专利名称：受高盐诱导的盐藻基因片段和钠／磷共转运通道基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，属于受高盐胁迫诱导的新的盐藻差减cDNA文库、基因片段的分离和一个受高盐胁迫和无机磷饥饿诱导表达的新的盐藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白基因及其编码的蛋白质。
背景技术：
植物对渗透胁迫的反应是一个多基因控制的复杂过程。不同植物对渗透胁迫的反应也不尽相同，具有丰富的多样性。但是，对渗透胁迫的细胞水平的反应则似乎在整个生物界都是保守的(Yancey等.Living with water stressevolution of osmolyte systems.Science 1982，2171214-1222)。已有相当多的例子表明，从高等植物中获得的一些基因，往往是间接利用了从动物、低等植物、甚至是酵母、细菌中发现的该类同源基因才分离出来的。实际上，这些同源基因也经常被直接应用于转基因作物遗传改良中。
同样的道理，从一些生存于极端环境如高盐碱环境中的低等生物中，应该能较方便地分离得到与抗渗透胁迫相关的基因，这些基因很可能被直接或间接用于转化各种重要农作物。盐藻(Dunaliella viridis)就是一个具有这样特性的真核单细胞绿藻(Cowan.A.K等.Dunaliella salinaA model system for studying theresponase of plant cells to stress.J Exp Bot 1992；431535-1547)。它的抗环境胁迫的能力异乎寻常，是迄今所知的最耐盐的真核生物，可以在从接近淡水(NaCl＜50mM)直到饱和盐水(NaCl＞5M)的环境中生长。同时还具有极强的渗透调节能力，其细胞一次可以耐受3-4倍渗透压的变化(Sadka A等.A 150kilodalton cell surface protein is induced by salt in the halotolerantgreen alga Dunaliella salina.Plant physiol 1991；95822-831)。因此，盐藻因其极强的耐受渗透胁迫和其它极端环境的能力被作为研究耐逆机制及其发掘抗逆基因的模式生物而倍受关注(Hans J.Bohnert等.A genomics approachtowards salt stress tolerance，Plant Physiol.Biochem.2001，39，295-311)。
抑制差减杂交(Suppression subtractive hybri dization，SSH)技术(Diatchenko L.等，Suppression subtractive hybridizationa method forgenerating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes andlibraries.Proc.Natl Acad Sci USA，1996，93(12)6025-6030)是近年兴起并广泛应用于细胞生殖、发育、分化、癌变、衰老及程序化死亡等生命过程有关基因的差异表达以及相关基因的分子克隆的最有效的方法之一。
为了更好地从分子水平上对盐藻进行耐盐机制的研究、发掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因资源，本领域迫切需要开发高盐胁迫诱导表达的基因及其编码蛋白。现有技术中没有盐藻高盐胁迫诱导表达的基因及其分离鉴定的报道。
发明内容
发明人进行了广泛的研究，利用当前的分子生物学技术如抑制差减杂交技术、基因芯片及生物信息学等构建了极端耐盐的模式生物盐藻(Dunaliellaviridis)受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库，并从中克隆到10个新的受盐胁迫诱导的基因片段和1个Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白基因cDNA(DvSPT1)和基因组DNA(GDvSPT1)，并对DvSPT1基因进行功能分析。
根据上述的研究工作，本发明所要解决的技术问题之一是提供盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库用于筛选盐藻受高盐胁迫诱导的基因。
本发明所要解决的技术问题之二是提供盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库的构建方法。
本发明所要解决的技术问题之三是提供盐藻受高盐胁迫诱导的cDNA片段。
本发明所要解决的技术问题之四是提供盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白基因的cDNA序列及其全长基因序列。
另外，本发明所要解决的技术问题是提供盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的氨基酸序列。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下采用本领域常用的抑制差减杂交法构建盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库。优选地盐藻在低盐条件下培养，用抑制差减杂交法构建差减cDNA文库。优选地，盐藻在低盐条件下培养，然后经4倍渗透压的高盐胁迫诱导，盐藻从0.5M NaCl到2.0M NaCl诱导24小时，用抑制差减杂交法构建差减cDNA文库。
盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库的构建方法包括如下步骤(a)盐藻从低盐到高盐胁迫诱导；(b)提取盐藻诱导前后的mRNA；(c)将(b)所获得的mRNA反转录合成cDNA，诱导后的cDNA为测试cDNA(Tester cDNA)，诱导前的cDNA为参照cDNA(Driver cDNA)；(d)将Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切产生较短的平末端片段；将Tester产物分成两等份，分别与不同的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)连接，而Driver cDNA不与接头连接；(e)两份Tester(Tester cDNA-Adaptor 1和Tester cDNA-Adaptor2R)分别与Driver cDNA混合，进行第一次差减杂交；(f)将(e)的两份杂交产物未经变性即进行混合，并加入过量Driver cDNA混合，进行第二次差减杂交；(g)接头末端填平；(h)抑制性PCR扩增差异表达的序列；(i)用巢式引物(Nested Primer)进行第二轮PCR扩增，使差异表达的片段得到富集；(j)将(i)的扩增产物插入克隆载体，转化感受态细胞，构建盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库。
