专利名称：骨髓脂肪细胞的分离方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织工程中的种子细胞，尤其涉及骨髓中的骨髓脂肪细胞。
背景技术：
骨髓内含有骨髓基质细胞(BMSC)，BMSC可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，甚至神经元和肌纤维细胞。正因为其较强的体外增殖和多向分化能力，BMSC成为组织工程重要的种子细胞来源。但骨髓的抽取来源有限，每个成人只能抽取10～20ml骨髓，所以由此获取的种子细胞量受到一定的限制。
成人骨髓90％以上为脂肪细胞，骨髓基质中脂肪细胞的生成与骨骼的发育阶段、年龄、造血组织的水平等多种因素相关，具有多方面的病理生理功能。但普遍认为骨髓脂肪细胞不具有种子细胞的特性，长期以来一直被认为只发挥被动填充骨髓腔，支持造血和成骨以及作为局部能量贮存库的作用。因此在传统的骨髓间充质干细胞分离过程中为防止脂肪细胞的污染而将脂肪层吸弃。
目前许多研究表明骨髓脂肪细胞是与其它骨髓基质细胞谱系一样的拥有多潜能的间充质干细胞，且相互之间存在部分功能重叠。在骨髓微环境中，骨髓脂肪细胞与骨生成、造血生成和破骨细胞生成密切相关。因此，本领域迫切需要开发新的适合作为种子细胞的细胞来源。
发明内容
本发明旨在利用普通培养液获得骨髓脂肪细胞的方法；本发明的另一个目的是将所获得的骨髓脂肪细胞用作组织工程种子细胞；本发明的另一个目的是由所述的骨髓脂肪细胞组成的组织工程化的脂肪组织移植物。
在本发明的第一个方面，提供了一种获得骨髓脂肪细胞的方法，它包括步骤a.用磷酸盐(PBS)缓冲液稀释骨髓，1000-2500r/min离心5-15min，吸取上层脂肪层，以含5-15％胎牛血清的DMEM-LG培养液贴壁培养；b.待细胞生长近融合时，以0.125-0.5％胰蛋白酶消化，按步骤a的培养条件以5-10×103/cm2的密度接种传代培养即得。
其中在步骤a中使用磷酸盐(PBS)缓冲液稀释骨髓，1000-2500r/min离心5-15min，吸取上层脂肪层，以含5-15％胎牛血清的DMEM-LG培养液贴壁培养。
在本发明的第二方面，提供了一种根据上述方法得到的骨髓脂肪细胞，所述的骨髓脂肪细胞具有多向分化能力；而且它具有选自下组的特性(i)成骨分化能力和成脂分化能力；(ii)细胞表面有脂肪细胞的表面标志物CD49d。
上述的骨髓脂肪细胞还表达过氧化物酶体增殖子激活受体(PPARγ2)、CCAAT增强结合蛋白以及由其介导的瘦素(leptin)基因。
本发明的第三方面，提供了上述骨髓脂肪细胞在组织工程中作为种子细胞的应用。
上述的骨髓脂肪细胞可用于获得成骨细胞，包括步骤a.在含有5-15％胎牛血清、0.01～0.1μmol/L地塞米松、10～50μmol/L L-α-抗坏血酸磷酸酯、1～10mmol/L β-磷酸甘油钠、1～10nmol/L 1，25(OH)2VD3的DMEM培养基中进行成骨诱导培养，从而得到成骨细胞。
上述的骨髓脂肪细胞可用于获得脂肪细胞，包括步骤a.在含5-15％胎牛血清、0.5～1m mol/L异丁基甲基嘌呤、0.5～1μmol/L地塞米松、5～10μmol/L胰岛素、100～200μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基中进行成脂诱导培养，从而得到脂肪细胞。
本发明的第四方面，提供了一种组织工程化脂肪组织移植物，它包括(a)生物可降解材料；和(b)接种于所述生物可降解材料的上述骨髓脂肪细胞，其中生物可降解材料与骨髓脂肪细胞的比例为1g生物可降解材料104-108个细胞。较佳地为105-107个细胞。
其中所述的生物可降解材料是PGA。
在另一优选例中，所述的移植物还含有选自下组的细胞因子bFGF碱性成纤维细胞生长因子、地塞米松、消炎痛(吲哚美辛)、胰岛素。
图1骨髓脂肪细胞P3 放大倍数40；图2脂肪细胞标志的RT-PCR结果(左为骨髓脂肪细胞，右为骨髓基质细胞)；图3骨髓脂肪细胞成骨诱导P5 放大倍数40；图4骨髓脂肪细胞OPN P5 放大倍数200；图5骨髓脂肪细胞BSP P5 放大倍数200；图6钙结节茜素红染色 放大倍数40；图7骨髓脂肪细胞P5成骨诱导；图8骨髓脂肪细胞P5成骨诱导 放大倍数100；图9油红-O染色 放大倍数100；图10裸鼠体内回植8周后诱导(左为诱导组，右为未诱导组)；图11骨髓脂肪细胞P5体内成脂HE 放大倍数40；图12骨髓基质细胞P3 放大倍数40；图13骨髓基质细胞成骨诱导P5 放大倍数40；图14PGA支架材料。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，发现占成人骨髓90％以上的脂肪细胞具有多能干细胞潜能，从而建立了一种在普通培养液中获取骨髓脂肪细胞的方法；本发明人将用该方法获得的骨髓脂肪细胞向成骨和成脂进行诱导分化，得到了成骨和脂肪细胞，显示骨髓脂肪细胞可以作为组织工程的种子细胞；本发明人将所获得的骨髓脂肪细胞与生物可降解材料组成组织工程化的脂肪组织移植物。
