一种融合人白细胞介素28b及其制备方法

专利名称：一种融合人白细胞介素28b及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种融合人白细胞介素28B及其制备方法。
背景技术：
干扰素(interfeixm，IFN)是人类最早发现的细胞因子，早在20世纪30年代，人们已发现机体感染某一种病毒后，会对另一种抗原性毫无关系的病毒发生干扰现象。1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann,在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素，并一直沿用至今。人类IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性分为三型，即I型、II型和III型干扰素，其中I型IFN家族包括至少25种亚型的IFN- α非等位基因，I个IFN-β基因，lflFN-co基因，以及了解尚少的I个IFN-K和I个IFN-ε基因，所有I型INF基因均位于9号染色体，没有内含子，并且所编码蛋白全部使用同一种受体IFN- α β R0II型IFN家族仅有IFN-Y —个成员，又称为免疫干扰素，基因位于12号染色体。III型干扰素是干扰素的一个新家族，包括IFNX-l、IFN-X2和IFN-X3 3个成员，IFN-λ s基因位于19号染色体，基因中含有多个内含子，其基因结构与IL-10家族成员十分相似，而与IFN-α相差甚远，因此IFNX-l、IFN-X2和IFN-λ 3又分别被命名为IL29，IL28A和IL28B。2003 年，Stoppard P 等运用反向生物学原理，利用 Genscan、SIGNAI、4HB、WU_BLAST等生物信息学软件鉴定了一个干扰素新家族，首次报道了其编码产物具有干扰素样活性(Sheppard P,Kindsvogel W,Xu W, Henderson K,Schlutsmeyer S,Whitmore TE,KuestnerR, Garrigues U, Birks C, Roraback J, Ostrander C, Dong D, Shin J,Presnell S, Fox B,Haldeman B, Cooper E, Taft D, Gilbert T, Grant FJ, Tackett M, Krivan ff, McKnightG,Clegg C, Foster D, Klucher KM. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptorIL-28R. Nat Immunol. 2003 Jan ；4(1) :63-8. Epub 2002 Dec 2·)。Kotenko S V 等将它们命名为干扰素新家族——IFN- λ s (IFN- λ I、IFN- λ 2和IFN- λ 3)。人类基因组组织(HumanGeneomeOrganization, HUGO)暂时将它们命名为 IL29、IL28A 和 IL28B。III型干扰素具有多种生物学功能，其刺激细胞可产生数百种干扰素诱导基因(ISGs)。在体外IFN-As可保护人细胞系抵抗水泡口炎病毒(VSV)和心肌炎病毒引起的细胞病变；IFN-λ I可抑制HBV和HCV在肝细胞中的复制(Doyle SE, SchreckhiseH,Khuu-Duong K, Henderson K, Rosier R, Storey H, Yao L, Liu H, Barahmand—pour F,Sivakumar P,Chan C,Birks C,Foster D,Clegg CH,Wietzke-Braun P,Mihm S,KlucherKM.Interleukin-29 uses a type I interferon-like program to promote antiviralresponses inhuman hepatocytes. Hepatology. 2006 Oct ；44(4) :896-906.)。称猴接种HIV抗原后，IFN-λ s能降低Th2型细胞因子(IL-4和IL-5和IL-13和IL-14和IL-15)的产生，这可能有利于Thl免疫途径，增加调节性T细胞，提高CD8T细胞的细胞毒性和应答记忆(Dai J, Megjugorac NJ, Gallagher GE, Yu RY, Gallagher G. IFN-Iambdal (IL-29)inhibits GATA3expression and suppresses Th2 responses in human naive and memoryT cells. Blood. 2009Jun 4 ；113(23) :5829-38.)。