专利名称：用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及干细胞的分离培养技术，具体地说，涉及一种利用骨髓组织块分离及 培养禽类骨髓间充质干细胞的方法。
背景技术：
骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell，BMSC)是一群具有多向分化 潜能的干细胞，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞、神经细胞和心肌细胞 等等。这一特性使得BMSC成为理想的种子细胞应用于组织工程中，在细胞工程、基因治疗 及器官移植等领域具有重要意义。BMSC具有单个贴壁生长形成克隆，成为集落形成成纤维 样细胞(colony-forming fibroblastic units, CFU-F)。CFU-F 成为鉴定骨髓间充质干细 胞的手段之一。体外BMSC呈梭形，表达CD44、⑶73、⑶29、⑶106、⑶105、CD90等，不表达 ⑶；34、⑶45和⑶14等，由于尚未发现BMSC的特异性标记分子，⑶44+、⑶45\⑶73+、⑶四+、 ⑶106+、⑶105+、⑶90+，可用来间接对骨髓间充质干细胞进行表型鉴定。目前，人和啮齿动物的BMSC的体外分离培养及分化潜能的研究较为广泛，主要方 法为密度梯度离心法、贴壁筛选法和免疫分离法。密度梯度离心法根据不同细胞密度不同 原理利用Percoll分离液将BMSC分离出来，方法简单，但BMSC获得率较低。贴壁筛选法一 般将骨髓吹打为单细胞悬浮液，进行全血细胞贴壁4-12小时，根据不同细胞贴壁特性进行 分离得到的BMSC，操作简单，但细胞均一性较差，细胞的实质是多种类型细胞的混合，抗原 差异性也较大，细胞克隆化能力、继代培养和扩增能力均较低。免疫分离法可以根据细胞表 面标志进行富集或根据表面负表达抗原进行负分选，能更好的分离纯化BMSC，但是对细胞 活性影响较大，费用高，所需样本量较大。目前，针对禽类BMSC的研究相对较少，主要原因在于禽类的BMSC分离困难，基本 采用上述已有的方法，费用较高同时存在BMSC获得率和所得细胞分化潜能均较差等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的 新方法。为了实现本发明目的，本发明的一种利用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质 干细胞的方法，其是将禽类骨髓碎块悬浮于胎牛血清中，然后将该血清悬浮液移至培养皿 中，倾斜放置一段时间，去除血清后加入完全培养液贴壁培养，获得原代培养细胞；经胰蛋 白酶消化后进行传代，然后以完全培养液培养，传代2-4次后获得禽类骨髓间充质干细胞， 在体外培养体系中继代扩增培养；其中，所述完全培养液为含有10%胎牛血清的低糖DMEM 培养液。前述的方法，所述倾斜放置是培养皿与水平面呈30-60度角。前述的方法，倾斜放置放置的时间为40-60分钟。前述的方法，去除血清后加入完全培养液贴壁培养的时间为3-6天，优选为3天。
前述的方法，原代培养细胞经胰蛋白酶消化后，以1 2-3的比例传代，优选为 1 3的比例传代。 前述的方法，禽类骨髓来自于禽类的股骨和/或肱骨。前述的方法，所述禽类骨髓碎块为1 2mm3。前述的方法，贴壁培养的密度为0. 5 1骨髓组织碎块/cm2。前述的方法，继代扩增培养时细胞接种密度为IX IO5 IX IO6个细胞/cm2。具体地，本发明提供的禽类骨髓间充质干细胞的分离及体外扩增培养方法包括1)原代培养取禽类股骨和肱骨，取出骨髓放入离心管中，用剪刀将骨髓剪碎至 1 2mm3，向离心管中加入500 800 μ 1胎牛血清，移液器缓慢吹打至骨髓组织块悬浮，移 置到IOOmm培养皿中，将培养皿放入二氧化碳培养箱中，与水平面呈30 60度角倾斜放置 40 60分钟，将血清去除后加入IOml完全培养液培养3天，获得原代细胞。完全培养液成 分为低糖 DMEM 培养液(Dulbecco' s modification ofEagle' s medium Dulbecco，改良 Eagle培养基)+10%胎牛血清。2)传代培养将培养皿中的培养液去除，加入5ml，0. 25%胰蛋白酶消化原代细 胞，显微镜下观察梭形细胞逐渐变圆后去除胰蛋白酶，加入6mlDMEM用移液器吹打细胞后， 平均分至3个培养皿中以完全培养液培养，为Pl代细胞。Pl代细胞培养3天，将培养液去 除，胰蛋白酶消化，显微镜下观察梭形细胞逐渐变圆，将胰蛋白酶吸出，加入DMEM用移液器 吹打，将圆形细胞吹起，吸出，1 3比例以完全培养液传代培养，获得P2代细胞，其他杂细 胞继续贴在培养皿底部(差速消化法)，P2代细胞即为经纯化的禽类骨髓间充质干细胞。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(一 )本发明中禽类骨髓间充质干细胞的分离方法是骨髓组织块直接贴壁法，而 非以往的细胞密度梯度离心，大大降低了分离细胞时细胞分离液以及离心环境对细胞造成 的化学及机械刺激，减少细胞损伤，由此方法分离的骨髓间充质干细胞具有比较好的增殖 潜能和分化潜力。( 二)本发明中禽类骨髓间充质干细胞的分离方法是骨髓组织块直接贴壁法，骨 髓间充质干细胞从骨髓组织块中生长爬出，细胞类型单一；传统的全骨髓贴壁法是将全骨 髓吹打制成单细胞悬液后进行贴壁培养，贴壁细胞中包括大量杂细胞。采用本发明方法获 得的骨髓间充质干细胞较纯，简化了后期纯化过程，提高纯化效率。(三)本发明中骨髓组织块贴壁培养过程中培养皿采用倾斜静置法，使得例如红 细胞等未贴壁的细胞可随血清流动至培养皿边缘，待去除血清时随之将大部分杂细胞剔 除，由此方法分离的骨髓间充质干细胞纯度较高，且纯化过程相对较短，骨髓间充质干细胞 活力较强。(四)本发明获得的骨髓间充质干细胞能够在体外生长并稳定传代，具有典型的 梭形形态，生长速度快，本发明所述方法简单易行，可操作性强，适合应用于组织工程学和 基因治疗领域。