本发明所称的骨髓脂肪细胞来源于骨髓，例如来自自体的骨髓。分离获得骨髓的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自体骨髓。
在本发明的一个方面，是提供一种获得骨髓脂肪细胞的方法，它包括步骤a.用盐缓冲液稀释骨髓，1000-2500r/min离心5-15min，吸取上层脂肪层，以含5-10％胎牛血清的DMEM-LG培养液贴壁培养；b.待细胞生长近融合时，以0.125-0.5％胰蛋白酶消化，按步骤a的培养条件以5-10×103/cm2的密度接种传代培养即得。
其中的盐缓冲液优选磷酸盐(PBS)缓冲液；优选在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下贴壁培养。
种子细胞的数量一直是困扰组织工程的瓶颈问题，本发明所获得的骨髓脂肪细胞细胞量可达到同一骨髓所获骨髓基质细胞细胞量的1/3至1/2，这样的细胞量足以显示其临床应用价值。
在本发明的另一方面，是提供了用上述方法所获得的骨髓脂肪细胞(BMA)，它是骨髓脂肪层中存在的与其它骨髓基质细胞谱系一样的拥有多潜能的间充质干细胞。作为多潜能的间充质干细胞，它具有同骨髓基质细胞相似的纺锤形或梭形的细胞形态，与成熟的脂肪细胞形态不同，不具有脂滴。目前认为它与体内脂肪代谢、支持造血以及骨质疏松和骨量减少等骨代谢的病理和生理过程有关。
骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞(BMSC)原代细胞克隆形态相似，且传代后生长状态也相似。BMA和BMSC均不表达造血细胞系的表面标志CD34、CD45、CD14以及内皮细胞系的表面标志CD31，但均表达间充质细胞系的表面标志CD105、CD166，这说明BMA和BMSC都属于骨髓间充质细胞系。仅BMA表达脂肪细胞的表面标志CD49d，BMA和BMSC虽然都表达PPARγ2(过氧化物酶体增殖子激活受体)，但唯有BMA表达C/EBPα(CCAAT增强子结合蛋白)以及由其介导的leptin基因。C/EBPα和PPARγ可反式激活脂肪细胞特定基因，参与前体脂肪细胞定型所必须的生长停滞过程，Leptin由脂肪细胞分泌，它以自分泌的形式增加UCP2(uncoupling protein 2)的表达，并削弱胰岛素的作用。
本发明所提供的骨髓脂肪细胞具有种子细胞特性，有多向分化潜能，可以分化为成骨细胞和成脂细胞。
在本发明的另一方面，是将上述的骨髓脂肪细胞分化为成骨细胞，包括步骤在含有5-15％胎牛血清、0.01～0.1μmol/L地塞米松、10～50μmol/L L-α-抗坏血酸磷酸酯、1～10mmol/L β-磷酸甘油钠、1～10nmol/L 1，25(OH)2VD3的DMEM培养基中进行成骨诱导培养，即得。
在本发明的另一方面，是将上述的骨髓脂肪细胞分化为脂肪细胞，包括步骤在含5-15％胎牛血清、0.5～1m mol/L异丁基甲基嘌呤、0.5～1μmol/L地塞米松、5～10μmol/L胰岛素、100～200μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基中进行成脂诱导培养，即得。
在本发明的另一方面，是提供一种组织工程化脂肪组织移植物，它是骨髓脂肪细胞与生物可降解材料的复合体。
可用于本发明的组织工程化脂肪的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。
本发明的主要优点在于1、能获得较多量的骨髓脂肪细胞；2、所获得的骨髓脂肪细胞可作为一种有充足来源的种子细胞；3、所获得的移植物更符合生理特点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1骨髓脂肪细胞的获得和培养1.骨髓标本来自本院成人检查骨髓正常结果者共35例，年龄介于12～45岁之间，平均年龄32岁；2.用等量的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释骨髓，2000r/min离心10min，吸取上层脂肪层，以含10％胎牛血清(FBS，GIBCO)的DMEM-LG(GIBCO BRL)培养液于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下贴壁培养；3.待细胞生长近融合时，以0.25％胰蛋白酶消化，按步骤2的培养条件以5.0×104/cm2的密度接种传代培养，得到骨髓脂肪细胞。
结果见图1。