近年来的研究表明，IL28B 基因多态性对于HCV感染者对IFN治疗的病毒学应答具有一定的影响，与细胞因子IL28B相关的单核苷酸多态性(SNPs)，不仅与慢性HCV患者聚乙二醇干扰素/利巴韦林治疗应答有强相关性，还与急性HCV感染后的自发性病毒清除高度相关，说明其在群体水平上，是决定HCV感染治疗结果的一个重要的宿主因素(Ge D, Fellay J, Thompson AJ, Simon JS, ShiannaKV,Urban TJ, Heinzen EL, Qiu P, Bertelsen AH, Muir AJ, Sulkowski M, McHutchison JG,Goldstein DB. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-inducedviralclearance. Nature. 2009 Sep 17 ;461 (7262) :399-401.)。目前，人们对 III 型干扰素的生物学研究主要集中在IL29和IL28A。美国zymogenetics公司与BMS联合研发的PEG-IL29细胞因子已经进入临床研究，并展示出良好的抗HCV前景。但是IL28B作为药物的研究目如仍是一片空白。干扰素是最早发现、研究最多、第一个克隆化、第一个用于临床治疗疾病的一类重要的家族性细胞因子。其首先被发现的生物活性是抵抗病毒感染，随着研究的深入，干扰素的免疫调控、抗增殖作用以及抗肿瘤作用才逐渐为人们所认识。自1986年，美国FDA首先 批准基因工程干扰素a -2a和a -2b投放市场之后，基因工程β、Y干扰素也相继于1990年、1993年获准投放市场。近20年以来，随着基因工程技术的发展，目前已有约60个国家批准干扰素上市，用于治疗病毒性肝炎、癌症及多发性硬化症等约30多种疾病。但是干扰素相对分子质量较小，易被肾小球滤过，体内不稳定，易被血清蛋白酶降解，血浆半衰期短而治疗周期长，需要频繁注射给药。因此，为了克服以上缺点，改善重组IFNs代谢动力学及药效学特征，近年来开发出了很多类型的长效干扰素，其设计原理主要基于以下几个方面
(I)增大干扰素的分子量，减少肾小球滤过率；(2)减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率；(3)持续缓慢释放维持药物浓度，延长药物作用时间。主要技术手段有化学修饰技术、基因融合技术、定点突变技术以及缓释给药系统等。人血清白蛋白(HSA)是人体血液中天然的物质输送载体，血清中含量最高，对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用。其相对分子量约为65kDa，是由585个氨基酸组成的单链球型蛋白质，无酶学及免疫学活性，其肾清除率非常低，体内半衰期为14 20d，是体内因子和药物转运的天然载体，是理想的改善药物半衰期的药物融合蛋白。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种融合蛋白及其编码基因。本发明所提供的融合蛋白，是人血清白蛋白和λ干扰素连接而成的融合蛋白。上述融合蛋白中，所述人血清白蛋白位于所述λ干扰素的N端；上述融合蛋白中，所述λ干扰素为人白细胞介素28Β ；上述融合蛋白中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。所述编码基因为如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO 2所示DNA分子；2)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。上述重组载体中，所述重组载体是将SEQ ID NO :2所示基因插入表达载体pPinka -HC的多克隆位点得到的。上述重组菌中，所述重组菌是将SEQ ID NO :2所示编码基因导入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌具体为毕赤酵母 ，再具体为如下四种菌株中的至少一种ade2蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型毕赤酵母和ade2/prbl/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母；上述重组菌中，所述SEQ ID NO :2所示编码基因是通过权利要求5或6所述重组载体导入的。本发明的另一个目的是提供一种制备上述融合蛋白的方法。本发明所提供的制备上述融合蛋白的方法，包括如下步骤I)将上述任一所述重组酵母菌预培养至对数生长期；2)用甲醇对步骤I)得到的菌进行诱导培养，诱导培养完毕，收集上清液，即得到所述融合蛋白。上述制备方法中，所述步骤2)中，所述甲醇占诱导培养体系的I. 0% -4. 