专利名称：文昌鱼双甲基精氨酸水解酶AmphiDDAH基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及文昌鱼双甲基精氨酸水解酶(AmphiDDAH)基因及其编码的蛋白PDDAH，以及该蛋白在制备治疗心血管疾病和关节炎药物中的应用。
背景技术：
文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)，属于脊索动物门(Chordata)，头索动物亚门(cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，也是脊椎动物祖先的模型，是海洋中较原始的动物类。在文昌鱼胚胎发育过程中，为了提高自身的免疫力及其组织和器官的分化形成，文昌鱼胚胎能够产生DDAH，水解非对称性的双甲基精氨酸(ADMA)，增强一氧化氮合成酶(NOS)的活性，从而调节一氧化氮(NO)在体内的含量。
1989年Ogawa首先用生化提取的方法在老鼠肝脏中分离得到DDAH，此酶为单条肽链，分子量约为33KDa，等电点为5.2，它能特异地水解其底物ADMA生成胍氨酸和甲胺，活性范围在pH5.5-pH7.5之间，不需要辅因子。2001年Murray-Rust等人对细菌DDAH晶体结构研究发现，DDAH通过Cys-His-Glu(C-249，His-162，Glu-114)三个活性位点与其底物NOS的抑制剂ADMA相结合，并水解其底物。在髓鞘碱性蛋白、热激蛋白、细胞核分子蛋白的加工、修饰过程中释放出自由的甲基化精氨酸(ADMA)，这些分子分布在细胞溶质、血浆、组织中，在不同的组织和器官中有着不同的浓度分布。在病理条件下，如高血脂症、高血压、肾病变、动脉粥样化病人的血浆中，类风湿性关节炎部位的组织液中，由于DDAH的活性下降，导致ADMA浓度上升，NO水平下降，引理病理的发生。炎症细胞因子IL-1β能诱导DDAH的表达，减少ADMA含量，从而增加NOS的活性，增加NO水平，从而刺激血管平滑肌细胞的生长。视黄酸也可通过刺激血管内皮细胞DDAH的表达，从而调节心血管系统的成熟与发育。NO也可通过刺激血管平滑肌细胞中可溶性鸟苷酸环化酶的活性，增加cGMP的含量，导致平滑肌松弛，是一种内源性的血管舒张物。在关节炎中，软骨细胞对胰岛素相关的生长因子I(IGF-I)不敏感，NO含量升高，当软骨细胞被暴露在NO中，IGF-I刺激的IGF-I受体的磷酸化减少，从而影响软骨细胞的生长。因此，研究开发文昌鱼DDAH用于治疗心血管疾病和骨关节病，是一项很有意义的工作。
目前，国内对DDAH的研究报道较少。对NO含量有重要调节作用的DDAH，进行基因重组、表达，具有很重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的文昌鱼AmphiDDAH基因及其编码的蛋白。
本发明的另一目的在于提供上述基因的PDDAH蛋白在制备治疗心血管疾病和关节炎药物中的应用。
本发明通过cDNA文库的构建和大规模测序的方法，从文昌鱼神经胚中分离得到神经胚AmphiDDAH基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本发明基因AmphiDDAH所编码的蛋白(重组蛋白DDAH，命名为PDDAH)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；等电点为4.12，分子量为30,649道尔顿。
该蛋白通过表达载体pETTRX-AmphiDDAH在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。
所述表达载体pETTRX-AmphiDDAH是建立以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体，该系统使PDDAH在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。
本发明所选择的青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)采集于山东省沙子口水域。
青岛文昌鱼神经胚cDNA文库的构建提取神经胚总RNA，通过反向PCR合成一链DNA，然后通过LD-PCR合成双链DNA，经Sfi I酶切后，与pcDNA3.0连接转化E.coli，构建cDNA文库。
本发明通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码文昌鱼DDAH的克隆，命名为AmphiDDAH(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码274个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为4.12，分子量为30,649道尔顿，具有保守的DDAH酶活性位点。
本发明通过设计了一对引物，将编码新基因AmphiDDAH克隆到原核融合表达载体pETTRX上(本实验构建)，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pETTRX-AmphiDDAH)以T7为启动子，TRX为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，利于外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，PDDAH融合蛋白的表达量较高，大部分处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了重组PDDAH蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到融合蛋白，融合蛋白经3C蛋白酶切割和Q阴离子交换柱层析，可得到纯度在90％以上的PDDAH蛋白。
本发明的表达质粒复制方法参照Sambrook(Sambrook，et a1.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养转化菌株，碱法提取质粒。
图1为本发明的文昌鱼PDDAH蛋白和其它物种DDAH蛋白的比较结果，其中“*”表示相同；“:”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同。
图2为文昌鱼神经胚总RNA。
图3双链cDNA电泳结果。
图4为基因AmphiDDAH的重组表达质粒pETTRX-AmphiDDAH构建图。
