专利名称：用于诊断地中海贫血的dna芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断地中海贫血的DNA芯片，具体地说涉及用于诊断α-型和β-型地中海贫血的DNA芯片。
本发明还涉及诊断地中海贫血的DNA芯片的制备方法。
本发明还涉及用于扩增待检样品中DNA的PCR引物；
本发明还涉及用于诊断地中海贫血的试剂盒以及检测待检样品中是否存在地中海贫血的相关基因的方法。
背景技术：
地中海贫血(也称地贫)是一种常见的遗传性疾病，世界各地都有发作，最多见于西自地中海区域，中经土耳其、中东各国，东至东南亚和我国南部。在我国β-型地中海贫血最多见于西南和华南一带，包括云南、贵州、四川、广西、广东、海南各省区，在苗、瑶、黎、壮等少数民族中尤为多见，其次为长江以南各地，北方很少见。据全国血红蛋白病协作组调查，β-型地中海贫血发生率为0.67％。α-型地中海贫血在我国高发于西南及华南一带，全国协作组调查国内α-地中海贫血发生率为2.93％，是我国南方最常见、危害最为严重地遗传病种之一。地中海贫血症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年前夭折甚至死胎。
由于该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精神和经济压力。然而目前尚缺乏有效的治疗措施，因此做好遗传咨询和产前诊断，阻止该类病重症患儿的出生，对有效监控此类疾病，提高人口素质有重要意义。
由于地中海贫血的临床症状具有较大的变异性，轻型患者及携带者的检测易出现漏检。随着地中海贫血症分子遗传学研究的进展，使基因诊断成为可能。其中α-地中海贫血的基因缺陷主要为缺失型突变，当α-球蛋白链基因中的1条或多条丧失功能时就会引发α-型地中海贫血症，在中国地区普遍发生的3种α-地中海贫血症分别是由α基因上-α3.7，-α4.2和-SEA的片段缺失引起的。β-地中海贫血的基因只有一对，基因缺陷绝大多数属于非缺失型，即由于基因点突变造成β-球蛋白合成异常。β-地中海贫血症具有种族特异性，表现为许多突变仅发生在某个别种族中，而且几乎每一种族都具有几种常见的突变。到1998年，在中国β-地中海贫血群体中已发现23种不同的突变类型(见表1)。其中5种突变在中国人群中表现出较高的发病频率，约占总发生率的90％以上。大陆各省份共发现22种(其中3种仅见于少数民族)，台湾共发现18种(其中4种仅现于台湾)。
α-地中海贫血症的传统基因诊断技术主要采用Southern印迹杂交方法，技术准确可靠，但操作繁琐，而且依赖用同位素，难以大面积推广。另外还有PCR扩增技术，这种方法简单快速，但容易出现假阳性。β-地中海贫血症常用诊断技术有反向点杂交(RDB)、PCR-SSCP、PCR-异源双链分析、PCR-DGGE、PCR-ARMS、PCR-ASO、PCR-RFLP以及PCR-错配化学裂解等技术。
DNA芯片技术适用于基因缺陷的检测，一个芯片能同时容纳许多个探针，和PCR扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。
DNA芯片技术是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将已知DNA寡核苷酸探针排列在玻片或硅片上，然后将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上就可以做到一次实验检测多个基因。
DNA芯片技术的设想可以追溯到90年代初，美国Affymetrix公司首先开始这方面的研究(http//www.affymetrix.com)。由于这项技术的广泛的应用前景以及巨大的经济效益，目前美国的斯坦福大学、美国橡树岭国家实验室、德国的自动化公司(http//www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/～autom)、Incyte商业公司和Hyseq公司都在进行全力研究，竞争市场份额。国内也有单位开始跟进了DNA芯片的研究。由于该技术需要高精度的DNA探针点样设备或光刻合成设备和专用的激光扫描检测装置，尚未普及应用。
临床上，遗传病诊断与检测、细菌及病毒的检测、白细胞配型是DNA芯片应用的最具潜力的方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于临床诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片，其利用现有的激光扫描仪，可以用于地中海贫血疾病的诊断并可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。
本发明的另一目的在于提供诊断地中海贫血的DNA芯片的制备方法；
本发明的再一目的是提供用于扩增待检样品中DNA的PCR引物；
本发明的又一目的是提供用于诊断地中海贫血的试剂盒以及检测待检样品中是否存在地中海贫血相关基因的方法。
根据本发明的一方面，用于诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，用于该DNA芯片的基底可以是任何适于固定DNA探针的载体，例如，市售的EMS Electronic Microscopy Science CompanyLtd.生产的聚-L-赖氨酸包被并硅烷化的显微镜玻片，固定于基底上的探针则根据迄今已知的α-和β-球蛋白突变基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的DNA探针。通过点样装置将探针按照一定规律排列在载体玻片或硅片上，经过固定和相关处理后就制成了DNA芯片。本发明的DNA芯片上可以仅包含针对α-球蛋白缺失基因设计的用于检测α-型地贫的DNA探针，或仅包含针对β-球蛋白突变基因设计的用于检测β-型地贫的DNA探针，也可以同时包含检测α-型和β-型地贫的DNA探针。
根据本发明的另一方面，提供一种用于诊断地贫的DNA芯片的制备方法，该方法包括合成探针、将合成的探针及相应的对照组DNA按一定的顺序点样并排列于基底上、将点样后的探针DNA固定于基底上而制备得到DNA芯片。
为了使DNA探针能有效地固定在玻片上，通常采用两种方法，第一种，在DNA探针合成后进行DNA探针5’末端活性基团的标记，这些活性基团有氨基、硫基等，固定DNA的玻片也需要进行活化处理，使之表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价键。在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用消毒双蒸水稀释至200pmol/ul和等量1.0M1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)和1.0MN-Hydroxysuccinimide(NHS)混合，进行点样。第二种，将DNA探针与点样缓冲液混合，用玻片点样机点在玻片上，80℃加热1到4小时，使用UVStratalinker 2400紫外交联仪在60mJ/cm2强度下进行紫外交联，然后用终止液终止反应。
根据本发明的再一方面，提供用于扩增待检样品中DNA的PCR引物，该引物根据α-型和β-型地贫症基因突变的序列资料设计，其中α-型地贫的引物包括4对引物，检测β-型地贫的引物包括2对引物。
在对待检样品进行PCR扩增后，为进行荧光标记，本发明进一步设计了延伸引物，延伸引物的Tm值为50-65℃，3’端与突变位点相邻。与β-地中海贫血症基因的20种点突变类型及α-地中海贫血症3种缺失突变类型相对应设计了20条和4条引物。
根据本发明的又一方面，提供了用于检测地中海贫血症的试剂盒，其中包含用于诊断地中海贫血的本发明的DAN芯片以及用于扩增待检样品中DNA的本发明的PCR引物。
本发明同时还提供了检测待检样品中是否存在地贫相关基因的方法，通过将待检样品用本发明特异性引物进行PCR扩增后，再用延伸因为对扩增产物进行荧光标记，将标记后的产物与诊断地贫的本发明DNA芯片进行杂交，然后用相应的仪器读取信号并对信号进行分析获得结果。
本发明的用于地中海贫血疾病诊断的DNA芯片，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。
附图的简要说明
图1为本发明的DNA芯片的检测结果图；其中扫描得到的杂交信号a图和b图经图像处理得到图表c，图表c代表玻片上不同的点的突变型和野生型信号强度的比值。根据图表c，-28号位点突变型和野生型信号强度比值特别高，说明样品的-28位点处发生突变。a图和b图扫描图像上黄色方框标出了代表-28突变的探针位置。
发明的详细描述
实施例1用于检测α-型和β-型地贫的DNA芯片的制备
1、探针的设计
表1为23种β-地中海贫血症中常见的基因突变类型和位点
表1β-球蛋白基因中常见的突变
(A)在中国人群中最常见的5个等位基因突变
(B)在南亚人群中发现的18个最常见的β-球蛋白基因突变
为检测α-和β-地中海贫血症常见的突变类型，共设计了24条探针及阳性对照，探针的长度一般在15-30个碱基左右，这些探针的DNA序列如表2和表3。试验探针估计可覆盖地中海贫血症超过98％的发生率。在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用1M NHS，1M EDC混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
表2α-球蛋白基因的探针DNA序列
在上表中包括了4组探针序列，即UP-ALPHA2-R、UP-3.7/50.2-R、8866和UP-SEA-R，每组分别包括12条探针，覆盖了α-球蛋白可能的突变位点，在选择探针时，可以从每组中任选一条，但在一个芯片中应同时包括来自四组的4条探针。表3不同长度的β-球蛋白基因21个点突变位点探针DNA序列
在上表中共包括20组探针，每组探针分别包括8条可任选的序列，在检测β-地贫的芯片中应同时包含从20组的每一组中选择的一个序列。此外，为了增加适宜的碳链长度，在表3的各序列5’末端还可以修饰了15～30个dT，形成连拉臂。这些间隔的连接臂将增加探针与玻片表面的距离，有利于探针与被检测DNA的杂交体的形成。
2、DNA探针的点样和固定
1)探针的点样和排列
在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用1M NHS，1M EDC混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
2)DNA探针的固定方法
技术领域：
本发明采用两种方法将探针固定在玻片表面第一种，通过活性基团的标记，包括氨基、巯基的标记。固定DNA的玻片也需要进行活化处理。通常进行活化处理的表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价键。第二种，首先将DNA探针与点样缓冲液混合后点样，80℃加热1～4小时，然后使用UV Stratalinker 2400紫外交联仪在60mJ/cm2强度下进行紫外交联，最后用终止液终止反应。
实施例2用于扩增待检样品中DNA的引物的设计及检测方法
1、用于扩增待检样品中DNA的PCR引物的设计
根据α-地中海贫血症基因突变的序列资料设计了4对引物用于检测。这4对引物的序列信息以及在基因簇上的位置见表4，四对引物分别为第一对上游引物A2/3.7-F、下游引物A2-R；第二对上游引物A2/3.7-F、下游A3.7-R；第三对上游引物A4.2-F、下游引物A4.2-R；第四对上游引物SEA-F、下SEA-F游引物SEA-R；表4中的每一上游或下游引物均包括一组分别由8条引物组成的序列，在选择时，可以从一组引物中任选一个序列作为一个引物，但应同时包含来自八组的8个引物。每50μL反应体积包括了10ng基因组DNA、8个引物、10x buffer、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs、1x Q-solution和2.5UHotStarTaq DNA聚合酶。反应条件为96℃15min，98℃变性45s、60℃退火90sec、72℃延伸3min，共35个循环，最后一步72℃延伸15min。表4不同长度的α-球蛋白基因扩增引物的DNA序列
用两对特异性的、具有不同长度和Tm值的引物扩增出β-球蛋白基因的2个片段。引物的核酸序列见表5，其中第一对引物上游为HBB-1、下游为HBB-2；第二对引物上游为HBB-3、下游为HBB-4，表5中每组引物包括8条可任选的序列。每50μL反应体积包括了100-200ng基因组DNA、从4组引物中分别选择4个引物、10x buffer、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs和5UTaq DNA聚合酶。热循环反应条件为95℃ 2min，94℃变性30s、60℃退火30sec、72℃延伸30sec，共30个循环，最后一步72℃延伸5min。将PCR产物纯化和定量。表5不同长度的β-球蛋白基因扩增引物DNA序列2、PCR产物的延伸和荧光标记1)延伸引物的设计
延伸引物的Tm值为50-65℃，3’端与突变位点相邻。与α-地中海贫血症3种缺失突变类型及β-地中海贫血症基因的20种点突变类型相对应设计了4条和20条引物，见表6和表7。表6α-球蛋白基因的延伸引物DNA序列表7β-球蛋白基因点突变延伸引物的DNA序列5)PCR产物的荧光标记
在用Tris、MgCl2、延伸引物(分别从表6和/或表7的各组引物中任选一条序列，对于检测α-型地贫，延伸引物应包含分别来自表6中四组引物中的四条引物，对于检测β-型地贫，延伸引物应包含分别来自表7中20组引物中的20条引物)、DNA聚合酶、TAMRA-ddATP、TAMRA-ddCTP、Cy5-ddGTP和ROX-ddUTP配成的SBE溶液5μL中加入10μL PCR产物。SBE反应包括30个循环的变性(96℃ 30s)、退火(50℃ 30s)和延伸(60℃ 1min)。6)杂交
将5-10μL的荧光标记产物与杂交液(包含8×SSC、0.2mg/ml的鲑鱼精DNA和0.4％的SDS)混合，与固定在玻片上的探针杂交，盖上盖玻片，放入潮湿的杂交仓内50℃孵育4小时。然后将玻片用2×SSC、0.1％SDS洗一次，用2×SSC洗3次，再用0.2×SSC洗一次。将玻片1300rpm离心5分钟甩干，在ScanArray 4000扫描仪上进行扫描。扫描结果图例见图一a和b。7)检测
杂交信号检测可以通过专用激光芯片扫描仪进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基片的杂交信号的强弱，从而确定突变有没有发生。如图一c。
以上对本发明的实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，这些改变和变形均应属于本发明后附的权利要求所定义的范围。
