免疫细胞培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于3D细胞培养技术领域，具体涉及一种免疫细胞培养方法。
【背景技术】
[0002]DC-CIK共免疫中，DC (dendritic cell，树突状细胞)主要是从骨髓组织、血液中分离出的具有很强的捕获抗原、呈递抗原的能力和分泌能力，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应；而011((细胞因子诱导的杀伤细胞)是人外周血中单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞。它具有增殖能力强、杀瘤活性高和杀瘤谱广、临床应用不良反应小的特点，是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞。DC-CIK联合免疫中，将DC细胞和CIK细胞进行共培养，使两者之间相互既促进DC的成熟，更能促进ClK的增殖并且加强CIK的肿瘤杀伤效力。
[0003]然而在上述DC与CIK的共培养中，由于DC本身分离自单个核细胞(PBMC)体外培养中的半贴壁细胞。目前进行共培养时，都是将DC直接贴附在培养容器上，培养容器的生长氛围不如原始生存环境，导致DC的生长、成熟以及表达的性状、免疫活性等方面都不能达到原始体内环境的水平，大大影响了 DC所要具备的抗原提呈效果。而由于CIK功能的强弱与DC的细胞密度以及其提呈的专一性有关，DC体外增殖能力低、相反CIK竞争性增殖能力强大，会造成DC不足引起与CIK的接触机会低，从而使得DC的抗原提呈作用无法发挥，从而降低CIK的治疗效力。
[0004]因此，在上述培养环境不能满足DC培养体外增殖的情形下，通常技术人员在培养中借用培养通常细胞的中空纤维培养、微载体培养以及微囊培养法等提升培养的环境，以弥补简单液体培养瓶的不足；但是，DC这一类的单核贴壁细胞贴壁的容器壁面形状迥异于人体内的微环境，在培养的过程中细胞体自身也容易受剪切力的损伤；更主要地，细胞的生长方向多趋于二维，导致采用上述培养方式DC细胞与抗原接触机会仍然不足，细胞品质仍然无法达到较好的预期。
【发明内容】
[0005]本发明实施的目的在于克服上述体外培养中常规培养瓶培养环境的不足，提供一种采用3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器进行DC和CIK免疫细胞的培养方法。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下:
[0007]—种免疫细胞培养方法，包括如下步骤:
[0008]获取DC 和 CIK ；
[0009]制备具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器；
[0010]将DC接种所述培养容器中进行培养，并在DC培养的过程中用诱导活化剂进行诱导培养;
[0011]用诱导培养后的DC于所述培养容器中与CIK进行共培养。
[0012]本发明的上述方法步骤，将其中的培养容器改为具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器，通过该支架自身具有的多孔隙的微孔环境，并且自身具有良好的复水性和细胞亲和性能，能保持或者吸收养料形成细胞培养的料床，提供相比其他支架更好的细胞培养环境，提升了细胞生长和增殖的能力；同时在DC和CIK共培养的过程中，孔隙内细胞的保持能力在局部上可以提升DC和CIK的接触几率，提升DC和CIK培养的细胞活性和品质。
【具体实施方式】
[0013]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0014]本发明实施例提出一种免疫细胞培养方法，包括如下步骤:
[0015]S10，获取 DC;
[0016]S20，制备具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器；
[0017]S30，将DC接种至步骤S20的培养容器中进行培养；
[0018]S40，在步骤S30进行扩增培养的过程中，用诱导活化剂对DC进行诱导；
[0019]S50，向步骤S40诱导后的培养容器中加入CIK，进行DC-CIK共培养。
