结合水有利于后续热交联过程中防止过度干化，从而保证支架的品质。而如果进一步加长时间并调整温度，进行解析干燥的话，吸附水会大量的被从吸附状态解析出来，这样并不利于后续的支架品质。所以本发明中控制时间为36?48h，并且真空干燥的过程中，保持温度与冷冻成型的温度基本相当即可。
[0031]之后步骤S24将真空干燥后形成的海绵体进行真空交联，通过真空下高热100?IlOtC使蛋白质分子可通过氨基酸残基上的羟基、氨基、羧基之间的脱水缩台而交联。真空交联也是为了避免发生氧化交联，因为一般通常下蛋白质氧化也是可以交联的，具体为在氧气(一般有空气即可)条件下，蛋白质分子可发生硫氢基与硫氢基的氧化型交联从而生成二硫键。这种氧化交联虽然某种程度上可以增加固化后交联的蛋白的硬度，但是却大大降低了缩胀性能，不利于后续的复水，柔韧性上也会有所欠缺。所以本发明步骤S24中将上述海绵体进行真空热交联，避免氧化交联的情况，从而保证热交联的过程不至于大大降低支架的复水性能。
[0032]同时，经过本发明中的反复实施和考察，在步骤S24的真空交联处理中，热交联处理的程度会影响到纤维蛋白直接的性能。热交联时间过长，蛋白纤维干化过于严重，那么之后再用于组织培养时，支架自身脱水或者硬化的不可逆程度过高，之后复水性、表面亲和性都会大量降低，从而降低支架用于细胞培养的效果；所以经过反复的验证，本发明将步骤S24中真空交联的过程控制15?18h，得到实验所需的胶原支架，一方面避免交联度不够支架容易过早降解，也能避免干化严重的缺陷。
[0033]步骤S24完成之后，将支架润湿之后粘附固定于细胞培养容器的内壁面上，即得到本发明上述具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器，然后用该培养容器进行免疫细胞培养。
[0034]进一步，步骤S30将DC用步骤S20制备的具有3D胶原蛋白细胞培养支架的培养容器进行大量的体外培养，而培养的过程中的培养基可以采用适于DC生长的免疫细胞培养液进行；这样可以避免更换不同成分的新培养基造成DC细胞体生长环境的骤变而导致细胞性状水平的变化，更加利于维持活性和抗原提呈能力。在本发明的培养步骤中，适于DC生长的培养液，经过试验和对比，本发明优选采用采用的培养液含有60?100IU/ml硫酸庆大霉素、0.5?1.5% PPP、终浓度为40?60ng/ml的GM-CSF、终浓度为450?550IU/ml的IL-4的DMEM培养液进行。
[0035]在步骤S40培养的过程中，适时将诱导活化剂加入至培养液中对DC进行免疫诱导，而将DC诱导活化剂添加的时机实施中要注意，因为根据细胞培养的生长过程，处于原代培养的细胞体本身能够较好地保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞则会仍然保留二倍体数；而过渡至传代培养期的细胞，其分化程度或者形状变化会进一步加深，所以诱导的时机尽量避免拖延至细胞性状已经传代至变化较大之后进行，最好提前一些。同时，需要指出的是，由于上述DC诱导活化剂两个成分之间吸附之后才能具有在培养液中进行缓释的效果，所以DC诱导活化剂在向培养液添加之前需要将EGFR和铝佐剂这两者先进行预吸附，完成之后再加入至培养液中。而如果采用直接分别加入至培养液中，铝佐剂可能会对培养液中的其他成分大量吸附，而造成对EGFR的吸附不足，影响EGFR诱导的功效。
[0036]在本发明的上述步骤S40进行诱导之后，还可以将步骤S40活化诱导之后的DC用TNF- a (Tumor Necrosis Factor，肿瘤坏死因子)进行刺激，可以进一步促进DC成熟和稳定抗原提呈性；实施方式可以采用将适当比例的TNF-α直接添加入DC培养液中持续培养即可。
[0037]最后进行步骤S50用步骤S40诱导之后的DC细胞与CIK在本发明上述步骤S20制备的容器中继续进行共培养。
[0038]本发明基于常规采用通常的锥形瓶、培养瓶或者大试管进行时，即使更加先进一点采用中空纤维培养、微载体培养以及微囊培养法等培养过程中，DC这一类的单核贴壁细胞贴壁的容器壁面形状或者微环境都迥异于人体内的微环境，在培养的过程中细胞体自身也容易受剪切力的损伤等的培养缺陷；更主要地，细胞的生长多趋于二维平面，培养的过程中DC细胞与抗原接触机会低，抗原提呈效率低；所以在上述情形下，本发明在上述培养的过程中，在用于培养的容器内壁上设置一层胶原支架。而有试验表明，将MSCs (骨髓间充质干细胞)接种至三维PET上进行培养，当接种密度最低时，扩增倍数最高，并维持其未分化状态及细胞的多分化潜能，细胞扩增与支架孔隙率、表面积、吸水性、种植率等因素均有关系的影响。