SEQUENCE LISTING<110>亚能生物技术(深圳)有限公司<120>用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法<130>PI02952<160>504<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gggccctcct cccctcct18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2gggccctcct cccctccttg 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gggccctcct cccctccttg 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gggccctcct cccctccttg c21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5cccaacgggc cctcctcc18<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6cccaacgggc cctcctccc 19<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7cccaacgggc cctcctcccc 20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8cccaacgggc cctcctcccc t21<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>9ccctcctccc ctccttgca 19<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10ccctcctccc ctccttgcac 20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11ccctcctccc ctccttgcac c21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>12ccctcctccc ctccttgcac cg 22<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>13gcgaagtcca gctggaaa 18<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>14gcgaagtcca gctggaaaa 19<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15gcgaagtcca gctggaaaaa20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16gcgaagtcca gctggaaaaa c 21<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>17accgcgaagt ccagctgga 19<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18accgcgaagt ccagctggaa20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19accgcgaagt ccagctggaa a 21<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>20accgcgaagt ccagctggaa aa 22<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>21gagccaccgc gaagtcca 18<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>22gagccaccgc gaagtccag 19<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>23gagccaccgc gaagtccagc20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>24gagccaccgc gaagtccagc t 21<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>25ttcaggctgt gggcaga 17<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>26ttcaggctgt gggcagag 18<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>27ttcaggctgt gggcagagt19<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28ttcaggctgt gggcagagtc 20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29tccttcaggc tgtgggcaga 20<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>30tccttcaggc tgtgggcaga g 21<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>31tccttcaggc tgtgggcaga ga22<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>32tccttcaggc tgtgggcaga g 21<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>33ggctgtgggc agagtcaga19<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34ggctgtgggc agagtcagaa 20<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>35ggctgtgggc agagtcagaa a 21<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>36ggctgtgggc agagtcagaa ag22<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>37tcatcaccca ggcagcca 18<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>38tcatcaccca ggcagccac19<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>39tcatcaccca ggcagccaca 20<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40tcatcaccca ggcagccaca g 21<210>41<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>41tcatcaccca ggcagccaca gc 22<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>42cactcatcac ccaggcag 18<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>43cactcatcac ccaggcagc 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>44cactcatcac ccaggcagcc 20<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>45ggcagccaca gccatgaac 19<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>46ggcagccaca gccatgaaca 20<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>47ggcagccaca gccatgaaca c 21<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>48ggcagccaca gccatgaaca ca 22<210>49<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>49ctcctcagga gtcagg 16<210>50<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>50ctcctcagga gtcaggt17<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>51ctcctcagga gtcaggtg 18<210>52<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>52ctcctcagga gtcaggtgc 19<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>53ctcctcagga gtcaggtgca 20<210>54<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>54ctcctcagga gtcaggtgca c21<210>55<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>55ctcctcagga gtcaggtgca cc 22<210>56<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>56ctcctcagga gtcaggtgca cca 23<210>57<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>57tctgccgtta ctgc14<210>58<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>58tctgccgtta ctgcc 15<210>59<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>59tctgccgtta ctgccc 16<210>60<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>60tctgccgtta ctgccct 17<210>61<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>61tctgccgtta ctgccctg18<210>62<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>62tctgccgtta ctgccctgt 19<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>63tctgccgtta ctgccctgtg 20<210>64<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>64tctgccgtta ctgccctgtg g21<210>65<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>65ggtggggcaa gg 12<210>66<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>66ggtggggcaa ggt 13<210>67<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>67ggtggggcaa ggtg14<210>68<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>68ggtggggcaa ggtga 15<210>69<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>69ggtggggcaa ggtgaa 16<210>70<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>70ggtggggcaa ggtgaac 17<210>71<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>71ggtggggcaa ggtgaacg18<210>72<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>72ggtggggcaa ggtgaacgt 19<210>73<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>73aggtgaacgt ggatga 16<210>74<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>74aggtgaacgt ggatgaa 17<210>75<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>75aggtgaacgt ggatgaag18<210>76<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>76aggtgaacgt ggatgaagt 19<210>77<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>77aggtgaacgt ggatgaagtt 20<210>78<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>78aggtgaacgt ggatgaagtt g21<210>79<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>79aggtgaacgt ggatgaagtt gg 22<210>80<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>80aggtgaacgt ggatgaagtt ggt 23<210>81<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>81accaccaact tcatcc 16<210>82<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>82accaccaact tcatcca17<210>83<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>83accaccaact tcatccac 18<210>84<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>84accaccaact tcatccacg 19<210>85<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>85accaccaact tcatccacgt 20<210>86<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>86accaccaact tcatccacgt t 21<210>87<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>87accaccaact tcatccacgt tc 22<210>88<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>88accaccaact tcatccacgt tca 23<210>89<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>89gcccagggcc t 