0% (体积百分比)，具体为2% -4%或2% -3% ；上述任一制备方法中，所述步骤2)中，所述诱导培养的时间为48h_72h，具体为72h。上述任一制备方法中，所述步骤I)中，所述预培养包括如下步骤将权利要求7所述的重组酵母菌接种于用于培养毕赤酵母的培养基中，培养至培养体系的0D600为5. O 6. O ；上述任一制备方法中，所述步骤2)中，在所述用甲醇进行诱导之前，包括如下步骤将步骤I)得到的菌体重悬于用于诱导酵母菌的培养基中，再培养10_14h ；上述任一制备方法中,所述用于培养酵母菌的培养基为用于培养毕赤酵母菌的培养基，具体为BMGY培养基；所述用于诱导酵母菌的培养基为用于诱导毕赤酵母菌的培养基，具体为BMMY培养基；上述任一制备方法中，所述步骤I)和所述步骤2)中，所述培养的温度为30°C。目前重组蛋白类药物的制备方法主要包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞、昆虫细胞、动植物生物反应器等基因工程方法。本发明采用的PichiaPink酵母表达系统具有以下优点属于真核表达系统，能对表达蛋白进行翻译后的加工和修饰；强效启动子，通过甲醇诱导严格调控外源基因的表达；外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平；自身分泌蛋白少，分泌表达产物较易分离纯化；对营养要求低，生长快，生产成本低，可高密度发酵，适合大规模工业化生产。本发明运用生物工程技术，通过构建编码HSA和经密码子优化后人IL28B的融合基因克隆到PichiaPink酵母表达载体pPink a -HC中并获得高效表达，系国内首创。实验证明，用本发明的重组菌制备HSA-opt-hIL28B，表达量高，纯化过程简便，且表达产物具有较强的活性。因此，本发明重组菌及本发明方法在长效人IL28B的制备及免疫调节、抗病毒治疗等领域中有广阔的应用前旦
O


图I为pPink a HC-HSA-opt_hIL28B重组质粒的酶切鉴定。图2为HSA-opt_hIL28B在PichiaPink strain 2号菌株中高表达克隆的筛选。图3为HSA-opt-hIL28B重组蛋白高效表达株的表达条件的优化。本图为12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色结果。图4为重组HSA-opt-hIL28B蛋白的纯化。本图为12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色结果。图5为重组HSA-opt_hIL28B蛋白的质谱分析。图6为利用本发明制备并纯化的HSA-opt-hIL28B重组蛋白和另一发明制备并纯化的opt-hIL28B及购自先灵葆雅公司的IFN- a 2b对人肝癌细胞系H印G2细胞人黏液病毒抗性蛋白A(MxA)的激活。图7为opt_hIL28B蛋白的质谱分析。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。胎牛血清及DMEM培养基购自Invitrogen公司，质粒大量提取试剂盒、转染试剂购自Giantagen公司。一次性细胞培养板以及移液管等耗材购自Corning公司。实施例I、融合蛋白的制备一、融合基因HSA与优化后的opt_hIL28B基因的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。该融合基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。人工合成人血清白蛋白基因(HSA)。人血清白蛋白基因(HSA)的核苷酸序列如SEQID NO 2中第1-1755位核苷酸所示；该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 1中第1-585位氨基酸所示。人工合成经密码子优化后的人opt_hIL28B基因。经密码子优化后的人IL28B(hIL28B)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2中第1756-2343位核苷酸所示。该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: I中第586-780位氨基酸所示。密码子优化前的基因名称为hIL28B，密码子优化后的基因名称为opt-hIL28B。与hIL28B基因相比，opt_hIL28B基因的核苷酸序列发生变化，氨基酸序列不变。设计下列引物通过Overlapping PCR方式将人血清白蛋白基因融合到基因opt-hIL28B的5'末端(即将人血清白蛋白融合到opt-hIL28B的N末端)。融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示，记作HSA-opt-hIL28B。