图1为本发明方法获得的骨髓间充质干细胞形态学观察结果。图2A和图2B分别为本发明方法获得的骨髓间充质干细胞的抗体检测以及RT-PCR检测结果。图3为本发明方法获得的骨髓间充质干细胞的成集落能力(CFU-F)检测结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1鸡骨髓间充质干细胞分离培养(1)鸡骨髓间充质干细胞的分离和原代培养取5日龄白来航鸡股骨和肱骨，去两端骨骺，用骨剪将骨剪开，取出骨髓放入5ml 离心管中，用手术剪剪碎至l_2mm3，加入800 μ 1胎牛血清，用移液器缓慢吹打使得骨髓碎块 悬浮，移置到IOOmm培养皿中，用移液器整理使得骨髓碎块在培养皿中均勻分布，将培养皿 放入二氧化碳培养箱，37 0C，90%湿度，5% CO2，倾斜60度角放置60分钟后，将培养皿取出， 吸净培养皿中的血清，缓慢加入完全培养液(含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养液)，培 养3天，得到鸡骨髓间充质干细胞原代(Ρ0代)细胞。(2)鸡骨髓间充质干细胞的传代培养取鸡骨髓间充质干细胞原代细胞，倒掉其中培养液，PBS清洗2遍，加入0. 25%胰 蛋白酶消化，显微镜下观察细胞由梭形逐渐变成圆形时，将胰蛋白酶倒掉，向培养皿中缓慢 加入6ml DMEM吹打，使得培养皿中的骨髓间充质干细胞悬浮，其它杂细胞则继续留在培养 皿底部(差速消化法)，将DMEM悬液平均加入3个IOOmm培养皿中，再向每个培养皿中加入 7ml DMEM和Iml胎牛血清，培养3天，重复同样方法传代，可得到纯化的鸡骨髓间充质干细 胞。(3)骨髓间充质细胞的鉴定鸡骨髓间充质干细胞的形态学观察鸡骨髓间充质干细胞原代培养3天后，显微 镜XlOO下观察细胞，骨髓碎块周围已爬出大量梭形细胞紧密排列，随着细胞的传代，细胞 逐渐以平行或放射状排列，呈梭形或星形。如图1所示，PO代(原代)细胞呈短梭形，从骨 髓组织块(黑色实心块状物)中爬出；P2代细胞贴壁分裂增殖；P3代细胞逐渐形成平行状 排列，P4代细胞呈梭形，细胞形态较好。鸡骨髓间充质干细胞表面抗原单克隆抗体鉴定取P3代细胞接种于96孔培养板， 培养M小时，PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛50ul，4°C固定30分钟，去除固定液，PBS清洗 3遍，加入抗体染液50ul和浓度为50ng/ml的hoestch33342 5ul，避光4°C染色1小时。弃 去染色，PBS清洗3遍，在倒置荧光显微镜下观察，CD44、CD45激发波长550nm，hoestch33342 激发波长360nm。抗体检测结果如图2A所示，⑶44呈阳性，⑶45呈阴性。鸡骨髓间充质干细胞RT-PCR检测利用TRIZOL方法提取骨髓和分离P3代细 胞的总 RNA，取 3yg 总 RNA 使用反转录试剂盒 PrimeScriptlst Strand cDNA Synthesis Kit (Takara 公司)合成 cDNA。以 cDNA 为模板，力Π 入 GAPDH(上游5，-CTGAGAACGGGAAACTTGTG-3，，下游 5，-CCACAACATACTCAGCACCTG-3，，105bp)、CD106 (上游5，-TCCTATCATTGAGACCAGTG-3，，下 游5，-TTTGTGCTGACATCTCCTTC-3，，159bp)、CD73 (上游5，-GGCATCGTTGGCTACACTAC-3，， 下 游5‘ -ATGTCCACAGTAAAGCCAGAG-3' , 167bp)、CD29 (上 游 5， -GGAGAAATGTTACACGGCTG-3，，下游5， -GGAGAAATGTTACACGGCTG-3，，163bp)、 CD105(上游5，-GAACCTCCTCATCCACACTG-3，，下游5，-GCTCGCTGTAGGATGTGATG-3，，13lbp)、CD90 (上 游5，-TGCCGCTATGAGAACAAGAC-3，，下游5，-CTCATCGCTGGTGGTGAAG-3，，186bp)弓丨物和 PCRmix (Takara公司)进行扩增反应。反应条件95°C 5min，温度分别为95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 72°C lOmin，循环数32个。RT-PCR检测结果如图2B所示，结果显示分离细胞表达 CD73、CD29、CD106、CD105、CD90 基因。