图5为重组PDDAH蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。1低分子量标准蛋白质marker；2未经诱导的pETTRX-AmphiDDAH菌体总蛋白；3经IPTG诱导的pETTRX-AmphiDDAH菌体总蛋白；4诱导菌超声上清总蛋白；5，6，7，8，9分别为50mM，100mM，200mM，300mM，400mM咪唑洗脱峰蛋白；图6为重组PDDAH的G25分子筛和Q柱亲和层析的SDS-PAGE分析。1低分子量标准蛋白质marker；2经过亲和层析得到的TRX-PDDAH融合蛋白；3TRX-PDDAH融合蛋白经3C蛋白酶(Prescission protease)切割；4Q柱纯化的重组PDDAH蛋白。
具体实施例方式
以下实施将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1文昌鱼神经胚总RNA的提取和cDNA的合成总RNA的提取和cDNA合成收集文昌鱼神经胚，采用Trizol试剂法提取神经胚总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质，获得文昌鱼神经胚总RNA，其A260/A280＝1.828，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的18s和28s两条带，比值＞1(见图2)，表明总RNA完整性较好、纯度也较高。取1ug总RNA，以SMART III olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′)进行逆转录合成第一链，得到10μl一链eDNA产物。
取2ulcDNA一链产物，以5’PCR Primer(5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)和3’PCR Primer(5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)为引物进行LD-PCR合成二链cDNA。
实施例2文昌鱼神经胚AmphiDDAH基因序列的测定和分析将二链cDNA连接至pcDNA3.0载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了编码全长AmphiDDAH基因的EST序列，基因长度都是822bp，编码274个氨基酸的PDDAH蛋白，是1个新的DDAH蛋白。
用ClustalW分析软件，对已报导的不同物种的DDAH蛋白序列比较，结果如图1所示。
从图1可以看出，DDAH的三个活性位点在不同的物种中是较为保守的。
实施例3重组PDDAH表达质粒的构建依据AmphiDDAH基因的两端序列合成一对引物，上游引物含Kpn I和PrescissionProtease切割位点，下游引物含Not I切割位点。
上游引物(P1)5’CGGGGT ACCCTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCCATG GCGKpnI Precision Protease siteGAT TTC TGT TGG AAT TT3’；下游引物(P2)5’ATAAGAATGCGGCCGCTTA CTA GAA CAG CAG AGA TTG GCA CGT C 3’；Not I以含AmphiDDAH基因的pcDNA3.0质粒(购自Invitrogen公司)为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在800bp左右。将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETTRX上，得到重组表达载体pETTRX-AmphiDDAH(其构建过程如图4所示)。表达载体pETTRX-AmphiDDAH中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Prescission蛋白酶切割位点，以便切除融合伴侣TRX。
实施例4文昌鱼PDDAH融合蛋白的表达将pETTRX-AmphiDDAH转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNATOOLS6.0预测的理论值44kD相符(图5)。
对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索得出。基因工程菌的培养条件为接单菌落于50ml氨苄抗性LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物10ml接种于1L的氨苄抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约4h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为0.1mM和0.2％，25℃，250rpm诱导培养14h后离心收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下PDDAH融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40％以上，处于可溶状态(图5)。
实施例五重组文昌鱼PDDAH融合蛋白的纯化将总菌体用50mM PB(pH6.5)洗涤，再用适量的50mM PB(pH6.5)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析纯化，SDS-PAGE分析融合蛋白的表达和层析的结果(图5)。从SDS-PAGE结果可以得出TRX-PDDAH能被Ni2+柱所吸附，用50mM、100mM的咪唑洗Ni2+柱时，能把大部分吸附在柱上的杂蛋白洗下，而用200mM、300mM、400mM浓度的咪唑能把目的蛋白TRX-PDDAH洗下。为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件先用100mM的咪唑洗Ni2+柱，弃洗脱峰，然后直接用400mM的咪唑洗Ni2+柱，收集重组蛋白的洗脱峰。
洗脱液过G25凝胶柱换3C酶切缓冲液，然后，在4℃冰箱进行TRX-PDDAH的3C酶(1∶1000)切过夜，酶切后的蛋白溶液经G25换成Q柱的平衡缓冲液，进行Q柱的上柱纯化。酶切后的样品在上柱时，3C、TRX大部分没有吸附在Q柱，基本上穿流掉了，用0.2M的NaCl洗脱时，洗脱下杂蛋白，而在0.3M时，能洗下我们的目的蛋白PDDAH(图6)。
