专利名称：无需克隆的线性表达载体构建方法
技术领域：
本发明涉及一种表达载体的构建方法，特别涉及一种无需克隆的构建线性表达载体的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用现有低成本的酶，来构建线性表达载体，以克服上述DNA拓扑异构酶I构建线性表达载体方法存在的缺陷。将此方法做成试剂盒，将大大方便使用者，为实现基因表达，蛋白功能研究等提供技术平台。
本发明的技术方案如下本发明提供一种构建线性表达载体的方法，其步骤包括1.设计引物1)相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶的识别序列，且引物1和引物2的酶识别序列是同一个酶的识别序列；2)启动子正向引物和终止子反向引物仅包括和扩增片段互补的DNA序列；2.分别以相应DNA片段为模板，以上述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；3.分别纯化步骤2得到的扩增产物，并用非对称性切割的限制性内切酶酶切片段中的酶识别序列；4.将酶切后的待连接片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体；本发明提供的构建线性表达载体的方法，在步骤3之后，还可包括将酶切后的待连接片段纯化这一步骤；步骤4所得线性表达载体进行PCR扩增后再转染受体细胞；步骤3中所用的非对称性切割的限制性内切酶为BsaMI、BstXI Alw NI、DrdI、AccI和MwoI中的任两种；步骤4连接反应所使用的酶为T4 DNA连接酶。
本发明使用的非对称性切割的限制性内切酶价格低廉，大大降低了使用成本，如果采用本方法构建线性表达载体，进行一个反应所消耗的试剂大约为30-50元人民币，仅为TOPO Tools试剂盒费用的15％-20％。由此可见，该方法可以在科研和生产中被推广使用。
实施例1、构建含CMV(巨细胞病毒)启动子片段A，GFP(绿色荧光蛋白)片段B，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)C的线性表达载体以质粒pCMV/myc/cyto/GFP为模板，分别扩增得到CMV(巨细胞病毒)启动子片段(A’)，GFP(绿色荧光蛋白)片段(B’)，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)(C’)，酶切后连接，得到含上述片段的线性表达载体(D)，其构建过程如
图1所示(1)设计引物在片段A和B的连接处设计一对引物1和2引物1是启动子CMV片段的反向引物，引物2是目的基因片段GFP的正向引物。它们都包括一段和扩增片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶的识别序列，酶识别序列如图中方框所示，且引物1和引物2中的酶识别序列是酶BsaMI的识别序列。
在片段B和C的连接处设计一对引物1’和2’引物1’是目的基因片段GFP反向引物，引物2’是终止子BGHpA的正向引物。它们都包括一段和扩增片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶的识别序列，酶识别序列如图中方框所示，且引物1’和引物2’中的酶识别序列是酶BstXI的识别序列。
设计启动子CMV的正向引物3和终止子的反向引物4。引物序列如下表。
表1引物
其中小写字母是和扩增片段互补的DNA序列，大写字母包含酶BsaMI或BstXI识别的序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段按下列条件分别进行三个片段的PCR扩增质粒模板(22.5ng/μl) 1μl10X PCR缓冲液5μl25mM MgCl23μl10mM dNTP1μl正向引物(100ng/μl) 1μl反向引物(100ng/μl) 1μlTaq酶(3unit/μl) 1μl无菌水 37μl总体积 50μl其中PCR缓冲液500mM KCl.10mM Tris-HCl，(PH9.0)，下同。
以上混合物以94℃初始变性5分钟，随后以94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。得到启动子扩增产物A’、目的基因片段扩增产物B’和终止子扩增产物C’。
(3)限制性内切酶酶切PCR产物PCR扩增产物分别用DNA纯化试剂盒(QIAGENE，Germany)纯化，用紫外分光光度计测其OD260。分别用限制性内切酶BsaMI和BstXI酶切PCR产物。反应条件如下反应一CMV2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlBsaMI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl无菌水 20-X总体积 20μl其中限制性内切酶缓冲液60mM Tris-HCl(PH7.9)，1.5M NaCl，60mMMgCl2，10mM DTT；X表示除了无菌水以外的其它溶液体积之和，下同。
65℃反应3小时。
反应二GFP2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlBsaMI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl无菌水 20-X总体积 20μl65℃反应3小时后，加入BstXI 1μl(10u/μl)，50℃反应3小时。
反应三BGH2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlBstXI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl无菌水 20-X
总体积 20μl50℃反应3小时。
酶切后得到启动子的待连接片段A”、目的基因的待连接片段B”和终止子的待连接片段C”。
(4)酶切产物的纯化酶切产物A”、B”、C”分别用凝胶纯化试剂盒(QIAGENE，Germany)纯化，操作按说明书进行。用紫外分光光度计测其OD260。
(5)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)A”100ng、B”115.5ng、C”39.11ng(即摩尔比1∶1∶1)混合，加入T4 DNA连接酶1μl(3unit/μl)，室温下反应30分钟，得到连接产物线性表达载体D。
(6)以连接产物为模板进行PCR扩增连接产物 2μl10X PCR缓冲液 5μl25mM Mgcl23μl10mM dNTP 1μlCMV正向引物(100ng/μl)1μlBGH反向引物(100ng/μl)1μlTaq酶(3unit/μl) 1μl无菌水37μl总体积50μl以上混合物以94℃初始变性5分钟，随后以94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，即得到扩增后的线性表达载体。
在该实施例中，酶切产物的纯化步骤(4)不是必需的，但是纯化后去除反应体系中的杂质成分，使得连接反应更易进行。
实施例2、构建含CMV(巨细胞病毒)启动子片段A，GFP(绿色荧光蛋白)片段B，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)C的线性表达载体在该实施例中，相邻片段连接处的引物包含非对称性切割的限制性内切酶Alw NI和DrdI的识别序列，并且无需第二次PCR扩增即可得到线性表达载体。其构建过程如图1所示(1)设计引物引物1、2，1’、2’，和3、4构建原理同实施例1。