用于融合的HSA基因模板由SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4两对引物以合成的HAS基因为模板扩增获得，用于融合的opt-hIL28B基因模板由SEQ ID NO :5和SEQID NO :6两对引物以合成的opt-hIL28B基因为模板扩增获得；再将用于融合的HSA基因模板和用于融合的opt-hIL28B基因模板混合，用SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 6引物进行扩增，得到融合基因 HSA-opt-hIL28B。SEQ ID NO 35’ -GTATCTCTCGAGAAAAGGCCTGATGCACACAAGAGTGAG-3’SEQ ID NO 45’ -GCATCCGGGAGAGCCCCGCGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’
SEQ ID NO 55， -GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACGCGGGGCTCTCCCGGATGC-3，SEQ ID NO 65’ -TTTAAATGGCCGGCCGGTACCTCAGACACACAGGTCCCCG-3’二、重组表达载体pPink a-HC 载体购自美国 Invitrogen 公司，目录号Al 1153。将融合基因HSA-opt-IL28B通过Giantagen公司GIANTCL0NE —步法快速克隆试剂盒(目录号G060501)克隆至IJ PichiaPink酵母菌专用表达载体pPink a -HC的Stu I和Kpn I酶切位点中，获得的重组表达质粒记作pPink a HC-HSA-opt_hIL28B。将重组质粒？？丨111^!1(-肥4-0 卜1111^288进行酶切鉴定，结果如图I。图中，Ml =DNA分子量标准(TAKARA 公司DL 15, 000) ；M2 :DNA 分子量标准(TAKARA 公司DL 2, 000) ；1 pPink a HC-HSA-opt_hIL28B 质粒以 Nco I 和 Kpn I 双酶切；2 pPink a HC-HSA-opt_hIL28B质粒以Spe I单酶切。结果双酶切泳道可见约1500bp的片段被切出。表明构建的重组表达质粒正确。 将重组质粒pPink a HC-HSA-opt_hIL28B进行测序鉴定。结果显示在载体pPinka -HC的Stu I和KpnI酶切位点间沿着从Stu I至KpnI的方向，插入的基因序列如SEQ ID NO :2所示。测序结果完全正确的质粒用Giantagen公司GIANTPREP质粒大量提取试剂盒(目录号G060303)按说明书进行大量制备。三、重组菌(I) pPink a HC-HSA-opt_hIL28B 质粒 DNA 的线性化取IOyg pPinkaHC-HSA-opt_IL28B重组质粒，用限制性内切酶Spe I按照说明书建议的反应体系进行线性化，线性化后的DNA经纯化后，溶于IOul的无菌去离子水中。(2)酵母菌感受态细胞的制备PichiaPink表达系统购自美国Invitrogen公司，目录号A11154。酵母菌株1#、2#、3#和4#均购自美国Invitrogen公司，目录号A11154。这四株菌均属于目录号为A11154的试剂盒，不同菌株都有清晰的标记，使用者很容易区分开。PichiaPink表达系统中酵母菌株1#、2#、3#和4#分别为蛋白酶缺陷型，缺陷的基因分别为 ade2、ade2/pep4、ade2/prbl 和 ade2/prbl/pep4。ade2、prbl、pep4 是公知的，酵母菌株1#、2#、3#和4#均购自美国Invitrogen公司，其说明书上标明它们是通过基因敲除方式构造的缺陷株。I.分别挑取PichiaPink酵母表达系统中的菌株的单菌落，接种至含有IOml YPD培养基的125ml三角瓶中，30°C，260r/min培养I天；2.分别取上述步骤中复苏后的四种菌株培养物100 500 μ 1，接种至含有IOOml新鲜Yro培养基的IL三角摇瓶中，调整接菌浓度使初始OD6tltl = O. 2，30°C，260rpm/min培养过夜，至OD6tltl达到1.3- 1.5 ；3.将步骤2中酵母细胞培养物转移至300ml无菌离心瓶中，4°C，1500g离心5min，弃上清，菌体沉淀用200ml冰预冷的无菌水重悬；4.按步骤3离心,用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5.按步骤3离心，用IOml的冰预冷的IM山梨 醇溶液将菌体沉淀重悬；6.按步骤3离心，用300ul的冰预冷的IM山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为500ul。