专利名称：一种羊栖菜多糖sfp－i及其分离纯化方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体地说涉及一种多糖。
背景技术：
羊栖菜(Sargassum Fusiforme，SF)属褐藻门马尾藻科植物，是我国丰富的经济海藻资源，藻体呈黄褐色，干时发黑，高30～200cm，肉质，主轴圆柱形，直立，基部具短分枝，又名玉茜、胡须泡、海大麦等，系多年生的暖温性海藻。在我国主要分布在广东、山东、福建、浙江等沿海地区，并出口到日本等国，而我国的羊栖菜开发才刚刚起步，几乎处于空白。
乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的、流行久远、传播广泛、严重危害人类健康的传染性疾病。据估计目前全球范围内大约有3.5亿的HBV慢性携带者。我国是乙型肝炎主要的流行区域，有超过10％的感染过HBV，HBV慢性携带者的人数几乎占全球的一半，现患慢性乙型肝炎的病人已达到1000万。对HBV的防治已成为我国乃至世界传染病控制的首要问题之一。
藻类多糖具有较好的抗病毒作用已被大量的科学家所认可。多糖作为羊栖菜的最主要成分，含量占细胞干重的40％左右，这就为利用羊栖菜开发新型抗病毒药品或食品提供了必要条件。本发明从羊栖菜中分离纯化获得一种多糖，经化学方法分析确定出化学结构，并通过药理实验证明该化学结构的多糖具有明显的抗乙肝病毒作用，可应用于药品或保健食品中。
发明内容
本发明目的是针对现有乙型肝炎治疗存在的问题，提供一种从羊栖菜中分离的羊栖菜多糖SFP-I。
本发明的另一个目的是提供该羊栖菜多糖SFP-I分离纯化的方法。
本发明的另一个目的是提供该羊栖菜多糖SFP-I在制备抗乙肝病毒药物或保健食品中的应用。
一种羊栖菜多糖SFP-I，经SepharoseCL-6B凝胶色谱柱层析，谱图出现单一对称峰，如图1所示，表明纯度已达到对其进行结构、药理研究的要求。SFP-I经HPLC体系测定其分子量为1.2×105，经气相色谱图分析，如图2，SFP-I的单体组成含有岩藻糖、半乳糖、木糖，各单糖之间的摩尔比为1∶0.4∶0.39。经紫外扫描图谱，如图3所示，除蛋白后的SFP-I在260nm和280nm附近均无蛋白质和氨基酸的特征吸收峰，表明其不含蛋白质。SFP-I的13C-NMR谱图中，如图4，端基碳的化学位移δ均在102ppm以下，其中δ97-102ppm信号峰为C1讯号，表明其构型为α，这与IR谱图(如图5)、GC-MS谱图(如图6)分析结果是一致的。根据13C-NMR谱峰的指派，结合二糖、寡糖的化学位移表及文献，以及高碘酸氧化和Smith降解结果，证明SFP-I多糖的一级结构是以-3-α-L-Fuc-(1，4)-α-L-Fuc-(1-残基形成糖链，平均每6个单糖残基中含有2个α1→2分支，其重复单元可表示如下
上述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其步骤如下所示(1)取羊栖菜加水浸提，超滤水浸提液，收集被截留部分，减压浓缩、用无水乙醇沉淀，冷冻干燥得羊栖菜粗多糖；(2)将羊栖菜粗多糖加水复溶，然后加入CaCl2溶液，离心，收集上清液；(3)上清液经减压浓缩，再加入乙醇，离心；(4)离心后取上清液，上清液中再加入乙醇，离心取沉淀物；(5)将沉淀物溶于水，按Sevag法脱游离蛋白，以DEAE-cellulose为载体柱层析，依次用0.3mol/L NaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，各洗脱液透析、减压浓缩、冷冻干燥得固体物；(6)将上述经0.9mol/LNaCl洗脱所得的固体物溶于水，再进一步用SepharoseCL-6B柱层析纯化，流动相为0.05mol/LNaCl溶液，流出液经透析、减压浓缩、冷冻干燥后得白色粉末状羊栖菜多糖SFP-I。
上述步骤(1)所述的超滤水浸提液是用分子量为100000的超滤膜超滤水浸提液。
上述步骤(1)所述无水乙醇的用量是减压浓缩后物体体积的3～8倍。
上述步骤(2)所述CaCl2溶液的浓度为4mol/L。
上述步骤(3)中上清液经减压浓缩，再加入乙醇，使溶液中乙醇浓度为30～40％。
上述步骤(4)中，离心后取上清液，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇浓度为85～90％。
上述步骤(5)所述的Sevag法中，氯仿和正丁醇的体积比为4∶1。
上述步骤(6)中所述的固体物用量为80～100mg。
本发明的有益效果本发明从羊栖菜中提取了一种羊栖菜多糖SFP-I，该多糖能够有效抑制乙肝病毒，在制备用于预防和治疗乙肝的药物及保健食品中有着重要的应用，其市场前景广阔，价值高。