结果表明骨髓脂肪细胞呈纺锤形或梭形，原代呈集落样生长，接种后12～15天可达90％以上的融合。传代后的BMA与成纤维细胞生长特性相似，细胞以梭形为主，排列有一定的方向性。
实施例2骨髓基质细胞的获得和培养1.采用密度梯度离心法，将去除脂肪层的骨髓置于Percoll(密度1.073g/ml，Pharmacia)的液面上，900g离心30min；2.取中层云雾状有核细胞层(去除脂肪细胞后的其余细胞的混合物)，PBS冲洗，300G离心15min，弃去上清，以20×106有核细胞接种于直径为10cm的培养皿内；3.以含10％胎牛血清的DMEM-LG培养液悬，于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养；4.待细胞生长近融合时，以0.25％胰蛋白酶消化，按步骤3的培养条件以5.0×104/cm2的密度接种传代培养，得到骨髓基质细胞。
结果见图12。
结果表明骨髓基质细胞呈纺锤形或梭形，原代呈集落样生长，接种后9～12天可达90％以上的融合。传代后的BMA与成纤维细胞生长特性相似，细胞以梭形为主，排列有一定的方向性。
实施例3骨髓脂肪细胞成骨诱导培养1.将实施例1的骨髓脂肪细胞第三、五、七代的细胞用于体外成骨诱导；2.在含有10％胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松(Sigma)、10μmol/L L-α-抗坏血酸磷酸酯(sigma)、6mmol/L β-磷酸甘油钠(sigma)、10nmol/L1，25(OH)2VD3(sigma)的DMEM培养基中进行成骨诱导培养；3.体外培养四周后检测特殊染色检测钙结节、免疫荧光染色OPN、BSP；RT-PCR检测 OPN、ONN、AKP、Col I、Col III。
结果见图3、图4、图5、图6、图7。
结果表明a.倒置相差显微镜观察发现骨髓脂肪细胞在成骨诱导中细胞形态逐渐由长梭形转变为立方形和多角形并体积增大。(图3)b.成骨诱导的骨髓脂肪细胞表达OPN和BSP。(图4、图5)c.成骨诱导P3代骨髓脂肪细胞融合后继续培养两周，形成细胞结节，中心出现基质沉积，培养皿底部可见白色斑块，茜素红染色显示钙结节。(图6)d.骨髓脂肪细胞成骨诱导的P5代细胞通过OPN引物扩增在400bp附近得到一条阳性条带，符合目的基因长度；通过ONN引物扩增在500bp与600bp之间得到一条阳性条带，符合目的基因长度；通过AKP引物扩增在500bp与600bp之间得到一条阳性条带，符合目的基因长度；通过COL I引物扩增骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞在300bp以下得到一条阳性条带，符合目的基因长度(图7)。
实施例4骨髓脂肪细胞成脂肪诱导培养1.将实施例1的骨髓脂肪细胞第三、五、七代的细胞用于体外成脂诱导；2.在含10％胎牛血清、0.5m mol/L异丁基甲基嘌呤、1μmol/L地塞米松、8μmol/L胰岛素、180μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基中进行成脂诱导培养；3.体外诱导成脂检测油红染色；结果见图8、图9。
结果表明a.倒置相差显微镜观察发现骨髓脂肪细胞经成脂诱导后细胞形态明显变化，细胞体积变大，逐渐有梭形变为椭圆形，胞内出现脂滴，且细胞增值明显减慢。(图8)b.成脂诱导的骨髓脂肪细胞P5至P7代细胞胞浆内的脂滴红染，表明细胞已分化为成熟的脂肪细胞。(图9)实施例5骨髓脂肪细胞制得脂肪组织移植物1.将实施例1的骨髓脂肪细胞第三代细胞与PGA材料复合体外诱导成脂两周后，回植裸鼠体内诱导八周；
2.体内诱导成脂检测苏木素-伊红(HE)染色；HLA染色。
结果见图10、图11。
结果表明a.裸鼠体内成脂诱导组可见形成成熟脂肪样组织，未诱导组未见形成脂肪组织且PGA材料基本吸收。(图10)b.成脂诱导的骨髓脂肪细胞与PGA复合后裸鼠体内回植8周后形成成熟的脂肪组织，可见脂肪组织样结构。(图11)聚羟基乙酸(PGA)生物材料的制备17mg PGA均匀地嵌入预制的圆柱状(内直径5mm，高1mm)硅胶模具内，负压成型24h后取出，制成直径5mm，高1mm的PGA材料支架(图14)。以75％酒精浸泡消毒30min，PBS反复冲洗3次后吸干备用。
对比实施例6骨髓基质细胞成骨诱导培养按实施例3的方法进行成骨诱导培养，结果见图13。
结果表明骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞在成骨诱导中细胞形态都逐渐由长梭形转变为立方形和多角形并体积增大，图13；成骨诱导的骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞都表达OPN和BSP；通过COL I引物扩增骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞在300bp以下得到一条阳性条带，符合目的基因长度，图7。