制备好的感受态置冰上放置，并且当天使用。(3)酵母菌的电转化PAD、YPDS 均购自美国 Invitrogen 公司，目录号A11156。I.分别取5 μ g pPink a HC-HSA-opt_hIL28B纯化后的线性化DNA与80 μ I四种菌株的感受态细胞混合均匀，转移至O. 2cm冰预冷的电转杯中，冰浴5min ；2.运用Bio-Rad公司的MicroPulser Electroporator,进行电转，电转条件为2kV, 25 Ω，200 μ F ;电击时间为5ms左右。电击完毕后，加入Iml冰预冷的YPDS培养基将菌体混合均匀，转移至30°C，静置培养2h ；3.每管取100 300 μ I菌体悬液涂布于PAD选择培养板上，将平板置于30°C培养，直至单个菌落出现；4.从步骤3中每板分别挑取3-8个白色克隆至新鲜的PAD选择培养板中，重新划线分离纯化培养至出现单菌落。四、蛋白的表达BMGY培养基组成及各成分在培养基中的浓度如下I %酵母粉(yeast extract),2%蛋白胨(p印tone)，I. 34% ΥΝΒ，0· 0004%生物素(biotin)，1%甘油，用 lOOmM、pH 6.0的磷酸盐缓冲液(potassium phosphate)补足体积。所述百分含量除甘油为体积百分比外，
其余均为质量百分含量。BMMY培养基组成及各成分在培养基中的浓度如下I %酵母粉(yeast extract),2% 蛋白胨(peptone), I. 34% YNB，O. 0004 % 生物素(biotin)，0. 5 % 甲醇，用 IOOmM, pH
6.O的磷酸盐缓冲液(potassium phosphate)补足体积。所述百分含量除甲醇为体积百分比外，其余均为质量百分含量。(一 )重组HSA-opt_hIL28B在四种不同菌株中表达量的比较及高表达株的筛选I.挑取含有HSA-opt-hIL28B的单菌落接种至含有10ml BMGY培养基的125ml三角瓶中，30°C,260rpm/min培养I天；2.将培养物转移至50mL锥底离心管中，1500g室温离心5min,弃上清,沉淀重悬于Iml BMMY培养基中，30 °C，260rpm/min培养过夜；3.次日加入IOOul 40% (体积百分比)甲醇水溶液,30°C, 260rpm/min继续培养过夜；4.第二天1500gX IOmin离心收集上清，取20ul经SDS-PAGE分析比较HSA-opt-hIL28B 在 PichiaPink 表达系统 strainl#、strain2#、strain3#、strain4# 四种不同菌株中表达量的变化。分别挑取转入HSA-opt-hIL28B的酵母菌株1#、2#、3#和4#各32个克隆进行诱导表达，收集上清液，用Bicinchoninic acid(BCA)法检测各蛋白的表达量。结果，strainl#、strain2#、strain3#、strain4# 四种不同菌株中 HSA-opt_IL28B 蛋白的平均表达量分别为 O. 158ug/ul、0. 176ug/ul、0. 073ug/ul、0. 057ug/ul，显示，HSA-opt_IL28B在strain2#中的表达量高于其他三种菌株。对照I :转入空载体pPink a -HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中均没有检测到目的蛋白的表达。5. HSA-opt-hIL28B在PichiaPink表达系统strain2#菌株中高表达克隆的筛选。在确定HSA-opt-hIL28B在strain2#中的表达量高于其他三种菌株的基础上，进一步大规模挑取转有HSA-opt-hIL28B的strain2#单菌落进行诱导表达，通过SDS-PAGE分析比较(图2)，电泳为12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色，筛选出9株HSA-opt-hIL28B的高表达株，其中表达量最高的为6号菌株，选择该菌株进行表达条件的优化，并对该菌株进行保种。( 二)重组HSA-opt_hIL28B高效表达株的表达条件优化。
I.将筛选出的HSA-opt-hIL28B高效表达6号菌株接种至含有IOml BMGY培养基的125ml三角瓶中，30°C，260rpm/min培养I天；2.将步骤I中的培养物分别接种至4个含有50mLBMGY培养基的IL三角瓶中，30 °C, 260rpm/min 培养 I 天；3.第二天1500gX5min离心，弃上清，沉淀重悬于IOmLBMMY培养基中，30°C，260rpm/min培养过夜；4.次日分别加入100%甲醇至终浓度(即甲醇占培养体系的体积百分比)为