图1为羊栖菜多糖SFP-I在SepharoseCL-6B凝胶色谱柱上的层析图；图2为糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图；图3为羊栖菜多糖SFP-I除蛋白后的紫外扫描图谱；图4为羊栖菜多糖SFP-I的13C-NMR谱图；图5为羊栖菜多糖SFP-I的IR谱图；图6为羊栖菜多糖SFP-I的GC-MS谱图；其中，在图2中，A为标准单糖；B为SFP-I水解物。
具体实施例方式
实施例1 羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化
(1)取1kg羊栖菜干品加水浸提，经响应面分析法优化条件为提取温度85℃、自然pH值、水料重量比为28∶1、浸提1次的条件下，外加40W超声波，每次10min，间隔10min，浸提1h，羊栖菜粗多糖的得率可达21.09％(占原羊栖菜干品重量)。
(2)用100000分子量的超滤膜超滤水浸提液，选取2.0MPa为操作进口压力，室温25℃作为超滤温度。收集被截留部分，减压浓缩至最小体积、用3～8倍无水乙醇沉淀，冷冻干燥得羊栖菜粗多糖，得率为15.01％。
(3)羊栖菜粗多糖用适量水复溶，然后加入4mol/L CaCl2溶液，离心，收集上清液。上清液经减压浓缩至最小体积，加入乙醇至溶液中乙醇浓度为30～40％，静置后离心。离心后去沉淀，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇浓度为85～90％，离心得到沉淀，得率为3.63％。
(4)取沉淀0.15g溶于水，按Sevag法(氯仿∶正丁醇＝4∶1)脱游离蛋白，重复5次后，以DEAE-cellulose为载体柱层析，依次用0.3mol/LNaCl、0.6mol/L NaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，各洗脱液透析、减压浓缩、冷冻干燥得固体物。
(5)将上述经0.9mol/LNaCl洗脱所得的固体物80-100mg溶于水，再进一步用SepharoseCL-6B柱层析纯化，流动相为0.05mol/LNaCl溶液，流出液经透析、减压浓缩、冷冻干燥后得白色粉末状羊栖菜多糖SFP-I，得率为0.22％。
实施例2 羊栖菜多糖SFP-I对2215细胞内HBV-DNA的抑制作用
2215细胞内HBV-DNA提取在25cm2培养瓶中培养2215细胞，接种后24h加入羊栖菜多糖，设5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml及细胞对照各1瓶。加药后培养12d(每4d换药液1次)，取细胞对照及羊栖菜多糖各浓度处理细胞各1瓶，每瓶加细胞裂解液600μL，经37℃、2d裂解，11000g离心10min，吸取上清，加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，56℃保存2h，收取上清，加等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1(V/V)，抽提2次，每次10min，10000g离心2min后，取上清，加两倍体积无水乙醇沉淀DNA，真空抽干，重溶于TE缓冲液中作为样品。将提取得到的DNA稀释成6个稀释度，即1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，用HBV-DNA探针作斑点杂交，用酶标仪测定各点OD(570nm)值，计算不同浓度羊栖菜多糖对2215细胞内HBV-DNA的抑制率。HBV-DNA全基因探针的制备及膜的杂交、显色均使用地高辛试剂盒。HBV-DNA全基因由大肠杆菌Am12经EcoR酶切获得。
用羊栖菜多糖SFP-I的3个稀释浓度5.0mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml处理2215细胞，第12d分别提取DNA，稀释成6个稀释度，即1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，用HBV-DNA探针作斑点杂交，用酶标仪测定各点OD(570nm)值，分析比较每批实验结果，结果如表1所示。
表1 斑点杂交结果HBV-DNA检测多糖浓度(mg/ml)细胞对照稀释倍数 项目 52.5 1.25OD 0.36 0.44 0.65 0.56 0.68 0.70 0.86 0.791/2抑制率 60.90 55.71 37.60 42.30 17.58 19.90 - -1/4 OD 0.25 0.33 0.40 0.40 0.45 0.56 0.61 0.73