其中引物1和引物2中的酶识别序列是酶Alw NI的识别序列，引物1’和引物2’中的酶识别序列是酶DrdI的识别序列。引物序列见下表。
表2
其中小写字母是和扩增片段互补的DNA序列，大写字母包含酶Alw NI或DrdI识别的序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段方法同实施例1。
(3)限制性内切酶酶切PCR产物PCR扩增产物分别用DNA纯化试剂盒(QIAGENE，Germany)纯化，用紫外分光光度计测其OD260。分别用限制性内切酶AlwNI和DrdI酶切消化PCR产物。反应条件如下反应一CMV 2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlAlw NI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10μg/μl0.2μl无菌水 20-X总体积 20μl37℃反应3小时。
反应二GFP 2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlAlw NI(20units/μl) 0.5μlDrdI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10ug/μl 0.2μl无菌水 20-X总体积 20μl37℃反应3小时后。
反应三BGH 2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μl
DrdI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10μg/μl0.2μl无菌水 20-X总体积 20μl37℃反应3小时。酶切后得到启动子的待连接片段A”、目的基因的待连接片段B”和终止子的待连接片段C”。
(4)酶切产物的纯化方法同实施例1。
(5)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)A”500ng，B”578.75ng，C”275ng(即摩尔比1∶1∶1)，用DNA连接试剂盒(Takara) 在室温下连接，先加入等体积溶液II混匀，再加入2倍体积的溶液I混匀5-10分钟(溶液I和溶液II为试剂盒中自带溶液)，即得到线性表达载体D，可直接用于转染受体细胞。
实施例3、构建含CMV(巨细胞病毒)启动子片段A，GFP(绿色荧光蛋白)片段B，BGHpA(多聚腺苷酸)片段(包含终止子)C的线性表达载体在该实施例中，相邻片段连接处的引物包含非对称性切割的限制性内切酶AccI和MwoI的识别序列，并且酶切后的产物A”、B”和C”无需纯化即可用于连接反应。其构建过程如图1所示(1)设计引物引物1、2，1’、2’，和3、4构建原理同实施例1。
其中引物1和引物2中的酶识别序列是酶AccI的识别序列，引物1’和引物2’中的酶识别序列是酶MwoI的识别序列。引物序列见下表。
表3
其中小写字母是和扩增片段互补的DNA序列，大写字母包含酶AccI或MwoI识别的序列。
(2)PCR扩增三个DNA片段方法同实施例1。
(3)限制性内切酶酶切PCR产物分别用限制性内切酶AccI和MwoI酶切PCR产物。反应条件如下反应一CMV2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlAccI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10ug/μl0.2μl无菌水 20-X总体积 20μl37℃反应3小时。
反应二
GFP 2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlAccI(20units/μl) 0.5μlMwoI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl无菌水20-X总体积20μl37℃反应3小时后，加入MwoI 1μl(10u/μl)，60℃反应3小时。
反应三BGH 2μg10X限制性内切酶缓冲液 2μlMwoI(20units/μl) 0.5μl乙酰化BSA，10μg/μl 0.2μl无菌水20-X总体积20μl60℃反应3小时。
(4)连接反应得到(CMV+GFP+BGHpA)方法同实施例2。
用本发明构建线性表达载体使用的酶价格低廉，其中6种非对称性切割的限制性内切酶售价约为1人民币/单位，T4DNA连接酶售价约为2人民币/单位，进行一个反应所消耗的试剂大约为30-50元人民币(包括所用的酶、各种溶液)；现有技术中Topo Tools一个反应约200元人民币，由此可见利用本发明提供的构建线性表达载体的方法可以作为一种常用技术在科研和生产中广泛应用。
权利要求
1.一种构建线性表达载体的方法，其步骤包括(1)设计引物a.相邻的DNA片段待连接处，设计由引物1和引物2构成的一对引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶识别的DNA序列，并且引物1和引物2中的酶识别序列是同一个内切酶识别的序列；b.启动子正向引物和终止子反向引物仅包括和扩增片段互补的DNA序列；(2)将上述引物1和引物2分别加入到相应的DNA片段中，并分别进行PCR扩增反应，得到扩增产物；(3)分别纯化步骤(2)得到的扩增产物，并用非对称性切割的限制性内切酶酶切片段中的酶识别序列；(4)将酶切后的待连接片段混合，加入DNA连结酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体。
2.按权利要求1所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)之后，还包括将酶切后的待连接片段进行纯化。
3.按权利要求1所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)之后，还包括将所得线性表达载体进行PCR扩增。
4.按权利要求2所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)之后，还包括将所得线性表达载体进行PCR扩增。
5.按权利要求1-4中的任何一项所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中使用的非对称性切割的限制性内切酶为BsaMI、BstXI、Alw NI、DrdI、AccI和MwoI中的任两种。
6.按权利要求1-4中的任何一项所述的线性表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)连接反应所使用的酶为T4 DNA连接酶。
全文摘要
本发明涉及一种线性表达载体的构建方法，具体地，本发明提供了一种利用非对称性切割的限制性内切酶来构建线性表达载体的方法。该方法能大大降低线性表达载体的构建成本，使这种载体的构建方法能在科研和生产中得到广泛应用。
文档编号C12N9/00GK1414098SQ0211693
公开日2003年4月30日 申请日期2002年4月26日 优先权日2002年4月26日
发明者黄大卫, 辛文 申请人:中国科学院动物研究所