专利名称：一种新的天然抗菌肽Hippocampusin及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的天然抗菌肽Hippocampusin和编码该蛋白的基因hkplp，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。。
背景技术：
海马(Hippocampus)是一种奇特的海洋生物，属脊椎动物亚门、鱼纲、海龙目、海龙科(Syngnathidae)。目前，全球已鉴定的海马有35种。在我国，海马主要栖息在东南部海域，常见的共有5种(张朝晖等，1998a)，分别是线纹海马(H.kelloggi)、刺海马(H.histrix)、大海马(H.kuda)、斑海马(H.trimaculatus)以及日本海马(H.japonicus)。
海马是一种名贵的传统中药材，具有补肾壮阳、消肿散结，镇静安神之功效，前述5种海马为中国历版药典所收载。
目前国内对海马的药用研究主要集中在品种鉴定、成分分析、药理研究以及临床研究几个方面。在品种鉴定上，一般常采用限制性片段长度多态性(RFLP)分析、DNA序列分析(吴平等，1998)、扫描电镜与图象定量分析(张朝晖等，1998)、毛细管电泳分析(张朝晖等，1998)等方法。在对海马进行成分分析方面已经鉴定出海马含有硬脂酸、胆固醇、胆固二醇、2-羟基-4-甲氧基-苯乙酮、胆甾醇、乙酰胆碱酯酶、蛋白酶以及17种氨基酸、19种无机元素等等(黄平等，1982；王强等，1998；贾玉海，1996)。最引人注目的还是海马的药理学研究。有实验证明，海马的乙醇及水提取物均能不同程度的抑制由L-谷氨酸引起的大鼠神经元钙内流(张朝晖等，1994)，乙醇提取物还能增加正常雄性小鼠的精子数和精子活率(张朝晖等，1995)，有日本学者的研究表明，海马的乙醇提取液表现为雄性激素样作用；在以抗氧化活性为指标的对动物性生药的研究中，海马显示出抑制脂质过氧化作用及抗疲劳作用；另外人们还发现，海马的水提物和乙醇提物均能增强肌体免疫功能(陈维宁等，1995)，从海马中分离的一种肽类初制剂还可以拮抗谷氨酸钠盐对幼鼠记忆的损伤作用(严家彬等，2002)。
海马神奇的药效和奇特的观赏价值引发了巨大的需求，天然海马资源骤减，养殖业应运而生。但是今年来，海马养殖业遇到很多疑难问题，其中之一就是病害防治。由于药物残留及耐药性等问题，抗生素的应用在养殖业已受到严格的限制。目前，对大面积的海马养殖而言，喷洒中药对水中的病原微生物作用甚微。所以，找到抗生素的替代药物已迫在眉睫，研制新的抗菌肽不仅是国内外医药界研究的热点，也是解决海马养殖中病害防治的一个有巨大前景的研究方向。
天然抗菌肽Hippocampusin的发明，是在海马这一物种的创新性发现，它提供了一个很好的药物后选物，不论是对海马养殖中病害的防治，还是对哺乳动物和人类中感染性疾病的防治。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的天然抗菌肽Hippocampusin和编码该蛋白的基因hkplp。
本发明的另一目的在于提供该蛋白的生产方法。
本发明的第三个目的在于提供该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
本发明用RT-PCR的方法从大海马总RNA中分离得到的海马抗菌肽基因hkplp，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
本发明所述基因编码的蛋白Hippocampusin，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；该蛋白等电点为12，分子量为2719道尔顿。
该蛋白可以通过重组酵母以分泌的形式表达，表达量达到1mg/L。
该蛋白对常见的大多数鱼类及人类致病菌株均敏感，其MIC不超过16μg/ml，杀菌迅速，且溶血性较小。
本发明所选择的海马属于大海马(Hippocampus kuda Bleeker)，采自广东陆丰。
雄海马全鱼cDNA文库的构建首先匀浆海马组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA后合成双链cDNA，双链cDNA与pcDNA3.0载体连接后转化E.coli并保存每个重组克隆。
本发明通过对以上重组文库克隆进行大规模随机序列测定，从中得到了一个编码海马新抗菌肽的克隆，命名为Hippocampusin(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码25个氨基酸的成熟肽(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为12，分子量为2719道尔顿，具有典型的抗菌肽一级结构、二级结构的特征，即含有较多碱性氨基酸而使分子带正电荷、二级结构为双亲α螺旋。
本发明通过设计一对引物，将编码海马抗菌肽的新基因Hippocampusin用PCR方法从pcDNA3.0载体上扩增出来，克隆到甲醇酵母表达载体pPICZαA上，构建成表达质粒并将其转化毕赤酵母X-33。此表达载体以PAOX1为启动子，采用分泌表达的形式将重组蛋白分泌到发酵上清中。通过对培养时间，诱导时间，甲醇浓度等条件的摸索和优化，重组蛋白的表达量可达到1mg/L。
本发明还摸索和优化了重组海马抗菌肽Hippocampusin的纯化条件，发酵上清经CMsepharose FF阳离子交换柱纯化，可得到纯度在95％以上的成熟重组海马抗菌肽Hippocampusin。
本发明获得的重组或合成海马抗菌肽Hippocampusin具有生物活性。该重组海马抗菌肽Hippocampusin对金黄色葡萄球菌等Gram+菌和大肠杆菌K12D31等Gram-菌有明显的抑制作用。