抑制率59.7057.9843.00 49.08 31.80 29.70- -OD0.23 0.24 0.280.310.450.53 0.46 0.521/8抑制率61.3068.7038.80 47.50 21.60 16.53- -OD0.11 0.16 0.120.150.270.31 0.34 0.211/16抑制率65.1459.2247.15 50.19 12.14 -- -OD0.12 0.09 0.130.120.140.21 0.22 0.311/32抑制率48.9064.2022.20 61.30 27.80 32.30- -OD0.09 0.05 0.130.050.170.09 0.14 0.161/64抑制率62.7172.8047.62 64.30 - 22.90- -X 59.7863.1039.39 52.45 15.57 20.23- -由表1可知，羊栖菜多糖SFP-I5mg/ml组HBV-DNA与细胞对照组HBV-DNA比较，平均抑制率达61.44％；2.5mg/ml组抑制率达45.92％；1.25mg/ml组抑制率为17.9％。由此说明羊栖菜多糖在2215细胞中无毒浓度条件下可抑制HBV-DNA的复制，抑制作用呈明显的剂量-效应关系。
权利要求
1.一种羊栖菜多糖SFP-I，其特征在于含有岩藻糖、半乳糖、木糖，其摩尔比为1∶0.4∶0.39，不含蛋白质，分子量为1.2×105，糖链化学结构以-3-a-L-Fuc-(1，4)-a-L-Fuc-(1-残基形成主链，其重复单元结构为
2.权利要求1所述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其步骤如下所示(1)取羊栖菜加水浸提，超滤水浸提液，收集被截留部分，减压浓缩、用无水乙醇沉淀，冷冻干燥得羊栖菜粗多糖；(2)将羊栖菜粗多糖加水复溶，然后加入CaCl2溶液，离心，收集上清液；(3)上清液经减压浓缩，再加入乙醇，离心；(4)离心后取上清液，上清液中再加入乙醇，离心取沉淀物；(5)将沉淀物溶于水，按Sevag法脱游离蛋白，以DEAE-cellulose为载体柱层析，依次用0.3mol/L NaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，各洗脱液透析、减压浓缩、冷冻干燥得固体物；(6)将上述经0.9mol/LNaCl洗脱所得的固体物溶于水，再进一步用SepharoseCL-6B柱层析纯化，流动相为0.05mol/LNaCl溶液，流出液经透析、减压浓缩、冷冻干燥后得白色粉末状羊栖菜多糖SFP-I。
3.根据权利要求2所述的羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述的超滤水浸提液是用分子量为100000的超滤膜超滤水浸提液。
4.根据权利要求2所述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述无水乙醇的用量是减压浓缩后物体体积的3～8倍。
5.根据权利要求2所述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)所述CaCl2溶液的浓度为4mol/L。
6.根据权利要求2所述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中上清液经减压浓缩，再加入乙醇，使溶液中乙醇浓度为30～40％。
7.根据权利要求2所述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其特征在于步骤(4)中，离心后取上清液，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇浓度为85～90％。
8.根据权利要求2所述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其特征在于步骤(5)所述的Sevag法中，氯仿和正丁醇的体积比为4∶1。
9.根据权利要求2所述羊栖菜多糖SFP-I的分离纯化方法，其特征在于步骤(6)中所述的固体物用量为80～100mg。
10.权利要求1所述的羊栖菜多糖SFP-I在制备用于抗乙肝病毒的药物或保健食品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种羊栖菜多糖SFP－I。本发明的羊栖菜多糖SFP－I，是一种以岩藻糖为主的杂多糖，单体组成含有岩藻糖、半乳糖、木糖，这三种单糖的摩尔比为1∶0.4∶0.39，不含蛋白质，其分子量为1.2×10
文档编号A61P1/16GK1651469SQ200410077730
公开日2005年8月10日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者李亚娜, 林永成, 佘志刚, 袁长青 申请人:中山大学