专利名称：：一种固相法制备Eptifibatide的方法
技术领域：
：本发明本发明属于制药
技术领域：
，尤其是涉及一种固相法合成爱啡肽(Eptifibatide)的新方法。
背景技术：
：爱啡肽，又名依非巴特、埃替非巴肽，英文名Eptifibatide,分子式C3sH49Nn09S2，CAS登录号148031-34-9，其结构为IIMpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2Eptifibatide为抗血小板聚集剂，由美国CORTherapeutics公司与美国Schering-Plough公司共同研制开发。1998年7月由Schering-Plough公司以商品名Intrifiban在美国首次上市，1999年以商品名Intrifiban在欧洲上市。异名IntrifibanTM，Sch-60936，C68-22,SB-1。埃替非巴肽为环形肽，是血小板糖蛋白GPlIb/nia受体拮抗剂，可阻断由各种激活剂引起的血小板聚集反应，是已知最强的特异性血小板聚集抑制剂，主要用于防止心肌供氧动脉闭塞，心脏病发作，不稳定性心绞痛、无Q波心肌梗塞、冠脉介入治疗引起的猝死。临床研究结果显示，病人推注埃替非巴肽进行治疗，在术后48小时，死亡或严重问题的联合终点发生率(主要终点指标包括心脏病发作、病死率及需要再次急诊介入或溶栓治疗率)埃替非巴肽比其他剂组减少了37%。死亡或心肌梗死发生率，埃替非巴肽组比其他剂组低40%。Eptifibatide在急性冠脉综合征病人中呈剂量依赖性地抑制体外血小板的聚集，在健康志愿者和做PCI术的病人中能抑制纤维原与二磷酸腺苷活化的血小板结合。对急性冠脉综合征病人，二磷酸腺苷诱导的血小板聚集早在本品注射后5分钟即受到抑制，其在给药期持续的48小时内恢复正常。本品180pg/kg剂量静注和以每分钟2[ig/kg速率静脉输注均能达到抑制血小板聚焦80%以上。4利用枸橼酸盐抗凝剂评价，本品抑制血小板聚焦作用较其它非螯合型抗凝剂强2-4倍。本品可使急性冠脉综合征病人及进行PCI术病人的出血时间延长2-4倍(与其基线值相比)，在停止输注本品后1小时内恢复正常。本品经大鼠、兔和猴的安全性评价试验，未见毒性反应的迹象，给猴连续静脉输注28天，每天剂量高达7.2mg/kg也未见毒性表现。血小板糖蛋白GPlIb/IIIa受体拮抗剂代表了目前介入性心脏病学最大进展之一。大规模、随机、对照临床试验已无可争议地确认了其在心脏病介入治疗中的地位，它可大约减少患者围手术期缺血并发症50%60%，而且，当肝素使用剂量合适时可不明显增加出血事件发生率。Eptifibatide适用于治疗急性冠脉综合征，包括不稳定型心绞痛或无Q波心肌梗塞(既24小时内胸痛持续发作、心电图改变和/或心血管系统酶升高)；也可用于经皮冠脉介入疗法，包括血管成形术或动脉粥样斑块切除术。一般不用于无急性冠脉综合征的血管成形术。在专人监管下，本品可与阿司匹林或肝素辅用。Eptifibatide的优点①对血小板糖蛋白IIb/IIIa受体的阻滞是可逆的，一旦出现不良反应可立即停药，不良反应轻。②选择性高，作用强。③本身几乎无抗原性，不会引起过敏反应。Eptifibatide的制备与其它小的二硫化物连接的肽类相似，可由常规的固相肽合成法或在溶液中进行的碎片合成法制备。现在己经有了一些研究机构和个人发表了一些合成专利CN1500805、EP1735345、US482263、US542488、US5968902和US20060036071等。目前已经公布的Eptifibatide制备工艺都有着一定的缺陷，不能在操作复杂性、危险性、生产周期、产品总收率、产品成本和污染环境等方面达到一种较好的结合；应用价值不高。
发明内容本发明的目的是提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的Eptifibatide固相法合成工艺，解决现有技术存在的缺陷。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案5一种固相法制备Eptifibatide的方法，包括以下步骤1)选择替代度为0.2mmol/g1.0mmol/g的Sieber树脂进行去Fmoc反应，得到H2N-Sieber树脂；2)以H2N-Sieber树脂为起始原料，采用Fmoc/tBu固相法逐一偶联依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂，-3)对侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂进行固相氧化，得到侧链全保护氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂；4)对侧链全保护氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂进行树脂的切割和侧链保护的脱除，得到Eptifibatide粗品；5)Eptifibatide粗品经过高压液相柱分离纯化、冻干机冻干得到Eptifibatide精肽。优选的方案是所述Sieber树脂替代度为0.4mmol/g0.6mmol/g。更为优选的方案是所述具有保护基团的氨基酸氨基均采用Fmoc基团保护，而侧链采用特定保护，各种氨基酸分别以Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc國Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH的形式应用。更为优选的方案是所述的逐一偶联采用的偶联剂体系DIC+A或B+A，其中A为HOBt或者HOAt;B为HBTU或者HATU或者TBTU或者PyBOP。更为优选的方案是所述的逐一偶联采用的偶联剂体系是DIC/HOAt。更为优选的方案是所述侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂进行固相氧化采用的氧化剂是碘，该氧化剂碘的用量是相对于合成规模摩尔数的5-20倍；反应溶剂是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和二甲基亚砜(DMSO)中的一种或者几种混合物；反应时间采用4小时；反应温度2030摄氏度。更为优选的方案是:所述氧化剂碘的用量是相对于合成规模摩尔数的10倍，反应溶剂采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。