液A:含I % PPP、终浓度为50ng/ml的GM-CSF、终浓度为500IU/ml的IL-4的基础培养液。
[0059](3)分别培养DC和CIK
[0060]S31，将步骤S14中培养CIK的T175培养瓶培养2d，向T175培养瓶中加入20mL免疫细胞培养液B ;其中，免疫细胞培养液B:含终浓度为100IU/ml的IL-1 α、终浓度为50ng/ml的抗⑶3单抗、终浓度为300IU/ml的IL-2的基础培养液。
[0061 ] S32，将步骤S15中培养DC的T75培养瓶培养时间至4d，用免疫细胞培养液A进行半量换液；
[0062]同时在T175培养瓶的CIK培养至4d时，向T175培养瓶中补加扩增培养液B到10ml ；
[0063]S40，诱导 DC:
[0064]S41，制备诱导活化剂:将 ImL 的 50ug/mL EGFR(美国 Life Technologies 公司)和ImL的招盐佐剂(终浓度为0.125%，为质量体积比，丹麦Brenntag B1sector公司)混合，于4°C进行预吸附；
[0065]S42，诱导:当T75培养瓶的DC培养至第6d时，向T75培养瓶中加入预先进行吸附的DC诱导活化剂，进行诱导；
[0066]同时，将T175培养瓶中的CIK转入培养袋中培养，补加扩增培养液到300ml ;此步骤中采用的扩增培养液为含1% PPP、终浓度为300IU/ml的IL-2的基础培养液；
[0067]S43，在步骤S32进行约诱导Id之后，向T75培养瓶中，加入20ul TNF_a(肿瘤坏死因子，终浓度为20ng/ml)，最终促进DC成熟和稳定。
[0068](4) DC-CIK 共培养:
[0069]350，在步骤340加入了即-€1 —天以后，收集T75培养瓶中的DC，加入到CIK培养的培养袋中进行共培养，并补加扩增培养液到600ml ;再过2d之后收集细胞。
[0070](4)为了验证本发明方法的进步性，需要对其所获得的细胞的能效进行鉴定，已验证类型是否准确真实，以及能效是否确实有提升，而由于DC细胞的培养方法的有益效果是DC吞噬提呈抗原的能力增强，该效果没有直接的检测指标，只能间接通过共培养后CIK的增殖能力和表型分析的结果来反映该效果，具体:
[0071 ] 1、用台盼蓝染色法计数CIK，计算其增殖倍数。
[0072]2、取诱导14天的CIK细胞，经PBS洗涤2遍后，各取I Χ 106/100 μ I置于falcon管中，分别加入20 μ I鼠抗人荧光素标记的⑶3、⑶16、⑶56、⑶3/⑶56及同型对照IgGl/IgGl，4°C避光孵育30min，PBS洗涤2遍后流式细胞仪上机分析。
[0073]其中，上述每项的检测重复3个对照，最终取结果平均值；CIK增殖倍数的平均结果为4?5x10s，相比通常的CIK的2?3xl07的增殖能力有显著的提升，且表型检测的最终确定类型确实为CIK。
[0074]3、在上述共培养获得的CIK体外性能测试之后，进一步进行最终的肿瘤杀伤能力测验:
[0075]将本发明的细胞作为实验组、与靶细胞组和效应细胞组共同组成三个对照组，取96孔培养板，每孔内实验组加入效应细胞(CIK)和靶细胞(K562细胞)各100 μ L，效靶比为25:1，效应细胞为1.25 X 15个，靶细胞为5000个；靶细胞组加入靶细胞和培养液各100 μ L ;效应细胞组加入效应细胞和培养液各100 μ L，各组设置3个平行复孔。置37°C培养箱孵育4h JpAMTT 20 μ L，再孵育4h，离心后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μ L，充分溶解后于酶联免疫检测仪(波长为570nm)检测每孔吸光度值A，用以下公式计算杀伤率=[1-(A实验孔-A效应孔)/A靶细胞孔]X 100% ;
[0076]本发明实验组最终计算后的杀伤率为78.6% (重复3次的平均数)，相比通常DC-CIK细胞诱导培养3周后，按照效靶比为15:1?20:1时检测的杀伤率55?65%提升了 10%多，因此可以说明本发明制备的DC和CIK更好的细胞活性和肿瘤杀伤效力。而且主要地是，DC细胞数比通常培养得到的要多，说明本发明的应用有支架之后的培养容器，DC生长的数量更多一些，支架确实在细胞培养方面有良好的提升效果。