对比实施例7骨髓基质细胞成脂肪诱导培养按实施例4的方法进行成脂肪诱导培养。
结果表明骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞一样，具有分化为脂肪细胞的能力。
实施例8脂肪细胞标志物检测1.将由实施例1和实施例2分别获得的骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞的第三代细胞用于流式细胞仪，结果为流式细胞仪检测阳性细胞率(％)
2.将由实施例1和实施例2分别获得的骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞的第三代细胞用于RT-PCR检测，结果见图2。
结果表明仅骨髓脂肪细胞表达脂肪细胞的表面标志CD49d；骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞虽然都表达PPARγ2(过氧化物酶体增殖子激活受体)，但唯有骨髓脂肪细胞表达C/EBPα(CCAAT增强子结合蛋白)以及由其介导的leptin基因。显示骨髓脂肪细胞和骨髓基质细胞虽同属于骨髓间充质细胞系，不过BMA更倾向于脂肪细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种获得骨髓脂肪细胞的方法，它包括步骤a.用磷酸盐(PBS)缓冲液稀释骨髓，1000-2500r/min离心5-15min，吸取上层脂肪层，以含5-15％胎牛血清的DMEM-LG培养液贴壁培养；b.待细胞生长近融合时，以0.125-0.5％胰蛋白酶消化，按步骤a的培养条件以5-10×103/cm2的密度接种传代培养即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a中使用磷酸盐(PBS)缓冲液稀释骨髓，1000-2500r/min离心5-15min，吸取上层脂肪层，以含5-15％胎牛血清的DMEM-LG培养液贴壁培养。
3.一种根据权利要求1的方法得到的骨髓脂肪细胞，其特征在于，它具有多向分化能力。
4.如权利要求3所述的骨髓脂肪细胞，其特征在于，它具有选自下组的特性(i)成骨分化能力和成脂分化能力；(ii)细胞表面有脂肪细胞的表面标志物CD49d。
5.如权利要求3或4所述的骨髓脂肪细胞，其特征在于，它表达过氧化物酶体增殖子激活受体(PPARγ2)、CCAAT增强结合蛋白以及由其介导的瘦素(leptin)基因。
6.一种根据权利要求1的方法得到的骨髓脂肪细胞在组织工程中作为种子细胞的应用。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，将所述的骨髓脂肪细胞用于获得成骨细胞，包括步骤a.在含有5-15％胎牛血清、0.01～0.1μmol/L地塞米松、10～50μmol/LL-α-抗坏血酸磷酸酯、1～10mmol/Lβ-磷酸甘油钠、1～10nmol/L 1，25(OH)2VD3的DMEM培养基中进行成骨诱导培养，从而得到成骨细胞。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，将所述的骨髓脂肪细胞用于获得脂肪细胞，包括步骤a.在含5-15％胎牛血清、0.5～1mmol/L异丁基甲基嘌呤、0.5～1μmol/L地塞米松、5～10μmol/L胰岛素、100～200μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基中进行成脂诱导培养，从而得到脂肪细胞。
9.一种组织工程化脂肪组织移植物，其特征在于，它包括(a)生物可降解材料；和(b)接种于所述生物可降解材料的如权利要求3所述的骨髓脂肪细胞，其中生物可降解材料与骨髓脂肪细胞的比例为1g生物可降解材料104-108个细胞。
10.如权利要求9所述的移植物，其特征在于，所述的生物可降解材料是PGA。
全文摘要
本发明提供了骨髓脂肪细胞的分离方法及其用途。本发明的骨髓脂肪细胞可作为组织工程中的种子细胞。本发明还提供了由所述的骨髓脂肪细胞组成的组织工程化的脂肪组织移植物。本发明方法能获得较多量的骨髓脂肪细胞，获得的骨髓脂肪细胞可作为一种有充足来源的种子细胞，而且所获得的移植物更符合生理特点。
文档编号C12N5/08GK1952118SQ200510031030
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者陈凡凡, 崔磊, 曹谊林 申请人:上海国睿生命科技有限公司