组10只；第一组(治疗组)；皮下注射含15ug蛋白疫苗的IFA100uL；第二组(IFA组)，每只动物注射100ul IFA佐剂；第三组(生理盐水组)，每只动物皮下注射100ul生理盐水。10d后再按上述剂量注射一次。一直观察至60天(从接种肿瘤细胞计算时间)，每周二次观察肿瘤生长情况。至实验观察到60天时，第一组(治疗组)仅两只动物肿瘤有生长，且明显小于其它组；第二组和第三组肿瘤全部生长，平均体积分别为10±3mm3，650±35mm3，680±45mm3(图3)。
如前所述，约有40％的宫颈癌患者因复发转移最终导致死亡。其原因主要是由于经过手术和/或放射治疗后，体内仍残存有癌细胞，这些癌细胞由于数量不太多或比较分散未形成可见或能触摸到的瘤块而未能切除，用其它检查手段如CT或X-光拍片诊断也不易发现(称为“亚临床病灶”)所致。本实验证明，用融合蛋白疫苗能显著抑制肿瘤细胞生长，说明本发明所制备的新型融合蛋白疫苗在治疗及预防转移复发方面具有较好的作用。
综上，本发明的优点是通过改造HPV16E6和E7基困保证了其安全性，并实现了高效表达，比国外报导的野生型提高了近15倍(CancerRes 951184，1999)。产物经纯化后与福氏不完全佐剂混合均匀(此佐剂用于临床已多年了)制备成疫苗后，经动物实验证明具有防癌作用和治疗功能。对于已感染HPV16病毒的高危人群预防宫颈癌及对宫颈癌患者术后预防复发，转移无疑具有重要的应用价值。
实施例2按照与实施例1的步骤一和步骤二类似的方法进行，只是从HPV33型病毒获取E6和E7基因，同样获得了高表达的融合基因及载体。
实施例3
按照与实施例1的步骤一和步骤二类似的方法进行，只是从HPV18型病毒获取E6和E7基因，同样获得了高表达的融合基因及载体。
实施例4按照与实施例1的步骤一和步骤二类似的方法进行，只是从HPV58型病毒获取E6和E7基因，同样获得了高表达的融合基因及载体。
序列表SEQ ID No.1(a)序列特征长度540碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线性(b)序列描述9 18 275’ATG CAC CAA AAG AGA ACT GCA ATG TTTMet His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe36 45 54CAG GCA CCA CAG GAG CGA CCC AGA AAGGln Ala Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys63 72 81TTA CCA CAG TTA TGC ACA GAG CTG CAALeu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln90 99108ACA ACT ATA CAT GAT ATA ATA TTA GAAThr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu117126135TGT GTG TAC TGC AAG CAA CAG TTA CTGCys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu144153162CGA CGT GAG GTA GGT GCA TTT GCT TTTArg Arg Glu Val Gly Ala Phe Ala Phe171180189CGG GAT TTA TGC ATA GTA TAT AGA GATArg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp198207216GGG AAT CCA TAT GCT GTA TGT GAT AAAGly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys225234243TGT TTA AAG TTT TAT TCT AAA ATT AGTCys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser252261270GAG TAT AGA CAT TAT CGT TAT AGT TTGGlu Tyr Arg His Tyr Arg Tyr Ser Leu279288297TAT GGA ACA ACA TTA GAA CAG CAA TACTyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr
306315324AAC AAA CCG TTG TGT GAT TTG TTA ATTAsn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile333342351AGG TGT ATT AAC TGT CAA AAG CCA CTGArg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu360369378TGT CCT GAA ATG CAT GGA GAT ACA CCTCys Pro Glu Met His Gly Asp Thr Pro387396405ACA TTG CAT GAA TAT ATG TTA GAT TTGThr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu414423432CAA CCA GAG ACA ACT GAT CTC TAC GGTGln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly441450459TAT GGT CAA TTA AAT GAC AGC TCA GAGTyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu468477486GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT CCA GCTGlu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala495504513GGA CAA GCA GAA CCG GAC AGA GCC CATGly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His522531540TAC AAT ATT GTA ACC TTT TGT TGC AAGTyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys LysTAA3’SEQ ID No.2(a)序列特征长度180个氨基酸类型蛋白链型单链拓扑结构线性(b)序列描述Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe5Gln Ala Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys10 15Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln20 25Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu30 35Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu4045Arg Arg Glu Val Gly Ala Phe Ala Phe50Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp55 60Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys65 70Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser75 80Glu Tyr Arg His Tyr Arg Tyr Ser Leu85 90Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr95Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile100 105Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu110 115Cys Pro Glu Met His Gly Asp Thr Pro120 125Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu130 135Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly140Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu145 150Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala155 160Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His165 170Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys175 180
权利要求
1.人乳头瘤病毒的E6/E7融合基因，其特征在于该融合基因至少包括HPV16的E6基因的编码其1-120位的氨基酸的核苷酸序列，E7基因中的至少编码前1-60位氨基酸的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的人乳头瘤病毒的E6/E7融合基因，其中E6基因的编码第50位的赖氨酸的密码子，E7基因编码第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密码子采用定点突变方法进行基因突变，使其丧失导致抑癌基因失活的能力。
3.根据权利要求1或2的融合基因，其中所述人乳头瘤病毒为HPV16型、HPV18型、HPV33或HPV58型。
4.根据权利要求2的融合基因，特征在于E6基因具有SEQ ID No.1的第1-360位的核苷酸序列，E7基因具有SEQ ID No.1的第361-540位的核苷酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的融合基因的突变体。
6.含有权利要求1-4中任一项的融合基因的高效表达载体。
7.用根据权利要求1-4中任一项的融合基因获得的融合蛋白。
8.根据权利要求7的融合蛋白，特征在于它具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-4中任一项的融合基因在医学中的应用。
10.根据权利要求7的融合蛋白在制备治疗和/或预防癌症，尤其宫颈癌的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种人乳头瘤病毒E6/E7融合基因,该基因的制备方法,含有该基因的高效表达载体的构建和表达载体,利用该基因所获得的融合蛋白,以及所述融合基因和表达蛋白在医学中和在制备治疗宫颈癌等肿瘤的药物(疫苗)中的应用。本发明融合基因的表达水平占细菌总蛋白的40%左右,比国外已报导的2.5%高15倍左右,且安全,有效,易大批量生产。
文档编号C12N15/62GK1381583SQ0211714
公开日2002年11月27日 申请日期2002年4月24日 优先权日2002年4月24日
发明者赵清正 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所