专利名称：一种干扰素聚乳酸－羟乙酸共聚物plga微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物活性药物的生物可降解控释微球的制备方法，属于生物医用高分子材料与生物活性药物控释制剂的交叉研究领域。
背景技术：
近年来，随着生物技术的高速发展，越来越多的多肽、蛋白质药物被研制出来，并在临床应用中表现出许多独特的疗效，例如胰岛素、乙肝疫苗、干扰素等。但由于多肽和蛋白类药物生物半衰期短，稳定性差，易被体内酶代谢，且难以在胃肠道内吸收，所以需要长期、频繁地注射给药，阻碍了其在临床上方便、广泛和有效的使用。
基因重组人干扰素-α是采用生物高科技制备的产品，由带有人干扰素基因的工程菌经高效表达，并高度纯化、冷冻干燥制成的乳白色粉末，其具有较强的免疫调节功能，能抑制肿瘤增殖、抗病毒、和增强机体免疫调节功能的作用。主要用于治疗类风湿性关节炎、肿瘤、病毒性疾病。由于干扰素口服失活，需要注射给药，且在血液中的半衰期短、稳定性差，易被体内酶代谢，注射后很快就被清除或降解，为了达到疗效，需要频繁、大剂量及长时间给药，通常用法为每天肌内注射50-200万IU，3个月为一疗程。
利用生物降解聚合物微粒系统来转运蛋白质药物是当前国内外研究的一个主要方法，有报道，以聚乳酸-羟乙酸共聚物为载体的人生长激素微球制剂，其药效较每天注射一次，连续注射28天的效果更好。将干扰素制成聚乳酸微球，可达到提高药物稳定性，延长作用时间，和使用方便的目的。国外在二十世纪九十年即有干扰素微球制剂的报道，其载体材料有白蛋白、明胶、和聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)等，PLGA微球因释药时间长而较理想。
目前，国内外科学家在研制缓释微球制剂时，使用最多的生物降解高分子材料是聚乳酸-羟乙酸共聚物，因其具有良好的生物降解性、相容性和可吸收性，已被FDA批准为药用辅料。而且促黄体激素释放激素、亮丙瑞林等聚乳酸缓释微球产品已在国外正式上市。由于聚乳酸-羟乙酸共聚物作为药用材料在国内还没有生产，而基因重组人干扰素-α在我国有多家厂家生产，价格适宜，如果将干扰素-α制成聚乳酸-羟乙酸共聚物缓释微球制剂，将大大提高其附加值，不仅可以推动生物技术药物的开发，而且还可以促进药用辅料的产业化进程。
发明内容
本发明的目的在于采用聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)为载体，将干扰素-α制成微球制剂，达到增加药物稳定性，延长药物作用时间，减少注射次数和用量，提高药物疗效与经济效益的目的，并提供干扰素微球的制备方法。
本发明的干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)微球制备方法，是采用复乳-溶剂蒸发法。将聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)溶于有机溶媒中，将冻干注射用重组人干扰素溶解于含一定量稳定剂的PBS溶液中形成内水相，再将内水相注射进有机相中，搅拌乳化成初乳(W/O)。然后将初乳在搅拌的条件下加到PVA水溶液(外水相)中，乳化成复乳(W/O/W)。再在氯化钠溶液中低速搅拌一定时间，使有机溶剂挥发完全。离心、洗涤、收集微球，冷冻干燥即得干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)微球粉末。
干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)微球制备方法，其特征在于制备方法包括以下步骤(1)聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)溶液的配制将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解于二氯甲烷中形成有机相，PLGA的浓度1％～60％(g/ml)；(2)干扰素PBS溶液的配制将冻干注射用重组人干扰素α溶解于含一定量稳定剂的PBS(pH7.4磷酸盐缓冲液)溶液中形成内水相，干扰素的浓度为0.1％～10％(g/ml)，稳定剂的浓度为1％～60％(g/ml)；(3)初乳的制备将内水相注射进有机相中形成初乳(W/O)，乳化速度为1000～10000rpm，乳化时间为1～10分钟，有机相与内水相的体积比为2∶1至50∶1；(4)复乳的制备把初乳在搅拌的情况下加到一定浓度的PVA(聚乙烯醇)和NaCl水溶液(外水相)中，乳化成复乳(W/O/W)，初乳与外水相的体积比为1∶5至1∶600；复乳形成的搅拌速度为1000～2900rpm，PVA溶液的浓度为0.2～10％(g/ml)，NaCl溶液的浓度为0.2～10％(g/ml)，乳化时间为5～20分钟。
(5)微球的形成将复乳溶液转移到NaCl水溶液中，低速搅拌至有机溶剂挥发完全，离心、洗涤后收集微球。NaCl浓度为0.2～10％(g/ml)，体积为复乳的2-6倍，搅拌速度为200～2000rpm，离心速度为500～8000rpm，离心时间为10-30分钟，洗涤次数为2～6次。
(6)冷冻干燥本发明的积极效果是本发明采用复乳-溶剂挥发法制备出的干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)微球，微球制备工艺稳定、可行，微球的形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为30μm，载药量为8％以上，包封率为40％左右，其体外释药性能符合长效制剂特征。将干扰素-α制成缓释微球制剂，可延长药物作用时间，提高药物疗效与经济效益。
附图及说明
图1采用本发明制备的干扰素PLGA微球的光学显微镜和扫描电子显微镜照片，观察表面形态。
图2为PLGA空白微球(1)、干扰素PLGA载药微球(2)的DSC曲线。
具体实施例方式
以下实施例对本发明作进一步的描述，以便本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 干扰素聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球的制备(1)聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)溶液的配制将400mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解于2ml二氯甲烷中形成有机相(20％g/ml)。