更为优选的方案是所述对线性肽Eptifibatide-Sieber树脂进行氧化，得到氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂，反应结束反应物碘的清除采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)轮换清洗，然后使用六氢吡啶/DMF溶液进行清洗。更为优选的方案是所述侧链全保护Eptifibatide-Sieber经过脱侧链保护基团的反应，获得Eptifibatide粗品的过程中，使用的裂解液体系是三氟乙酸:水=95:5(v/v)，或者是三氟乙酸:水:三乙基硅垸二90:5:5(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:1,2-乙二硫醇=82.5:5:5:5:2.5(v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:1，2-乙二硫醇:三异丙基硅烷=82.5:5:5:5:2.5:1(v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:1,2-乙二硫醇=90:5:3:2(v/v)。更为优选的方案是所述裂解液体系是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l,2-乙二硫醇二90:5:3:2(v/v)。与已有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果本发明提供了一种反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的Eptifibatide的固相合成工艺。本发明的工艺具有反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。图l是本发明总的工艺流程图。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明说明书和权利要求书中所使用的縮写的含义列如表1所示表1縮略词表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>TBTUO-(苯并三唑-l-氧)-N，N,N，,N，-四甲基脲鑰六氟硼酸盐PyBOP(苯并三唑-l-氧)三吡咯垸子基磷鎗六氟磷酸盐DIC二异丙基碳二亚胺HOBtl-羟基苯并三唑HOAtl-羟基-7-偶氮苯并三唑DIPEA二异丙基乙胺TMP2，4,6-三甲基吡啶pbf2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基Trt三苯甲基但u叔丁基DMFN,N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲烷20%DBLK2(P/。六氢吡啶/DMF溶液Acm乙酰胺基甲基Mpr3-巯基丙酸SieberResin9-氨基-口占吨-3-氧-Merrifield树脂实施例1线性侧链全保护Eptifibatide肽树脂的制备将Sieber树脂100.0g，替代度为0.6mmol/g，加入到固相反应柱中，用DMF溶胀树脂30分钟。溶胀完全后，用20%DBLK去Fmoc保护10min+20min，后用DMF洗涤六次。将Fmoc-Cys(Acm)-OH49.74g、HBTU38.52g、HOBt16.2g和DIPEA41.8ml加入到反应柱中，反应两小时结束。重复前面的操作，分别对Fmoc画Pro-OH、Fmoc國Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Homoarg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH进行偶联。偶联结束，树脂用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，甲醇收缩三次，真空干燥后称重得到172.1g线性侧链全保护Eptifibatide肽树脂。本实施例的另一优选方案是将Sieber树8脂1200.0g，替代度为0.59mmol/g，加入到固相反应柱中，用DMF溶胀树脂30分钟。溶胀完全后，用20%DBLK去Fmoc保护10min+20min，后用DMF洗涤六次。将Fmoc-Cys(Acm)陽OH597g、HBTU462g、HOBt194g和DIPEA502ml加入到反应柱中，反应三小时结束。重复前面的操作，分别对Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Homoarg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH进行偶联。偶联结束，树脂用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，甲醇收縮三次，真空干燥后称重得到2031g线性侧链全保护Eptifibatide肽树脂。实施例2氧化型侧链全保护Eptifibatide肽树脂的制备将172.1g线性侧链全保护Eptifibatide肽树脂用DMF溶胀30分钟。溶胀完全后，将用适量DMF溶解的304.8g碘加入到装有树脂的反应柱中，氧化反应2小时。反应结束，用DMF洗涤十次，DCM洗涤三次，甲醇收縮三次，真空干燥后称重得到164.1g氧化型侧链全保护Eptifibatide肽树脂。实施例3氧化型侧链全保护Eptifibatide肽树脂的制备将1893g线性侧链全保护Eptifibatide肽树脂用DMF溶胀30分钟。溶胀完全后，将用适量DMF溶解的3350g碘加入到装有树脂的反应柱中，氧化反应3小时。反应结束，用DMF洗涤十次，DCM洗涤三次，甲醇收縮三次，真空干燥后称重得到1740g氧化型侧链全保护Eptifibatide肽树脂。实施例4Eptifibatide粗肽的制备将164.1g氧化型侧链全保护Eptifibatide肽树脂加入至3L的圆底烧瓶中，后加入1641ml裂解液(配比三氟乙酸水三异丙基硅烷=95:2.5:2.5)，反应两小时。裂解反应结束，过滤，滤液用16.4L冰乙醚沉淀、离心、洗涤、再离心、再洗涤、再离心，最后真空干燥。称重得到Eptifibatide粗肽46.9g。实施例5Eptifibatide粗肽的制备将1477g氧化型侧链全保护Eptifibatide肽树脂加入至30L的反应瓶中，后加入14.8L裂解液(配比三氟乙酸水三异丙基硅垸=95:2.5:2.5)，反应两小时。裂解反应结束，过滤，滤液用140L冰乙醚沉淀、离心、洗涤、再离心、再洗涤、再离心，最后真空干燥。称重得到Eptifibatide粗肽420g。