由本发明的含有Hippocampusin海马抗菌肽成熟肽编码序列的表达质粒pPICZαA经Xho I/Not I双酶切，可得到75bp的片段，即为大海马抗菌肽Hippocampusin成熟肽编码序列。
本发明的表达质粒的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et a1.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.coli.DH5α菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
图1为本发明的海马天然抗菌肽Hippocampusin与其它几个同源抗菌肽的比对结果，其中“*”表示相同；“:”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同。
图2为大海马总RNA电泳结果。
图3为大海马抗菌肽hkplp基因的RT-PCR电泳结果。1PCR目的条带；2100bp DNAmarker。
图4为含基因hkplp的表达质粒pPICZαA-hkplp酶切鉴定图。1100bp DNA marker；2pPICZαA-hkplp经Xho I/Not I双酶切。
图5为通过Helical Wheel软件预测Hippocampusin可形成双亲的α-Helix构象的示意图。
图6为Hippocampusin对金黄色葡萄球菌的抑菌圈实验结果(1是阴性对照，2和3分别为25μg和50μg Hippocampusin)。
图7为纯化后的抗菌肽hippocampusin Tricine-Tris SDS-PAGE电泳图(银染)。M多肽Marker；1纯化的抗菌肽hippocampusin。
图8为含基因hkplp的重组表达质粒pPICZαA-hkplp构建图。
表1为海马抗菌肽Hippocampusin的抗菌谱及最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1海马总RNA的提取和RT-PCR扩增总RNA的提取和cDNA合成在Trizol中匀浆海马组织，采用一步热酚法提取海马总RNA，抽提去除蛋白质。获得总RNA浓度为1.04μg/μl，其A260/A280＝1.89，经1％琼脂糖电泳检测可见清晰的18s和28s两条带，比值＞1(见图2)，表明总RNA完整性良好。取1ug总RNA以SMART IIIolignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。2μl第一链产物以5’PCR primer(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)，CDS III/3’PCR primer(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N-3’)进行二链扩增。将二链蛋白酶K消化并纯化后进行Sfi I切割，连接入同样Sfi I酶切处理过的pcDNA3.0文库载体上。随机测序获得两个抗菌肽基因Hippocampusin的EST，经软件分析发现该EST为全长。
实施例2海马抗菌肽基因序列的分析Blast同源分析表明，该海马抗菌肽新基因ORF全长为165bp，编码55个氨基酸残基的前体蛋白，其中包括N末端22个氨基酸的信号肽、C末端8个氨基酸的Pro-region区域和中间25个氨基酸的成熟肽。其中成熟肽最后的Gly残基是羧基末端Arg酰胺化的氨基供体。此处前体蛋白的组成模式及C末端酰胺化是抗菌肽一级结构的典型特征。预测成熟肽等电点为12，分子量为2719道尔顿。该成熟肽，因含有7个碱性氨基酸而使分子带正电荷，疏水性氨基酸占48％，二级结构为双亲α螺旋(预测结果见图5)，这些都是α螺旋型抗菌肽典型的结构特征。
实施例3海马重组抗菌肽酵母表达质粒的构建依据hkplp基因的两端序列合成一对引物，上游引物含Xho I切割位点，下游引物含Not I切割位点。
上游引物(B1)CCTTAGGGCCCCTCGAGaaaaga TTT TTG GGA CTC ATT TTT CAC；下游引物(B2)GCCGAGCTCTGCAGCGGCCGCtca GCC GCG ATT CCT GTG GAT CAA以含hkplp基因的pcDNA3.0质粒为模板，B1、B2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在122bp左右。PCR扩增产物经Xho I/Not I酶切克隆到甲醇酵母表达载体pPICZαA上，得到重组表达载体pPICZαA-hkplp(其构建过程如图8所示)。表达载体经Xho I/Not I双酶切鉴定(酶切结果见图4)正确。表达载体pPICZαA-hkplp中的外源基因经测序鉴定正确。
实施例4海马重组抗菌肽的表达将pPICZαA-hkplp电击转化毕赤酵母菌株X-33，得到重组酵母基因工程菌。该重组酵母菌株经甲醇诱导表达后，其发酵上清液用Tricine/Tris SDS-PAGE电泳(银染)分析。结果表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，其分子量与预测的理论值2.8kD相符。
经过对培养基pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间等条件的摸索，确定了培养基pH6.0，甲醇浓度1％，诱导时间6天的表达条件。最终的表达量为1mg蛋白/L BMMY培养基(1％yeast extract，2％peptone，100mM potassium phosphate，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％ biotin，0.5％ methanol)。