其中，提取盐藻诱导前后的mRNA、反转录合成cDNA的方法在本领域是公知的，而且有商品化的产品可以使本领域的普通技术人员方便地实施之。通常将靶序列所在的样本称为检测样本(Tester)，而把用于参照的样本称为参照样本(Driver)。在本发明中，盐藻诱导后的mRNA即为测试样本(Tester)而诱导前的mRNA即为参照样本(Driver)。RsaI为四碱基位点(GTAC)识别酶，可以将由mRNA而来的双链cDNA酶切为几个片段并产生平末端，增加了差异表达基因检出的几率、防止长链cDNA片段所形成的复杂结构对有效差减杂交的干扰。接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)是由一长链(约40余个核苷酸)和一短链(约10余个核苷酸)组成的一端是平末端的双链DNA片段，而且双链两个5’端均无磷酸基团，保证了接头以唯一的方向与cDNA片段连接即接头长链的3’端与cDNA的双链5’端连接。接头长链外侧序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同。在接头上含有T7启动子序列并含有内切酶识别位点(如Not I、Srf I、Sma I、Xba I)，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)的序列对本领域的普通技术人员来说是公知的，或者采用商品化的产品。
在本发明构建盐藻差减cDNA文库的步骤(h)中选用与接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)外侧端核苷酸序列相同的引物进行抑制差减PCR扩增。在步骤(i)中选用一对与接头内侧端核苷酸序列相同的引物进行第二轮PCR扩增。这样经过两轮PCR、基于PCR抑制效应的存在以及选用两对引物可以特异扩增代表了盐藻经高盐胁迫诱导的差异表达的cDNA片段。基于上述描述，接头(Adaptor1和Adaptor 2R)的序列对本领域的普通技术人员来说是公知的，或者采用商品化的产品，因而步骤(h)和(i)所选用的引物对本领域的普通技术人员来说是公知的，或者采用商品化的产品。PCR扩增选用本领域常用的条件。
接头上含有酶切位点，因而利用本领域公知的方法可以方便地实现将上述PCR产物插入克隆载体。用本领域常用的方法将插入了PCR产物的克隆载体转化感受态细胞。
其中步骤(a)高盐胁迫诱导盐藻的方法是盐藻在低盐条件下培养，然后经4倍渗透压的高盐胁迫诱导。在本发明的一个实施例中，盐藻在含有0.5M NaCl的DM培养基中培养，然后在含有2.0M NaCl的DM培养基中诱导24小时。
利用接头引物(步骤(h)和步骤(i)的引物)对上述差减cDNA文库的部分克隆进行PCR鉴定。以差减cDNA第二轮PCR产物为探针，用d-32p dCTP标记，通过Micro-Array技术对所得到上述差减cDNA文库的克隆做进一步鉴定，其中有11个cDNA克隆其表达明显地受高盐胁迫诱导而增强表达，并对这些克隆进行了测序和BLASTX分析。
因而，本发明提供了盐藻受高盐胁迫诱导的cDNA片段，SEQ ID NO1～11。其中SEQ ID NO8编码了一个已知的叶绿素a/b结合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO1～7及SEQ ID NO9～11在基因库(Genbank)中无同源序列发现，均为可能的新基因。
本发明的另一方面，利用盐藻高盐胁迫诱导的差异cDNA片段(SEQ IDNO1)为探针筛选盐藻cDNA文库，得到1个特异阳性克隆，测序鉴定结果表明，cDNA全长是2649bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA(Andrens HW等，Primary structure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerantalga Dunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28657-666)及poly(A)结构，命名为DvSPT1，SEQ ID NO12，系编码盐藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的全长cDNA。其中79～2097编码盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白。
在本发明的说明中，盐藻cDNA文库是指用本领域常用的方法提取盐藻mRNA，然后反转录成cDNA，然后插入克隆载体并转化感受态细胞而得到的代表盐藻基因表达的cDNA文库。而盐藻差减cDNA文库指本发明用抑制差减杂交法构建的盐藻受高盐胁迫诱导前后的差异表达cDNA文库。
本发明另一方面还提供盐藻(Dunaliella viridis)的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白，命名为DvSPT1，其氨基酸序列为SEQ ID NO13。
本发明还提供了盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的全长基因，命名为GDvSPT1，SEQ ID NO14。
本发明还提供了编码盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的基因序列，SEQID NO15。由于密码子具有简并性，因而本发明的范围不限于SEQ ID NO15的序列，应延及其编码Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的任一核苷酸改变。