实施例6Eptifibatide精肽的制备将Eptifibatide粗肽46.9g采用高压液相制备后，经过转盐、冻干，最后称重得到Eptifibatide精肽30.9g。总收率可达61.2%。实施例7Eptifibatide精肽的制备将Eptifibatide粗肽375g采用高压液相制备后，经过转盐、冻干，最后称重得到Eptifibatide精肽251g。总收率可达62.3%。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。权利要求1.一种固相法制备Eptifibatide的方法，包括以下步骤1)选择替代度为0.2mmol/g～1.0mmol/g的Sieber树脂进行去Fmoc反应，得到H2N-Sieber树脂；2)以H2N-Sieber树脂为起始原料，采用Fmoc/tBu固相法逐一偶联依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂；3)对侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂进行固相氧化，得到侧链全保护氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂；4)对侧链全保护氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂进行树脂的切割和侧链保护的脱除，得到Eptifibatide粗品；5)Eptifibatide粗品经过高压液相柱分离纯化、冻干机冻干得到Eptifibatide精肽。2.根据权利要求l所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述Sieber树脂替代度为0.4mmol/g0.6mmol/g。3.根据权利要求l所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述具有保护基团的氨基酸氨基均采用Fmoc基团保护，而侧链采用特定保护，各种氨基酸分别以Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Pro隱OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH的形式应用。4.根据权利要求l所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述的逐一偶联采用的偶联剂体系是DIC+A或B+A，其中A为HOBt或者HOAt;B为HBTU或者HATU或者TBTU或者PyBOP。5.根据权利要求4所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述的逐一偶联采用的偶联剂体系是DIC/HOAt。6.根据权利要求1所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于:所述对侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂进行固相氧化采用的氧化剂是碘，该氧化剂碘的用量是相对于合成规模摩尔数的5-20倍；反应溶剂是N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲垸、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜中的一种或者几种混合物;反应时间采用4小时；反应温度2030摄氏度。7.根据权利要求6所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述氧化剂碘的用量是相对于合成规模摩尔数的10倍，反应溶剂采用N，N-二甲基甲酰胺。8.根据权利要求l所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述对线性肽Eptifibatide-Sieber树脂进行氧化，得到氧化肽Eptifibatide-Sieber树月旨，反应结束反应物碘的清除采用N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷轮换清洗，然后使用六氢吡啶/DMF溶液进行清洗。9.根据权利要求l所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述侧链全保护Eptifibatide-Sieber经过脱侧链保护基团的反应，获得Eptifibatide粗品的过程中，使用的裂解液体系是三氟乙酸:水-95:5(v/v)，或者是三氟乙酸:水:三乙基硅烷=90:5:5(v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l，2-乙二硫醇=82.5:5:5:5:2.5(v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l,2-乙二硫醇:三异丙基硅烷=82.5:5:5:5:2.5:1(v/v)，或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l，2-乙二硫醇-90:5:3:2(v/v)。10.根据权利要求9所述固相法制备Eptifibatide的方法，其特征在于所述裂解液体系是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l,2-乙二硫醇-90:5:3:2(v/v)。全文摘要本发明公开了一种固相法制备Eptifibatide的方法，包括步骤1)选择Sieber树脂进行去Fmoc反应，得到H<sub>2</sub>N-Sieber树脂；2)采用Fmoc/tBu固相法逐一偶联合成侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂；3)进行树脂固相氧化，得到侧链全保护氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂；4)进行树脂的切割和侧链保护的脱除，得到Eptifibatide粗品；5)分离纯化、冻干机冻干得到Eptifibatide精肽。本发明的工艺操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。文档编号C07K7/00GK101538316SQ20091010499公开日2009年9月23日申请日期2009年1月13日优先权日2009年1月13日发明者李红玲,袁建成,覃亮政,马亚平申请人:深圳市翰宇药业有限公司