11<210>90<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>90gcccagggcc tc 12<210>91<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>91gcccagggcc tca13<210>92<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>92gcccagggcc tcac 14<210>93<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>93gcccagggcc tcacc 15<210>94<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>94gcccagggcc tcacca 16<210>95<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>95gcccagggcc tcaccac17<210>96<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>96gcccagggcc tcaccacc 18<210>97<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>97cagcctaagg gtggg 15<210>98<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>98cagcctaagg gtggga 16<210>99<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>99cagcctaagg gtgggaa17<210>100<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>100cagcctaagg gtgggaaa 18<210>101<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>101cagcctaagg gtgggaaaa 19<210>102<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>102cagcctaagg gtgggaaaat 20<210>103<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>103cagcctaagg gtgggaaaat a 21<210>104<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>104cagcctaagg gtgggaaaat ag 22<210>105<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>105aagggtagac caccag 16<210>106<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>106aagggtagac caccagc17<210>107<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>107aagggtagac caccagca 18<210>108<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>108aagggtagac caccagcag 19<210>109<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>109aagggtagac caccagcagc 20<210>110<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>110aagggtagac caccagcagc c 21<210>111<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>111aagggtagac caccagcagc ct 22<210>112<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>112aagggtagac caccagcagc cta 23<210>113<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>113aacctctggg tccaa 15<210>114<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>114aacctctggg tccaag 16<210>115<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>115aacctctggg tccaagg17<210>116<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>116aacctctggg tccaaggg 18<210>117<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>117aacctctggg tccaagggt 19<210>118<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>118aacctctggg tccaagggta 20<210>119<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>119aacctctggg tccaagggta g 21<210>120<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>120aacctctggg tccaagggtaga 22<210>121<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>121tcaaagaacc tctggg 16<210>122<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>122tcaaagaacc tctgggt17<210>123<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>123tcaaagaacc tctgggtc 18<210>124<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>124tcaaagaacc tctgggtcc 19<210>125<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>125tcaaagaacc tctgggtcca 20<210>126<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>126tcaaagaacc tctgggtcca a 21<210>127<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>127tcaaagaacc tctgggtcca ag 22<210>128<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>128tcaaagaacc tctgggtcca agg 23<210>129<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>129taaaggcacc gagca 15<210>130<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>130taaaggcacc gagcac 16<210>131<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>131taaaggcacc gagcact17<210>132<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>132taaaggcacc gagcactt 18<210>133<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>133taaaggcacc gagcacttt 19<210>134<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>134taaaggcacc gagcactttc 20<210>135<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>135taaaggcacc gagcactttc t 21<210>136<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>136taaaggcacc gagcactttc tt 22<210>137<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>137ttgtcacagt gcagct 16<210>138<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>138ttgtcacagt gcagctc17<210>139<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>139ttgtcacagt gcagctca 18<210>140<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>140ttgtcacagt gcagctcac 19<210>141<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>141ttgtcacagt gcagctcact 20<210>142<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>142ttgtcacagt gcagctcact c 21<210>143<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>143ttgtcacagt gcagctcact ca 22<210>144<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>144ttgtcacagt gcagctcact cag 23<210>145<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>145cccagccctg g 11<210>146<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>146cccagccctg gc 12<210>147<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>147cccagccctg gct13<210>148<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>148cccagccctg gctc 14<210>149<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>149cccagccctg gctcc15<210>150<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>150cccagccctg gctcct 16<210>151<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>151cccagccctg gctcctg 17<210>152<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>152cccagccctg gctcctgc 18<210>153<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>153aaagtcaggg cagagc 16<210>154<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>154aaagtcaggg cagagcc 17<210>155<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>155aaagtcaggg cagagcca 18<210>156<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>156aaagtcaggg cagagccat19<210>157<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>157aaagtcaggg cagagccatc 20<210>158<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>158aaagtcaggg cagagccatc t 21<210>159<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>159aaagtcaggg cagagccatc ta22<210>160<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>160aaagtcaggg cagagccatc tat 23<210>161<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>161tatgcccagc cct 13<210>162<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>162tatgcccagc cctg14<210>163<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>163tatgcccagc cctgg 15<210>164<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>164tatgcccagc cctggc 16<210>165<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>165tatgcccagc cctggct 17<210>166<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>166tatgcccagc cctggctc18<210>167<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>167tatgcccagc cctggctcc 19<210>168<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>168tatgcccagc cctggctcct 20<210>169<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>169ctgcccaggg cc 