[0020]本发明的上述方法步骤，针对现有通常DC和CIK培养的方法的，将其中的培养容器改为具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器，通过该支架自身具有的多孔隙的微孔环境，并且自身具有良好的复水性和细胞亲和性能，能保持或者吸收养料形成细胞培养的料床，提供相比其他支架更好的细胞培养环境，提升了细胞生长和增殖的能力；同时在DC和CIK共培养的过程中，孔隙内细胞的保持能力在局部上可以提升DC和CIK的接触几率，提升DC和CIK培养的细胞活性和品质。
[0021]具体本发明的上述步骤实施中，步骤SlO获取的用来进行免疫培养的DC和CIK可以用新鲜的脐带血自行制备，或者直接购买都可以。然后进行免疫培养，重点在步骤S20中所制备的具有支架的容器，其中3D胶原蛋白细胞培养支架并不是市售的产品，需要自行制备，具体的步骤可以参考如下进行:
[0022]S21，将胶原蛋白溶解在0.03?0.06mol/L的醋酸溶液中，制成质量分数I?2%的胶原溶液；
[0023]S22，将胶原溶液于模具中冷冻成型，得到胶原块；
[0024]S23，将胶原块进行真空干燥，得到胶原海绵体；
[0025]S24，将胶原海绵体于100?110°C下进行真空热交联，即得到胶原支架；
[0026]S25，将步骤S24制备得到的胶原支架于细胞培养容器的内壁面上进行固定。
[0027]首先，上述步骤S21中首先将原料胶原蛋白溶解制成溶液，是为了在制备溶液的过程中能够使胶原蛋白的蛋白纤维重新分布，保证重新成型后的固态形状的品质；虽然本发明在3D支架的早期制备中采用直接将胶原蛋白采用冷冻抽干直接固化成型，也可得到组织工程载体；但是这样的方式得到的载体之后进行细微的电镜扫描观察，其微观结构紊乱且整体并不稳定，内部蛋白纤维连接并不稳定，往往在DC还未培养至成熟就已经分解破碎。而细胞培养中如果支架的孔隙过大，那么细胞无法良好地贴服，如果孔隙小，那么细胞短短几次分裂之后会因为空间、养料的不足而死亡；所以本发明中用溶解之后使其纤维均一形成溶液，避免直接抽干之后孔隙不均一的缺陷。并且，上述胶原支架的原料胶原蛋白本身可以直接去购买或者自行制备，本发明步骤S21中所采用的胶原蛋白最好采用成纤维胶原蛋白，主要一方面是来源广，包括第I型胶原、II型胶原、III型胶原、XI型胶原、XXIV型胶原和XXVII型胶原，约占胶原总数的90%。相比成纤维胶原，非成纤维胶原的α -链既含有三螺旋域(胶原域，COL)，还含有非三螺旋域(非胶原域，NC)，结构上不利于交联形成孔隙均一和稳定的支架。
[0028]进一步在步骤S22中将胶原溶液于模具中冷冻成型，得到胶原块；而在该步骤中，基于本发明中胶原蛋白浓度和冷冻的要求，采用冷冻过程控制-20?30°C左右I?2h即可。采用冻干的方式得到固化的胶原蛋白，一方面可以初步形成支架的雏形，另一目的在于维持后续交联的过程中蛋白分子不至于沉降、聚集等等。其中，需要指出的是该模具的采用是基于支架成型的形状进行的采用，根据所需填充的培养容器的大小或者不同培养容器的形状，模具也可以进行相应的改变，或者可以自行设计均可。冷冻成型的过程中，一般控制时间I?2h即可，避免温度进一步过低下进行冻干生成冰晶的剪切力过大对蛋白纤维造成更加验证的变性伤害。
[0029]在固化成块状之后步骤S23中将固化后形成的胶原块进行真空干燥，得到胶原海绵体。在该步骤中通过真空将冻结的胶原块中的冰晶直接进行升华从而去除，在真空条件下进行干燥的过程，可以保持生物活性，尤其是避免热敏和氧化等情形使其被破坏。并且在真空冻结中进行升华干燥之后，能形成“骨架”，干燥后能保持原形，体积几乎不变。冻干之后形成的海绵体，复水性好，可迅速溪水还原成冻干前的状态。这一复水性的海绵特性能使支架之后被用于液体培养基的过程时，自身能吸收很多液体培养基中的养料成分，之后支架自身便可以作为细胞的料床，为细胞的生长提供较为全面的三维环境，而不仅仅只是简单的粘附。
[0030]而进一步出于品质的效果，由于上述步骤S24中需要对蛋白纤维的交联度和干化的程度进行掌控，而影响热交联处理中这一效果的，还有步骤S23中将将胶原块进行真空干燥得到胶原海绵体步骤中，真空干燥的程度。基于这一目的，本发明中步骤S23的干燥时间控制36?48h，使干燥的过程冷冻干燥程度即可，而不进行到解析干燥的步骤。采用冷冻干燥36?48h将其中的冰升华为水蒸气的升华干燥(非解析干燥)方式，这一过程能除去的是胶原块中原本溶液中的大量的自由水分子，而不会去除与蛋白分子吸附的结合水；保留这些