[0077]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种免疫细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 获取DC和CIK ； 制备具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器； 将DC接种所述培养容器中进行培养，并在DC培养的过程中用诱导活化剂进行诱导培养; 用诱导培养后的DC于所述培养容器中与CIK进行共培养。2.如权利要求1所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，制备所述具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器的步骤，包括: 获取胶原蛋白； 将所述胶原蛋白溶解在0.03?0.06mol/L的醋酸溶液中，制成质量分数I?2%的胶原溶液； 将所述胶原溶液冷冻成型，得到胶原块； 将所述胶原块进行真空干燥，得到胶原海绵体； 将所述胶原海绵体于100?110°C下进行真空热交联，得到胶原支架； 将所述胶原支架于培养容器的内壁面上进行粘附固定。3.如权利要求2所述的将所述胶原溶液冷冻成型步骤中，将所述胶原溶液冷冻成型过程采用于-20?30°C下冷冻I?2h ; 和/或，将所述胶原海绵体于100?110°C下进行真空热交联步骤中，所述热交联处理的时间为15?18h。4.如权利要求2所述的3D免疫细胞培养支架的制备方法，其特征在于，将所述胶原块进行真空干燥步骤中，所述真空干燥为真空升华干燥。5.如权利要求4所述的3D免疫细胞培养支架的制备方法，其特征在于，所述真空升华干燥过程中干燥时间为36?48h ; 和/或，所述真空升华干燥过程中温度为-20?30°C ; 和/或，获取所述胶原蛋白步骤中，所述胶原蛋白为I型胶原、II型胶原、III型胶原、XI型胶原、XXIV型胶原和XXVII型胶原中的一种或多种。6.如权利要求1至5任一项所述的3D免疫细胞培养支架的制备方法，其特征在于，将DC接种所述培养容器中进行培养，并在DC培养的过程中用诱导活化剂进行诱导培养步骤中， 所述诱导活化剂为小细胞肺癌特异性EGFR和铝佐剂相互吸附的混合物。7.如权利要求6所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，所述诱导活化剂中小细胞肺癌特异性EGFR和铝佐剂的质量比为2:1?8:1 ; 和/或，所述铝佐剂为氢氧化铝、氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾及钾明矾中的至少一种。8.如权利要求1至5任一项所述的3D免疫细胞培养支架的制备方法，其特征在于，将DC接种所述培养容器中进行培养，并在DC培养的过程中用诱导活化剂进行诱导培养步骤之后，还包括: 用TNF- α对诱导培养后的DC进行刺激处理。9.如权利要求1至5任一项所述的3D免疫细胞培养支架的制备方法，其特征在于，将DC接种所述培养容器中进行培养步骤中，采用的培养液为含有60?100 IU/ml硫酸庆大霉素、0.5 ?1.5% PPP^40 ?60ng/mL 的 GM_CSF、450 ?550IU/ml 的 IL-4 的 DMEM0
【专利摘要】本发明提供了一种免疫细胞培养方法，包括：获取DC和CIK；制备具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器；将DC接种该培养容器中进行培养，并在DC培养的过程中用诱导活化剂进行诱导培养；用诱导培养后的DC于所述培养容器中与CIK进行共培养。本发明的上述方法步骤，将其中的培养容器改为具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器，通过该支架自身具有的多孔隙的微孔环境，并且自身具有良好的复水性和细胞亲和性能，能保持或者吸收养料形成细胞培养的料床，提供相比其他支架更好的细胞培养环境，提升了细胞生长和增殖的能力；同时在DC和CIK共培养的过程中，孔隙内细胞的保持能力在局部上可以提升DC和CIK的接触几率，提升DC和CIK培养的细胞活性和品质。
【IPC分类】C12N5/0783, C12N5/0784
【公开号】CN105112372
【申请号】CN201510541351
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月28日