12<210>170<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>170ctgcccaggg cct 13<210>171<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>171ctgcccaggg cctc14<210>172<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>172ctgcccaggg cctca 15<210>173<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>173ctgcccaggg cctcac 16<210>174<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>174ctgcccaggg cctcacc 17<210>175<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>175ctgcccaggg cctcacca 18<210>176<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>176ctgcccaggg cctcaccac 19<210>177<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>177caacctgccc agg 13<210>178<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>178caacctgccc aggg 14<210>179<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>179caacctgccc agggc 15<210>180<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>180caacctgccc agggcc16<210>181<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>181caacctgccc agggcct 17<210>182<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>182caacctgccc agggcctc 18<210>183<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>183caacctgccc agggcctca 19<210>184<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>184caacctgccc agggcctcac20<210>185<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>185cctgaagttc tcaggat 17<210>186<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>186cctgaagttc tcaggatc 18<210>187<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>187cctgaagttc tcaggatcc 19<210>188<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>188cctgaagttc tcaggatcca20<210>189<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>189cctgaagttc tcaggatcca c 21<210>190<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>190cctgaagttc tcaggatcca cg22<210>191<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>191cctgaagttc tcaggatcca cgt 23<210>192<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>192cctgaagttc tcaggatcca cgtg 24<210>193<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>193tctatgggac ccttga 16<210>194<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>194tctatgggac ccttgat 17<210>195<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>195tctatgggac ccttgatg 18<210>196<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>196tctatgggac ccttgatgt19<210>197<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>197tctatgggac ccttgatgtt 20<210>198<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>198tctatgggac ccttgatgtt t 21<210>199<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>199tctatgggac ccttgatgtt tt22<210>200<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>200tctatgggac ccttgatgtt ttc 23<210>201<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>201aatagcaata tttctgcata taaa 24<210>202<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>202aatagcaata tttctgcata taaat25<210>203<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>203aatagcaata tttctgcata taaata 26<210>204<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>204aatagcaata tttctgcata taaatat 27<210>205<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>205aatagcaata tttctgcata taaatatt 28<210>206<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>206aatagcaata tttctgcata taaatattt29<210>207<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>207aatagcaata tttctgcata taaatatttc 30<210>208<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>208aatagcaata tttctgcata taaatatttc t 31<210>209<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>(1)..(18)<223><400>209ccctcgccaa gtccaccc18<210>210<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>210cccctcgcca agtccaccc 19<210>211<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>211ctggactcct ggacctccca 20<210>212<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>212ctggactcct ggacctccca c 21<210>213<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>213ctggactcct ggacctccca cc 22<210>214<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>214actggactcc tggacctccc ac 22<210>215<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>215actggactcc tggacctccc acc 23<210>216<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>216cactggactc ctggacctcc cac 23<210>217<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>217tcaaagacca ggaagggccg 20<210>218<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>218ttcaaagacc aggaagggcc g 21 <210>219<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>219attcaaagac caggaagggc cg22<210>220<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>220attcaaagac caggaagggc cgg 23<210>221<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>221agaccaggaa gggccggtg19<210>222<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>222aagaccagga agggccggtg 20<210>223<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>223aaagaccagg aagggccggt g 21<210>224<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>224caaagaccag gaagggccgg t 21<210>225<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>225cctcaaagca ctctagggtc ca22<210>226<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>226cctcaaagca ctctagggtc cag 23<210>227<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>227cctcaaagca ctctagggtc cagc 24<210>228<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>228aaagcactct agggtccagc g 21<210>229<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>229caaagcactc tagggtccag cg 22<210>230<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>230tcaaagcact ctagggtcca gcg23<210>231<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>231ctcaaagcac tctagggtcc agcg 24<210>232<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>232cctcaaagca ctctagggtc cagcg 25<210>233<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>233ggtttaccca tgtggtgcct c 21<210>234<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>234cggtttaccc atgtggtgcc tc 22<210>235<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>235catgtggtgc ctccatggac20<210>236<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>236ccatgtggtg cctccatgga c 21<210>237<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>237cccatgtggt gcctccatg 19<210>238<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>238cccatgtggt gcctccatgg20<210>239<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>239cttcccatgt ggtgcctcca tg 22<210>240<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>240ccttcccatg tggtgcctcc atg23<210>241<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>241cttcccccgt tggatcttc 19<210>242<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>242gcttcccccg ttggatcttc 20<210>243<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>243ccagcttagc aatgcttccc c 21<210>244<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>244gaccagctta gcaatgcttc ccc 23<210>245<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>245gaccagctta gcaatgcttc cc 22<210>246<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>246ccgttggatc