[0039]因此，针对本发明中需要进行培养的单个核细胞和DC细胞，本发明采用胶原材料制成的上述三维的胶原支架置于培养容器的内壁上。胶原支架能够为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能；从而实现既利于各类细胞的分化定向诱导，又利于细胞分化表型的维持和增殖。在上述容器内进行DC的培养诱导至数量和形状达到要求之后，加入CIK进行共培养；培养的过程中，支架自身具有良好的复水功能可以存储有较多的养料，并且支架内的孔隙可以稳定地提供DC和CIK接触的场所，以避免在流动相中DC和CIK细胞接触率低的情形。
[0040]为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明利用该自行制备的胶原蛋白的海绵体3D细胞培养支架活性诱导培养DC以及CIK的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。
[0041]实施例1
[0042]基于本实施例最终获得DC-CIK联合免疫的DC和CIK共培养细胞体，因此以下将DC和CIK这两部分同时整合进行，并且在一下过程中采用的基础培养液为含80IU/ml硫酸庆大霉素的DMEM，具体培养过程如下:
[0043](I)制备本发明3D胶原支架的T75培养瓶和T175培养瓶以及培养袋(容量1.5L):
[0044]Sll，按照胶原蛋白:醋酸溶液的质量比为1:80的比例，将I型胶原蛋白(购买自上海华研生物科技有限公司)溶解在0.04mol/L的醋酸溶液中制成胶原溶液；
[0045]S12，将胶原溶液真空脱泡后置于模具(长、宽各10mm、高2mm，本发明中采用这一规格进行试验，而在大量制备中技术人员可以根据实际培养的需要和效果自行调整，不必限定于这一规格)中，-20°C冷冻1.5h成块状固体；
[0046]S13，将步骤S22获得的块状固体置于真空_20°C下40h冻干，得到胶原海绵；
[0047]S14，将胶原海绵于105°C真空下热交联15h，得到实验所需的胶原支架；
[0048]S15，将胶原支架用水润湿之后，仔细地粘附于T75、T175培养瓶以及培养袋的内壁面上，备用。
[0049]当然为了避免遭受到其他杂菌的污染，培养瓶和支架的各项操作都可以在无菌条件下进行。
[0050](2)制备 DC:
[0051]S21，取10ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中；
[0052]S22，将离心管于300g离心1min后，上层的血浆单独取出用于制备低血小板血浆(用于制备后续的免疫细胞培养液)；
[0053]离心之后的下层含血细胞的沉淀物，用注射用生理盐水重悬至每管30ml悬浊混合液；
[0054]S23，再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将步骤S12的悬浊混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；400g离心20分钟后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中，所得的白膜层即为单个核细胞；
[0055]同时，重复3?4次用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，对单个核细胞进行清洗，清洗完之后离心收集单个核细胞的细胞体；
[0056]S24，将步骤S13获得的单个核细胞用20ml基础培养液重悬，并将悬液加至含30个胶原支架的T75培养瓶中培养2?3h，之后将不贴壁细胞倒入另外一个T175培养瓶中，并用基础培养液补足T175培养瓶的培养液到50ml，并加入0.5ml PPP和50ul IFN- γ (终浓度为1000IU/ml)培养；这里需要说明的是T175培养瓶中进行选择性培养之后得到从不贴壁的单个核细胞中的CIK ;
[0057]S25，将不贴壁细胞去除后，向T75培养瓶中加入20ml免疫细胞培养液A进行选择培养，即可获得贴壁的单个核细胞中的DC ;
[0058]其中，免疫细胞培养