(2)干扰素PBS溶液的配制将40mg冻干注射用重组人干扰素-α溶解于300μl 1％(g/ml)浓度的明胶溶液中形成内水相；(3)初乳的制备将内水相注射进有机相中，在9000rpm条件下搅拌乳化1分钟以形成初乳(W/O)；(4)复乳的制备把初乳在2000rpm搅拌的情况下加到300ml含1％(g/ml)PVA和1％(g/ml)NaCl溶液(外水相)中，乳化10分钟，乳化成复乳(W/O/W)；(5)微球的形成将复乳溶液转移到3倍量1％(g/ml)NaCl水溶液中，1000rpm低速搅拌至有机溶剂挥发完全，1500rpm离心15分钟，用蒸馏水洗涤3次、洗涤后收集微球；(6)冷冻干燥的条件为冷冻干燥的条件为-40℃，4h；-25℃，10h；-10℃，20h；-4℃，48h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状干扰素聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
所得干扰素微球的形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为10.71μm，载药量为6.96％，包封率为32.90％，体外释药性能符合长效制剂特征。
实施例2 干扰素聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球的制备(1)聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)溶液的配制将600mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解于2ml二氯甲烷中形成有机相(30％g/ml)。
(2)干扰素PBS溶液的配制将60mg冻干注射用重组人干扰素-α溶解于300μl 30％PEG400溶液中形成内水相；(3)初乳的制备将内水相注射进有机相中，在1000rpm条件下搅拌乳化3分钟以形成初乳(W/O)；(4)复乳的制备把初乳在1600rpm搅拌的情况下加到200ml含3％(g/ml)PVA和0.5％(g/ml)NaCl溶液(外水相)中，乳化20分钟，乳化成复乳(W/O/W)；(5)微球的形成将复乳溶液转移到2倍量1％(g/ml)NaCl水溶液中，1000rpm低速搅拌至有机溶剂挥发完全，1200rpm离心20分钟，用蒸馏水洗涤3次、洗涤后收集微球；(6)冷冻干燥的条件为冷冻干燥的条件为-40℃，4h；-25℃，10h；-10℃，20h；-4℃，48h。
将所制微球进行冷冻干燥，在上述冷冻干燥条件下得到白色疏松粉末状干扰素聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
所得干扰素微球的形态圆整，表面光滑，流动性好，粒度分布均匀，平均粒径为12.36μm，载药量为6.06％，包封率为36.80％，体外释药性能符合长效制剂特征。
权利要求
1.一种干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物微球的制备方法，按以下步骤进行将聚乳酸-羟乙酸共聚物溶于有机溶媒中；将冻干注射用重组人干扰素溶解于含稳定剂的PBS溶液中形成内水相；再将内水相注射进有机相中，搅拌乳化成初乳(W/O)；然后将初乳在搅拌的条件下加到PVA水溶液(外水相)中，乳化成复乳(W/O/W)；再在含电解质的溶液中低速搅拌，使有机溶剂挥发完全；离心、洗涤、收集微球，冷冻干燥即得干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物PLGA微球粉末。
2.如权利要求1所述的干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物微球制备方法，其特征在于制备方法包括以下步骤(1)聚乳酸-羟乙酸共聚物PLGA溶液的配制将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶解于有机溶剂中形成有机相，PLGA的浓度1％～60％(g/ml)；(2)干扰素PBS溶液的配制将冻干注射用重组人干扰素α溶解于含一定量稳定剂的PBS溶液中形成内水相，干扰素的浓度为3％～90％(g/ml)，稳定剂的浓度为1％～60％(g/ml)；(3)初乳的制备将内水相注射进有机相中形成初乳(W/O)，乳化速度为1000～10000rpm，乳化时间为1～10分钟，有机相与内水相的体积比为2∶1至50∶1；(4)复乳的制备把初乳在搅拌的情况下加到一定浓度的PVA和NaCl水溶液(外水相)中，乳化成复乳(W/O/W)；复乳形成的搅拌速度为1000～2900rpm，PVA溶液的浓度为0.2～10％(g/ml)，NaCl溶液的浓度为0.2～10％(g/ml)，乳化时间为5～20分钟，初乳与外水相的体积比为1∶5至1∶600；(5)微球的形成将复乳溶液转移到NaCl水溶液中，低速搅拌至有机溶剂挥发完全，离心、洗涤后收集微球；NaCl溶液的浓度为0.2～10％(g/ml)，体积为复乳的2-6倍，搅拌速度为200～2000rpm，离心速度为500～8000rpm，离心时间为10-30分钟，洗涤次数为2～6次；(6)冷冻干燥
3.如权利要求1或2所述的干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物微球制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为二氯甲烷。
4.如权利要求1或2所述的干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物微球制备方法，其特征在于所述的干扰素的稳定剂为明胶或者PEG400。
5.如权利要求1或2所述的干扰素聚乳酸-羟乙酸共聚物微球制备方法，其特征在于将所制微球进行冷冻干燥的条件为-40℃，4h；-25℃，10h；-10℃，20h；-4℃，48h。
全文摘要
本发明公开了一种干扰素聚乳酸－羟乙酸共聚物(PLGA)微球的制备方法，其特征在于采用复乳－溶剂挥发法制备，聚乳酸－羟乙酸共聚物(PLGA)为微球载体，冻干注射用重组人干扰素－α为包裹对象，所制得的干扰素微球形态圆整，粒度分布均匀，粒径分布在30微米以下，载药量可达8％以上，包封率在40％左右，体外释药性能符合长效制剂特征。
文档编号A61P31/12GK1660412SQ20041007762
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者徐安龙, 杨帆, 高建萍, 赵耀明, 王磊, 董美玲 申请人:中山大学