ttctcatttc cc 22<210>247<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>247cccgttggat cttctcattt ccc 23<210>248<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>248ccccgttgga tcttctcatt tccc24<210>249<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>249cggagcgatc tgggc 15<210>250<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>250ggagcgatct gggctc 16<210>251<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>251cggagcgatc tgggctc17<210>252<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>252cggagcgatc tgggctctg 19<210>253<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>253cgatctgggc tctgtgttc 19<210>254<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>254cgatctgggc tctgtgttct c 21<210>255<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>255gcgatctggg ctctgtgttc 20<210>256<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>256gcgatctggg ctctgtgttc tc22<210>257<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>257cccacgttgt gttcatgg 18<210>258<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>258gcccacgttg tgttcatgg19<210>259<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>259ccacgttgtg ttcatggctg 20<210>260<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>260agcccacgtt gtgttcatgg 20<210>261<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>261gcccacgttg tgttcatggc 20<210>262<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>262ccacgttgtg ttcatggctg tg22<210>263<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>263agcccacgtt gtgttcatgg c 21<210>264<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>264aagcccacgt tgtgttcatg gc22<210>265<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>265aggaggggag gagg 14<210>266<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>266aaggagggga ggagg15<210>267<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>267caaggagggg aggagg 16<210>268<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>268gcaaggaggg gaggagg 17<210>269<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>269ggaggagggc cc 12<210>270<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>270gggaggaggg ccc 13<210>271<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>271ggggaggagg gccc14<210>272<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>272aggggaggag ggccc 15<210>273<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>273tgcaaggagg ggag14<210>274<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>274gtgcaaggag gggag 15<210>275<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>275ggtgcaagga ggggag 16<210>276<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>276cggtgcaagg aggggag 17<210>277<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>277tttccagctg gacttc 16<210>278<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>278ttttccagct ggacttc 17<210>279<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>279tttttccagc tggacttc18<210>280<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>280gtttttccag ctggacttc 19<210>281<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>281tccagctgga cttcgc 16<210>282<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>282ttccagctgg acttcgc 17<210>283<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>283tttccagctg gacttcgc18<210>284<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>284ttttccagct ggacttcgc 19<210>285<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>285tggacttcgc ggtg14<210>286<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>286ctggacttcg cggtg 15<210>287<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>287gctggacttc gcggtg 16<210>288<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>288agctggactt cgcggtg 17<210>289<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>289tctgcccaca gcct14<210>290<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>290ctctgcccac agcct 15<210>291<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>291actctgccca cagcct 16<210>292<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>292gactctgccc acagcc t17<210>293<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>293tgcccacagc ctgaa 15<210>294<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>294ctgcccacag cctgaa 16<210>295<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>295tctgcccaca gcctgaa 17<210>296<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>296ctctgcccac agcctgaa 18<210>297<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>297tctgactctg cccaca 16<210>298<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>298ttctgactct gcccaca17<210>299<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>299tttctgactc tgcccaca 18<210>300<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>300ctttctgact ctgcccaca 19<210>301<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>301tggctgcctg ggt13<210>302<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>302gtggctgcct gggt 14<210>303<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>303tgtggctgcc tgggt 15<210>304<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>304ctgtggctgc ctgggt 16<210>305<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>305gctgtggctg cctgggt17<210>306<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>306ctgcctgggt gatga 15<210>307<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>307gctgcctggg tgatga 16<210>308<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>308ggctgcctgg gtgatga17<210>309<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>309gttcatggct gtggct 16<210>310<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>310tgttcatggc tgtggct17<210>311<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>311gtgttcatgg ctgtggct 18<210>312<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>312tgtgttcatg gctgtggct 19<210>313<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>313gggttggcca atctactcc 19<210>314<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>314gggttggcca atctactccc 20<210>315<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>315agggttgcca atctactcc 19<210>316<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>316tagggttggc caatctactc c 21<210>317<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>317ctagggttgg ccaatctact cc 22<210>318<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>318cctagggttg gccaatctac tc 22<210>319<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>319ccctagggtt ggccaatcta c 21<210>320<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>320ccctagggtt ggccaatcta ct 22<210>321<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>321acgatcctga gacttccaca c 21<210>322<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>322acgatcctga gacttccaca ct 22<210>323<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>323aacgatcctg agacttccac a 21<210>324<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>324aacgatcctg agacttccac ac22<210>325<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>325aaacgatcct gagacttcca