实施例5海马重组抗菌肽的纯化实施例4所得的含有海马重组抗菌肽的发酵上清液，经Sephadex G-25柱换成平衡缓冲液(20mM PBS，pH6.3)后，上CM sepharose FF阳离子交换柱。收集穿流峰，用前述平衡缓冲液洗柱至平台期。然后，用溶液A(20mM PBS，pH7.0)和溶液B(含有1M NaCl的20mM PBS，pH7.0)的混合液线性梯度洗脱，收集各洗脱峰，用Tricine/Tris SDS-PAGE电泳(银染)分析。结果显示，目的蛋白在含400mM NaCl的20mM PBS(pH7.0)中被洗脱下来。最后可得到纯度在95％以上的重组海马抗菌肽Hippocampusin，得率约为100μg/L培养基(见图7)。
实施例6溶血实验用血色素的泄露来评估溶血性大小。用pH7.6的10mM Tris-HCl(含154mM NaCl)缓冲液洗涤人红细胞，再用含抗菌肽的前述缓冲液重悬红细胞，孵育0.5小时后离心，去掉完整的红细胞，取上清，稀释后测A540。当Hippocampusin浓度为4μg/ml时，只有不超过5％的溶血性发生。与其它已发表的许多抗菌肽相比，溶血性较小，说明海马抗菌肽对正常细胞的毒性较小。
实施例7重组海马抗菌肽Hippocampusin的抗菌活性实验重组海马抗菌肽Hippocampusin的生物活性参照Wu和Hancock的方法，分析其对常见敏感菌株及致病菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)(数据见表1)。同时还进行了抑菌圈实验(见图6)和杀菌活性的时间依赖性(图略)分析。结果表明，Hippocampusin对常见的大多数鱼类及人类致病菌株均敏感，其MIC不超过16μg/ml，在20分钟之内就可杀死98％以上的金黄色葡萄球菌，说明Hippocampusin能够有效、迅速地抗菌。
表1.HKPLP的MIC50和MBC
NDnot detected.
序列表<110>中山大学<120>一种新的天然抗菌肽Hippocampusin及其生产方法和应用<160>2<210>1<211>75<212>DNA<213>大海马(Hippocampus kuda Bleeker)<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(75)<400>1ttt ttg gga ctc att ttt cac ggc ctg gtt cac gcc gga aag ctg atc 48Phe Leu Gly Leu Ile Phe His Gly Leu Val His Ala Gly Lys Leu Ile15 10 15cac ggg ttg atc cac agg aat cgc ggc 75His Gly Leu Ile His Arg Asn Arg Gly20 25<210>2<211>25<212>PRT<213>大海马(Hippcampus kuda Bleeker)
<220>
<221>mat peptide<222>(1)…(25)<400>2Phe Leu Gly Leu Ile Phe His Gly Leu Val His Ala Gly Lys Leu Ile1 5 10 15His Gly Leu Ile His Arg Ash Arg Gly20 2权利要求
1.从大海马总RNA中分离得到的海马抗菌肽基因hkplp，其DNA序列如下ttt ttg gga ctcatt ttt cac ggc ctg gtt cac gcc gga aag ctg atc cac ggg ttg atc cac agg aat cgc ggc。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白Hippocampusin，其氨基酸序列为Phe Leu Gly Leu IlePhe His Gly Leu Val HisAla Gly Lys Leu Ile His Gly Leu Ile His Arg Asn Arg Gly。
3.权利要求2所述蛋白Hippocampusin的生产方法，按以下步骤进行(1)将权利要求1所述的基因hkplp克隆到甲醇酵母表达载体pPICZαA上，得到重组表达载体pPICZαA-hkplp；(2)将pPICZαA-hkplp电击转化毕赤酵母菌株X-33，得到重组酵母基因工程菌；(3)在pH6.0的培养基，以浓度为1％的甲醇，对上述的重组酵母基因工程菌进行诱导表达6天；(4)发酵上清液经CM sepharose FF阳离子交换柱纯化，可得到纯度在95％以上的成熟重组海马抗菌肽Hippocampusin。
4.权利要求2所述的蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的天然抗菌肽Hippocampusin和编码该蛋白的基因hkplp，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。本发明用RT－PCR的方法，从大海马总RNA中筛选得到的抗菌肽新基因hkplp，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的蛋白(Hippocampusin)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本发明的新抗菌肽对Gram
文档编号A61P31/00GK1654651SQ20041007762
公开日2005年8月17日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者徐安龙, 张宁, 徐斌, 杨文利, 彭文烈, 姜孝玉, 董美玲 申请人:中山大学