I.0%、2· 0%、3· 0%、4· 0%，30°C，260rpm/min 诱导，分别在诱导时间为 24h、48h、72h 时收取上清进行蛋白表达量检测和SDS-PAGE检测。结果如图3所示，在相同诱导时间下，3%与4%终浓度的甲醇诱导的目的蛋白表达量相对较高在相同终浓度的甲醇诱导下，诱导时间为72h时目的蛋白表达量相对较高。电泳为12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。具体表达量如下表I、各种条件下的蛋白表达量(ug/ul)
24h ~48h~~72h~
~I. 0%OOO. 086
2.0%OOO. 106
3.0%OOO. 187
4.0%OO. 019 O. 177(三)重组HSA-opt_hIL28B蛋白的大量表达I.将筛选出的HSA-opt-hIL28B高效表达6号菌株接种至含有IOml BMGY培养基的125ml三角瓶中，300C，260rpm/min培养I天；此步骤的培养目的是对6号菌株进行复苏、提高活性以便下一步的预培养。2.将上述步骤中的培养物接种至含有250mLBMGY培养基的IL三角瓶中，30°C，260rpm/min过夜培养至0D600 = 5. O 6. O左右；此步骤的培养目的是将复苏后的6号菌株培养至对数生长期，以便下一步的诱导表达。3. 1500gX5min 离心，弃上清，沉淀重悬于 50mL BMMY 培养基中，30°C，260rpm/min培养过夜。此步骤是对培养至对数生长期的6号菌株进行诱导表达。4.次日加入甲醇至终浓度(即甲醇占培养体系的体积百分比)为3.0%，3(TC，260rpm/min诱导72h后，收菌离心取上清(即为蛋白粗提液)备用，同时取部分上清进行蛋白表达量检测和SDS-PAGE检测。结果，蛋白的表达量为O. 223ug/ul。(四)重组HSA-opt_hIL28B蛋白的纯化
20mM PB的溶剂为水，溶质及各溶质在20mM PB中的浓度如下=K2HPO4 · 3H2020mM,KH2PO4 20mM ；20mM PB 的 PH 为 7· O。I.柱平衡将阳离子交换柱SP-Agarose填料(购自美国GE公司)装填至层析柱中，用5倍柱体积灭菌纯化水平衡纯化，以除去残留的20%乙醇。再用buffer A(20mM PB，PH = 7. O)平衡 SP 柱；2.上样以2ml/分钟的流速进样品，待样品完全进柱后，用5倍体积的平衡buffer A(20mM PB, PH = 7. O)去除未结合蛋白；3.洗脱洗涤5倍柱体积的溶液后，至280纳米吸光度回落基线。再分别换用洗脱缓冲液洗脱5倍柱体积的溶液并收集洗脱液；洗脱缓冲液由KCl和20mM PB组成，KCl在洗脱缓冲液中的浓度分别为O. 5M、1. OMU. 5M。将不同盐浓度洗脱收集液进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色鉴定，结果如图4所示，目的蛋白主要集中在I. OM洗脱液中，SDS-PAGE鉴定后，重组蛋白冻干保存。电泳为12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。五、重组蛋白的验证一质谱分析为鉴定制备的重组HSA-opt_hIL28B蛋白的属性，将图4中目标蛋白条带切取下来，送西农生(北京)生物技术有限公司进行基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-T0F-MS),结果如图5所示,将所得的肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)运用MASCOT软件搜索比对最新的NCBI蛋白数据库以鉴定目的蛋白，发现肽段序列与HSA或hIL28B匹配，表明制备的重组蛋白的氨基酸序列正确。实施例2、融合蛋白的功能验证——HSA-opt-IL28B融合蛋白调节的细胞内信号通路分析HepG2细胞购于中国医学科学院基础医学研究所。人黏液病毒抗性蛋白A(Myxovirus resistance protein Α,ΜχΑ)是干扰素诱导蛋白之一，该蛋白具有抗多种病毒的活性，正常情况下基因不表达，但是在多种病毒感染时可经过病毒感染诱导的I型(α β )和III型(λ s)干扰素通路被快速诱导表达。MxA在病毒感染和IFN治疗中是I型和III型干扰素活性的标志物,故可通过测定MxA蛋白或其mRNA来反映I型和III型干扰素的生物活性。本发明以!fepG2细胞接种于6孔板长满单层后，分别加入l、10ng/ml纯化后的重组HSA-opt-hIL28B蛋白，同时以人IL28B蛋白、以lng/ml的IFN-a 2b (购于先灵葆雅公司)、以及PBS处理的!fepG2细胞组作为对照，37°C孵育，24h后收细胞，每孔加入100 μ LI X SDS loading buffer 重悬，煮沸 IOmin, 12000rpm室温离心 5min,取 IOul 上清经westernBlotting检测MxA的表达水平。