ca22<210>326<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>326aaaacgatcc tgagacttcc ac22<210>327<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>327aaaacgatcc tgagacttcc aca 23<210>328<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>328taaaacgatc ctgagacttc cac 23<210>329<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>329catgcctctt tgcaccattc 20<210>330<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>330catgcctctt tgcaccattc t 21<210>331<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>331tgcctctttg caccattct19<210>332<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>332atgcctcttt gcaccattct 20<210>333<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>333tgcctctttg caccattcta 20<210>334<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>334tgcctctttg caccattcta a 21<210>335<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>335atgcctcttt gcaccattct a 21<210>336<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>336atgcctcttt gcaccattct aa 22<210>337<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>337tgctcaaggc ccttcataat 20<210>338<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>338atgctcaagg cccttcataa t21<210>339<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>339gatgctcaag gcccttcata at 22<210>340<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>340agatgctcaa ggcccttcat aat 23<210>341<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>341tgctcaaggc ccttcataat 20<210>342<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>342tgctcaaggc ccttcataat a21<210>343<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>343atgctcaagg cccttcataa ta 22<210>344<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>344atgctcaagg cccttcataa tat 23<210>345<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>345cctgactcct gaggag 16<210>346<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>346acctgactcc tgaggag 17<210>347<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>347cacctgactc ctgaggag18<210>348<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>348gcacctgact cctgaggag 19<210>349<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>349tgcacctgac tcctgaggag 20<210>350<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>350gtgcacctga ctcctgagga g21<210>351<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>351ggtgcacctg actcctgagg ag 22<210>352<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>352tggtgcacct gactcctgag gag 23<210>353<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>353gcagtaacgg caga14<210>354<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>354ggcagtaacg gcaga 15<210>355<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>355gggcagtaac ggcaga 16<210>356<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>356agggcagtaa cggcaga 17<210>357<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>357cagggcagta acggcaga18<210>358<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>358acagggcagt aacggcaga 19<210>359<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>359cacagggcag taacggcaga 20<210>360<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>360ccacagggca gtaacggcag a21<210>361<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>361ccttgcccca cc 12<210>362<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>362accttgcccc acc 13<210>363<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>363caccttgccc cacc 14<210>364<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>364tcaccttgcc ccacc 15<210>365<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>365ttcaccttgc cccacc 16<210>366<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>366gttcaccttg ccccacc17<210>367<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>367cgttcacctt gccccacc 18<210>368<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>368acgttcacct tgccccacc 19<210>369<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>369tcatccacgt tcacct 16<210>370<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>370ttcatccacg ttcacct17<210>371<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>371cttcatccac gttcacct 18<210>372<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>372acttcatcca cgttcacct 19<210>373<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>373aacttcatcc acgttcacct 20<210>374<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>374caacttcatc cacgttcacc t 21<210>375<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>375ccaacttcat ccacgttcac ct 22<210>376<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>376accaacttca tccacgttca cct 23<210>377<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>377ggatgaagtt ggtggt 16<210>378<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>378tggatgaagt tggtggt 17<210>379<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>379gtggatgaag ttggtggt18<210>380<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>380cgtggatgaa gttggtggt 19<210>381<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>381acgtggatga agttggtggt 20<210>382<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>382aacgtggatg aagttggtgg t21<210>383<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>383gaacgtggat gaagttggtg gt 22<210>384<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>384tgaacgtgga tgaagttggt ggt 23<210>385<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>385aggccctggg c 11<210>386<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>386gaggccctgg gc 12<210>387<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>387tgaggccctg ggc 13<210>388<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>388gtgaggccct gggc14<210>389<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>389ggtgaggccc tgggc 15<210>390<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>390tggtgaggcc ctgggc 16<210>391<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>391gtggtgaggc cctgggc17<210>392<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>392ggtggtgagg ccctgggc 18<210>393<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>393cccaccctta ggctg 15<210>394<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>394tcccaccctt aggctg 16<210>395<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>395ttcccaccct taggctg17<210>396<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>396tttcccaccc ttaggctg 18<210>397<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>397ttttcccacc cttaggctg 19<210>398<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>398attttcccac ccttaggctg 20<210>399<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>399tattttccca cccttaggct g 21<210>400<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>400ctattttccc acccttaggc tg 22<210>401<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>401ctggtggtct accctt 16<210>402<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>402gctggtggtc taccctt17<210>403<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>403tgctggtggt ctaccctt 18<210>404<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>404ctgctggtgg