骨髓间充质干细胞成集落(CFU-F)能力检测取P3代细胞，按500、1000、1500、 2000,2500个细胞/cm2的密度将细胞接种于6孔板中，加入完全培养液，二氧化碳培养箱 37°C，90%湿度，5% CO2条件下培养，每3天换液一次，20天后可形成集落形态，即为CFU-F 集落。将细胞用4%多聚甲醛固定30min后，0. 结晶紫染色30min，计数。结果如图3所 示，细胞接种密度分别为500、1000、1500、2000、2500个细胞/cm2，经过20天培养，分别形成 1. 2,1. 8,3. 6,4. 5,6. O个克隆cm2，结果显示，所分离骨髓间充质干细胞具有增殖和自我更 新并形成克隆的能力。实施例2鸭骨髓间充质干细胞分离培养(1)鸭骨髓间充质干细胞的分离和原代培养取3日龄北京鸭股骨和肱骨，去两端骨骺，用骨剪将骨剪开，取出骨髓放入5ml离 心管中，用手术剪剪碎至l_2mm3，加入500 μ 1胎牛血清，用移液器缓慢吹打使得骨髓碎块悬 浮，移置到IOOmm培养皿中，用移液器整理使得骨髓碎块在培养皿中均勻分布，将培养皿放 入二氧化碳培养箱，37 0C，90%湿度，5% CO2，倾斜45度角放置40分钟后，将培养皿取出，吸 净培养皿中的血清，缓慢加入完全培养液(低糖DMEM培养液，10%胎牛血清)，培养3天，得 到鸭骨髓间充质干细胞原代细胞。(2)鸭骨髓间充质干细胞的传代培养取鸭骨髓间充质干细胞原代细胞，倒掉其中培养液，PBS清洗2遍，加入0. 25%胰 蛋白酶消化，显微镜下观察细胞由梭形逐渐变成圆形时，将胰蛋白酶倒掉，向培养皿中缓慢 加入:3ml DMEM吹打，使得培养皿中的骨髓间充质干细胞悬浮，其它杂细胞则继续留在培养 皿底部(差速消化法)，将DMEM悬液平均加入3个IOOmm培养皿中，再向每个培养皿中加 入7mlDMEM和Iml胎牛血清，培养3天，重复同样方法传代，可得到纯化的鸭骨髓间充质干 细胞。(3)骨髓间充质细胞的鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原抗体鉴定取P4代细胞接种于96孔培养板，培养M 小时，PBS清洗3遍，加入4 %多聚甲醛50 μ 1，4°C固定30分钟，去除固定液，PBS清洗3遍， 加入抗体染液50 μ 1，避光4°C染色1小时。弃去染色，PBS清洗3遍，在倒置荧光显微镜下 观察，⑶44、⑶45激发波长550nm。抗体检测结果显示，⑶44呈阳性，⑶45呈阴性。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种利用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，将禽 类骨髓碎块悬浮于胎牛血清中，然后将该血清悬浮液移至培养皿中，倾斜放置一段时间，去 除血清后加入完全培养液贴壁培养，获得原代培养细胞；经胰蛋白酶消化后进行传代，然后 以完全培养液培养，传代2-4次后获得禽类骨髓间充质干细胞，在体外培养体系中继代扩 增培养；其中，所述完全培养液为含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述倾斜放置是培养皿与水平面呈30-60 度角。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，倾斜放置放置的时间为40-60分钟。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，去除血清后加入完全培养液贴壁培养的 时间为3-6天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，原代培养细胞经胰蛋白酶消化后，以 1 2-3的比例传代。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，禽类骨髓来自于禽类的股骨和/ 或肱骨。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述禽类骨髓碎块为1 2mm3。
8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，贴壁培养的密度为0.5 1骨髓 组织碎块/cm2。
9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，继代扩增培养时细胞接种密度 为1 X IO5 1 X IO6个细胞/cm2。
全文摘要
本发明提供了一种利用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法。其是采用骨髓组织块直接贴壁法获得大量原代骨髓间充质干细胞后，进行体外继代培养，从而获得纯化的禽类骨髓间充质干细胞。本方法与已有方法相比具有分离时间短，细胞获得量大且纯度较高，细胞体外增殖能力较强等优点，可为禽类间充质干细胞的研究应用及组织工程提供丰富的材料来源。
文档编号C12N5/0775GK102140440SQ20111010695
公开日2011年8月3日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者李想, 连正兴, 韩红兵 申请人:中国农业大学