MxA抗体购自美国R&D公司。检测方法为免疫印迹。具体结果如图6所示，HSA-opt-hIL28B蛋白和hIL28B蛋白的处理均可刺激H印G2细胞诱导MxA的表达，且其表达水平随HSA-opt-hIL28B蛋白和hIL28B蛋白处理浓度的上升而增高，说明重组HSA-opt-hIL28B蛋白和重组hIL28B蛋白一样具有刺激干扰素诱导蛋白表达的生物学活性。人IL28B蛋白的制备方法与HSA-0pt_hIL28B的制备方法基本相同，不同的是重组菌中转入的外源基因为核苷酸序列如SEQ ID NO 2中第1756-2343位核苷酸所示基因。人IL28B蛋白的验证——质谱分析将制备的目标蛋白送西农生(北京)生物技术有限公司进行基体辅助激光解吸电 离飞行时间质谱分析(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of FlightMassSpectrometry, MALDI-TOF-MS)，结果如图7所不，将所得的月太指纹图谱(PeptideMassFingerprinting,PMF)运用MASCOT软件搜索比对最新的NCBI蛋白数据库以鉴定目的蛋白，发现肽段序列与hIL28B匹配，表明制备的蛋白的氨基酸序列正确。
权利要求
1.一种融合蛋白，是人血清白蛋白和λ干扰素连接而成的融合蛋白。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述人血清白蛋白位于所述λ干扰素的N端； 和/或，所述λ干扰素为人白细胞介素28Β; 和/或，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
3.权利要求I或2所述融合蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是SEQID NO 2所示DNA分子； 2)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是将SEQID ΝΟ:2所示基因插入表达载体pPinka -HC的多克隆位点得到的。
7.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是将SEQID NO:2所示编码基因导入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌具体为毕赤酵母，再具体为如下四种菌株中的至少一种ade2蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型毕赤酵母和ade2/prbl/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母； 和/或，所述SEQ ID NO :2所示编码基因是通过权利要求5或6所述重组载体导入的。
8.一种制备权利要求I所述融合蛋白的方法，包括如下步骤 1)将权利要求7所述的重组酵母菌预培养至对数生长期； 2)用甲醇对步骤I)得到的菌进行诱导培养，诱导培养完毕，收集上清液，即得到所述融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述甲醇占诱导培养体系的1.0%-4.0% (体积百分比)，具体为2%-4%或2%-3% ； 所述步骤2)中，所述诱导培养的时间为48h-72h，具体为72h。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，所述预培养包括如下步骤将权利要求7所述的重组酵母菌接种于用于培养酵母菌的培养基中，培养至培养体系的0D600为5. O 6. O ; 所述步骤2)中，在所述用甲醇进行诱导之前，包括如下步骤将步骤I)得到的菌体重悬于用于诱导酵母菌的培养基中，再培养10-14h ； 所述用于培养酵母菌的培养基为用于培养毕赤酵母菌的培养基，具体为BMGY培养基；所述用于诱导酵母菌的培养基为用于诱导毕赤酵母菌的培养基，具体为BMMY培养基； 所述步骤I)和所述步骤2)中，所述培养的温度为30°C。
全文摘要
本发明公开了一种融合人白细胞介素28B及其制备方法。本发明公开的融合蛋白是人血清白蛋白和λ干扰素连接而成的融合蛋白。实验证明，用本发明的重组菌制备HSA-opt-hIL28B，表达量高。且表达产物具有较强的活性。因此，本发明重组菌及本发明方法在长效人IL28B的制备领域中有广阔的应用前景。
文档编号C12N5/10GK102757502SQ201110106888
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者司有辉, 杨威, 杨洋, 程敏 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所