tctaccctt19<210>405<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>405gctgctggtg gtctaccctt 20<210>406<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>406ggctgctggt ggtctaccct t 21<210>407<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>407aggctgctgg tggtctaccc tt22<210>408<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>408taggctgctg gtggtctacc ctt 23<210>409<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>409ttggacccag aggtt15<210>410<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>410cttggaccca gaggtt 16<210>411<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>411ccttggaccc agaggtt 17<210>412<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>412cccttggacc cagaggtt 18<210>413<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>413acccttggac ccagaggtt19<210>414<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>414tacccttgga cccagaggtt 20<210>415<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>415ctacccttgg acccagaggt t 21<210>416<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>416tctacccttg gacccagagg tt22<210>417<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>417cccagaggtt ctttga 16<210>418<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>418acccagaggt tctttga 17<210>419<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>419gacccagagg ttctttga 18<210>420<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>420ggacccagag gttctttga19<210>421<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>421tggacccaga ggttctttga 20<210>422<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>422ttggacccag aggttctttg a 21<210>423<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>423cttggaccca gaggttcttt ga22<210>424<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>424ccttggaccc agaggttctt tga 23<210>425<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>425tgctcggtgc cttta15<210>426<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>426gtgctcggtg ccttta 16<210>427<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>427agtgctcggt gccttta 17<210>428<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>428aagtgctcgg tgccttta 18<210>429<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>429aaagtgctcg gtgccttta19<210>430<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>430gaaagtgctc ggtgccttta 20<210>431<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>431agaaagtgct cggtgccttt a21<210>432<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>432aagaaagtgc tcggtgcctt ta 22<210>433<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>433agctgcactg tgacaa 16<210>434<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>434gagctgcact gtgacaa 17<210>435<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>435tgagctgcac tgtgacaa18<210>436<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>436gtgagctgca ctgtgacaa 19<210>437<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>437agtgagctgc actgtgacaa 20<210>438<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>438gagtgagctg cactgtgaca a21<210>439<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>439tgagtgagct gcactgtgac aa 22<210>440<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>440ctgagtgagc tgcactgtga caa 23<210>441<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>441ccagggctgg g 11<210>442<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>442gccagggctg gg 12<210>443<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>443agccagggct ggg 13<210>444<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>444gagccagggc tggg 14<210>445<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>445ggagccaggg ctggg15<210>446<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>446aggagccagg gctggg 16<210>447<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>447caggagccag ggctggg 17<210>448<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>448gcaggagcca gggctggg 18<210>449<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>449gctctgccct gacttt 16<210>450<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>450ggctctgccc tgacttt 17<210>451<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>451tggctctgcc ctgacttt 18<210>452<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>452atggctctgc cctgacttt19<210>453<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>453gatggctctg ccctgacttt 20<210>454<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>454agatggctct gccctgactt t 21<210>455<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>455tagatggctc tgccctgact tt22<210>456<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>456atagatggct ctgccctgac ttt 23<210>457<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>457agggctgggc ata 13<210>458<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>458cagggctggg cata14<210>459<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>459ccagggctgg gcata 15<210>460<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>460gccagggctg ggcata 16<210>461<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>461agccagggct gggcata 17<210>462<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>462gagccagggc tgggcata18<210>463<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>463ggagccaggg ctgggcata 19<210>464<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>464aggagccagg gctgggcata 20<210>465<211>12<212>DNA<213>人工序列<400>465ggccctgggc ag 12<210>466<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>466aggccctggg cag 13<210>467<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>467gaggccctgg gcag14<210>468<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>468tgaggccctg ggcag 15<210>469<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>469gtgaggccct gggcag 16<210>470<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>470ggtgaggccc tgggcag 17<210>471<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>471tggtgaggcc ctgggcag18<210>472<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>472gtggtgaggc cctgggcag 19<210>473<211>13<212>DNA<213>人工序列<400>473cctgggcagg ttg 13<210>474<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>474ccctgggcag gttg14<210>475<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>475gccctgggca ggttg 15<210>476<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>476ggccctgggc aggttg 16<210>477<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>477aggccctggg caggttg 17<210>478<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>478gaggccctgg gcaggttg18<210>479<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>479tgaggccctg ggcaggttg 19<210>480<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>480gtgaggccct gggcaggttg 20<210>481<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>481atcctgagaa cttcagg 17<210>482<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>482gatcctgaga acttcagg18<210>483<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>483ggatcctgag aacttcagg 19<210>484<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>484tggatcctga gaacttcagg 