实施例6PDDAH重组蛋白活性分析加入DDAH酶催化的底物ADMA 40ul，上述纯化的PDDAH蛋白360ul，37℃水解1hr之后，按照Knipp等人的方法进行L-胍氨酸显色，测OD530值，此水解反应重复3次，以PBS为空白，测出Vm＝0.015±0.002mmol·L-1·mg-1·min-1。所以，在文昌鱼中所得到的cDNA是DDAH基因的同源物，具有水解底物ADMA的活性，能调节NOS的活性，从而影响NO的生成。
序列表<110>中山大学<120>文昌鱼双甲基精氨酸水解酶(AmphiDDAH)基因及其应用<160>2<210>1<211>822<212>DNA<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)<220>
<221>peptide<222>(1)…(822)<400>1
<210>2<211>274<212>PRT<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)<220>
<221>peptide<222>(1)…(274)<400>21 MADFCWNFPE FKHAVVREVS DDVNNAVRDS TSTETVDLEK CRAEWELYVQ 5051 ALRDLGLDVT VIPQDPKLPD CQFVEDPCIV IGDTALITRP ACGPRQGETT 100101 VLEETMRNLG LKVRVVESDT ATLEGGDVIF TGKEIFCGDS VLSNEEGFKI 150151 LEETFGDDYP CHSIFVEYPE FHLKGYAALA APGIMAICDN EWGHPAWKDI 200201 CDTSNYPYKV MWIPDDFGNN CLYINGTIMH APESQKPDTF AVFQKDMADY 250251 NLIPMSSEEV SKVDAALTCQ SLLF* 27权利要求
1.从文昌鱼神经胚中分离得到神经胚基因AmphiDDAH，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白PDDAH，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
3.权利要求2所述的蛋白PDDAH在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的方法，按照以下步骤进行(1)重组表达载体pETTRX-AmphiDDAH的构建；(2)将pETTRX-AmphiDDAH转化大肠杆菌BL21(DE3)；(3)对转化的大肠杆菌BL21(DE3)进行培养；(4)重组文昌鱼PDDAH融合蛋白的纯化。
4.根据权利要求3所述的蛋白PDDAH在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的方法，其特征在于所述的重组表达载体pETTRX-AmphiDDAH的构建包括以下步骤(a)依据权利要求1所述的AmphiDDAH基因的两端序列合成一对引物，上游引物含KpnI和Prescission Protease切割位点，下游引物含Not I切割位点，上游引物(P1)5’CGGGGT ACCCTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCCATG GCG GAT TTCTGT TGG AAT TT3’；下游引物(P2)5’ATAAGAATGCGGCCGCTTA CTA GAA CAG CAG AGA TTG GCA CGT C 3’；(b)以含AmphiDDAH基因的pcDNA3.0质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩增；(c)将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETTRX上，得到重组表达载体pETTRX-AmphiDDAH.。
5.根据权利要求3所述的蛋白PDDAH在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的方法，其特征在于步骤(3)的培养条件为接单菌落于50ml氨苄抗性LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物10ml接种于1L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约4h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为0.1mM和0.2％，25℃，250rpm诱导培养14h后离心收集菌体。
6.根据权利要求3所述的蛋白PDDAH在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的方法，其特征在于步骤(4)重组文昌鱼PDDAH融合蛋白的纯化方法为将总菌体用50mMPB(pH6.5)洗涤，再用适量的50mMPB(pH6.5)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析纯化，收集重组蛋白的洗脱峰；重组蛋白的洗脱峰液过G25凝胶柱换3C酶切缓冲液，然后，在4℃进行TRX-PDDAH的3C酶(1∶1000)酶切过夜，酶切后的蛋白溶液经G25换成Q柱的平衡缓冲液，进行Q柱的上柱纯化。
7.权利要求2所述的蛋白在制备治疗心血管疾病和关节炎药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及文昌鱼AmphiDDAH基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备治疗心血管和关节炎疾病药物中的应用。本发明通过cDNA文库构建和大规模测序的方法，从文昌鱼神经胚中分离得到文昌鱼AmphiDDAH基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的蛋白(P
文档编号A61K38/17GK1654652SQ20041007762
公开日2005年8月17日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者徐安龙, 徐斌, 曹宝华, 崔彩媚, 谢珍慧, 张文献, 董美玲 申请人:中山大学