20<210>485<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>485gtggatcctg agaacttcag g 21<210>486<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>486cgtggatcct gagaacttca gg22<210>487<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>487acgtggatcc tgagaacttc agg 23<210>488<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>488cacgtggatc ctgagaactt cagg 24<210>489<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>489tcaagggtcc cataga 16<210>490<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>490atcaagggtc ccataga 17<210>491<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>491catcaagggt cccataga 18<210>492<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>492acatcaaggg tcccataga19<210>493<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>493aacatcaagg gtcccataga 20<210>494<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>494aaacatcaag ggtcccatag a 21<210>495<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>495aaaacatcaa gggtcccata ga22<210>496<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>496gaaaacatca agggtcccat aga 23<210>497<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>497tttatatgca gaaatattgc tatt 24<210>498<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>498atttatatgc agaaatattg ctatt 25<210>499<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>499tatttatatg cagaaatatt gctatt26<210>500<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>500atatttatat gcagaaatat tgctatt 27<210>501<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>501aatatttata tgcagaaata ttgctatt 28<210>502<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>502aaatatttat atgcagaaat attgctatt 29<210>503<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>503gaaatattta tatgcagaaa tattgctatt30<210>504<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>504agaaatattt atatgcagaa atattgctat t 3权利要求
1、一种用于诊断地中海贫血的DNA芯片，包括
一基底；以及
固定于所述基底上的探针；其特征在于
所述探针为针对α-和/或β-球蛋白缺失或突变基因的特异性探针。
2、根据权利要求1所述的DNA芯片，其中所述探针为α-球蛋白缺失基因的特异性探针。
3、根据权利要求2所述的DNA芯片，其中所述特异性探针包括选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.12中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.36中的至少一个序列的DNA和选自SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.48中的至少一个序列的DNA。
4、根据权利要求1所述的DNA芯片，其中所述探针为β-球蛋白突变基因的特异性探针。
5、根据权利要求4所述的DNA芯片，其中所述特异性探针包括选自SEQID NO.49～SEQ ID NO.56中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.64中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.65～SEQ ID NO.72中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.80中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.88中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.89～SEQ ID NO.96中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.97～SEQ ID NO.104中的至少一个序列的DNA、选自SEQID NO.49～SEQ ID NO.56中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.105～SEQ ID NO.112中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.113～SEQID NO.120中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.128中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.129～SEQ ID NO.136中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.137～SEQ ID NO.144中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.145～SEQ ID NO.152中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.153～SEQ ID NO.160中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.161～SEQ ID NO.168中的至少一个序列的DNA、选自SEQ IDNO.169～SEQ ID NO.176中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.177～SEQ ID NO.184中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.185～SEQ IDNO.192中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.193～SEQ ID NO.200中的至少一个序列的DNA以及选自SEQ ID NO.201～SEQ ID NO.208中的至少一个序列的DNA。
6、根据权利要求5所述的DNA芯片，其中所述各DNA序列的5’端进一步连接一10～30个碱基的连拉臂。
7、用于诊断地中海贫血的DNA芯片的制备方法，包含下述步骤
1)合成探针DNA；
2)将合成的探针DNA及相应的对照DNA点样并排列于基底上；
3)将点样后的探针DNA固定于所述基底上。
8、用于扩增待检测样品中DNA的PCR引物，其特征在于所述引物的扩增产物含有可与α-和/或β-球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列。
9、根据权利要求8所述的引物，其特征在于所述引物的扩增产物含有可与α-型球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列。
10、根据权利要求9所述的引物，其特征在于所述引物包括四对引物。
11、根据权利要求10所述的引物，其中所述第一对引物含有选自SEQID NO.209～SEQ ID NO.216中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.217～SEQ ID NO.224的至少一个序列的DNA、所述第二对引物含有选自SEQID NO.209～SEQ ID NO.216中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.225～SEQ ID NO.232的至少一个序列的DNA、所述第三对引物含有选自SEQID NO.233～SEQ ID NO.240中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.241～SEQ ID NO.248的至少一个序列的DNA、所述第四对引物含有选自SEQID NO.249～SEQ ID NO.256中的至少一个序列的DNA及选自SEQ ID NO.257～SEQ ID NO.264的至少一个序列的DNA。
12、根据权利要求10所述的引物，其中它进一步包括一延伸引物，所述延伸引物含有选自SEQ ID NO.265～SEQ ID NO.276中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.277～SEQ ID NO.288中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.289～SEQ ID NO.300中的至少一个序列的DNA以及选自SEQID NO.301～SEQ ID NO.312中的至少一个序列的DNA。
13、根据权利要求8所述的引物，其特征在于所述引物的扩增产物含有可与β-型球蛋白突变基因的特异性探针杂交的DNA序列。
14、根据权利要求13所述的引物，其特征在于所述引物包括二对引物。
15、根据权利要求14所述的引物，其中所述第一对引物含有选自SEQID NO.313～SEQ ID NO.319中的至少一个序列的DNA以及选自SEQ ID NO.320～SEQ ID NO.328中的至少一个序列的DNA、所述第二对引物含有选自选自SEQ ID NO.329～SEQ ID NO.336中的至少一个序列的DNA以及选自SEQID NO.337～SEQ ID NO.344中的至少一个序列的DNA。
16、根据权利要求15所述的引物，其中它进一步包括一延伸引物，所述延伸引物含有选自SEQ ID NO.345～SEQ ID NO.352中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.353～SEQ ID NO.360中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.361～SEQ ID NO.368中的至少一个序列的DNA、选自SEQ IDNO.369～SEQ ID NO.376中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.377～SEQ ID NO.384中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.385～SEQID NO.392中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.393～SEQ ID NO.400中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.401～SEQ ID NO.408中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.409～SEQ ID NO.416中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.417～SEQ ID NO.424中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.425～SEQ ID NO.432中的至少一个序列的DNA、选自SEQID NO.433～SEQ ID NO.440中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.441～SEQ ID NO.448中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.449～SEQID NO.456中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.457～SEQ ID NO.464中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.465～SEQ ID NO.472中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.473～SEQ ID NO.480中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.481～SEQ ID NO.488中的至少一个序列的DNA、选自SEQ ID NO.489～SEQ ID NO.496中的至少一个序列的DNA以及选自SEQ ID NO.497～SEQ ID NO.504中的至少一个序列的DNA。
17、一种用于诊断地中海贫血的试剂盒，其特征在于它包含
用于诊断地中海贫血的DNA芯片；以及
用于扩增待检样品中DNA的PCR引物。
18、一种检测待检样品中是否存在地中海贫血的相关基因的方法，包含下述步骤
1)将待检样品用特异性引物进行PCR扩增；
2)用延伸引物对扩增产物进行荧光标记；
3)将标记后的产物与诊断地中海贫血的DNA芯片进行杂交；
4)检测结果。
全文摘要
本发明涉及用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法，提供一种用于临床诊断α－型和β－型地贫的DNA芯片，芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，根据迄今已知的α－和β－球蛋白突变基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的DNA探针。本发明的用于地中海贫血疾病诊断的DNA芯片，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。
文档编号C12Q1/68GK1453363SQ0211728
公开日2003年11月5日 申请日期2002年4月23日 优先权日2002年4月23日
发明者杨梦苏 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司