利用本发明提供的盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库可以筛选盐藻在受高盐胁迫诱导时特异表达基因，如本发明的一个实施例筛选获得了编码盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的基因，SEQ ID NO12。因而利用本发明的成果能更好地从分子水平上对盐藻进行耐盐机制的研究和发掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因资源。利用本发明的构建盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库的方法及构建的差减文库可以快速、高效、高度灵敏地同时分离几十甚至几百个差异表达的基因。
本发明人提供的利用上述差减cDNA文库分离获得的受盐胁迫诱导表达的基因片段SEQ ID No.1～11，除SEQ ID No.8以外，均为新基因片段，这为进一步分离盐藻响应盐胁迫相关基因的分离及耐盐分子机制的研究奠定了基础。
另外，本发明提供的Na+/H2POx-共转运膜通道蛋白的基因DvSPT1基因cDNA及基因组序列GDvSPT1是首次从盐藻中分离的新基因，其编码了一个Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白，这个基因受高盐胁迫和无机磷饥饿诱导特异表达，在盐藻响应逆境胁迫过程中起到重要的作用。由于该基因编码的通道蛋白DvSPT1为一个受无机磷饥饿诱导而快速增强表达而提高细胞无机磷的吸收和运输，有望将该基因用于利用植物基因工程提高作物的土壤磷利用效率和分离得到一个受逆境特异诱导的启动子原件。
图1显示了盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白DvSPT1 cDNA序列及其编码的氨基酸序列分析。
图2显示了盐藻DvSPT1的氨基酸序列及同源蛋白的同源性比较分析，图2A显示的是N端同源性比较，图2B显示的是C端同源性比较。
图3显示了盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白全长基因(GDvSPT1)5’-启动子区(图3)。
图4显示了盐藻DvSPT1基因在高盐胁迫(图4A)和无机磷饥饿(图4B)条件下的Northern表达分析。
下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件和Sambrook等《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)或Melody S.Clark编《植物分子生物学—实验手册》(PlantMolecular BiologyA Laboratory Manual)(Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)或迪芬巴赫(Dieffenbach，C.W)等《PCR技术实验指南》(PCR PrimerALaboratory Manual)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2003，第二版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。在描述了本发明和详细描述了这些具体的实施方式之后，本领域的普通技术人员会充分知晓如何设计其它可靠的方法，从而通过应用本发明的成果获得同样的信息，因此无论描述得如何详细具体，都不应理解为限制本发明的总体范围。本发明的范围仅为权利要求所记载的法律结构所确定。
具体实施例方式
实施例1盐藻受高盐胁迫诱导的差异cDNA文库的构建及初步鉴定取在含有0.5mol/L NaCl的DM培养基(Sun Y等，Expression of foreigngene in Dunaliella by electroporation，Molecular Biotechnology，30(3)(2005)185-92)中稳定培养的盐藻细胞和再将上述培养状态的盐藻转移到2mol/L NaCl浓度的培养基DM中继续渗透振荡培养24小时后的盐藻细胞提取mRNA(OligotexTMmRNA Kit，QIAGEN)。按试剂盒(PCR-selectedTMcDNAsubtraction kit，clontech)要求，每一个样品需要2μg的mRNA，由于纯化的mRNA样品中有少量rRNA的残留，各取了2.4μg在两种状态下获得的mRNA样品，进行相应的cDNA合成。为了很方便的检测合成效率，在反应中加入1μl以1/10稀释的10mCi/ml，3000Ci/mmol的[α32-P]dCTP。第一链cDNA合成完成后，取出置于冰上终止第一链cDNA合成反应，立即进行第二链的合成。然后纯化回收合成好的cDNA，并用盖革计数器(Geiger counter)监测沉淀的放射性以初步确认合成效率，再电泳检测合成cDNA片段的大小和效率。结果表明合成的cDNA主要集中分布在500bp到4000bp的范围内，质量好。
然后，选用四碱基识别位点(GTAC)并产生平头末端的RsaI酶对合成好的cDNA进行酶切，酶切产物电泳检测主要集中在200bp-1000bp的范围。
将酶切样品取部分作为Tester cDNA，并且每一份样品分作两份，分别连接上有一段同源序列的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)。其余的经过酶切的诱导前的cDNA样品则作为Driver cDNA。连接反应完成后，取少量样品进行连接效率检测，样品内源激动蛋白的连接效率基本上＞25％，说明连接反应是成功的。
将以上两端分别连有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA作为Tester cDNA(2.0M)，与对应的Driver cDNA(0.5M)进行两轮差减杂交反应，富集得到由0.5M到2.0M NaCl渗透振荡时特异表达或受诱导的基因片段。将两轮差减杂交下来的cDNA群体经过末端补平后，即进行PCR扩增。在进行第一次PCR扩增之前，首先需要把cDNA的末端填平，以产生PCR Primer 1的结合位点。由于Adaptor1和Adaptor 2R的5’端有一个长22个碱基的相同片段，因此第一次PCR扩增时仅需使用一个引物，这就解决了引物聚合的问题。另外，对于这些两端连有不同Adaptor的差异表达分子而言，这个相同的片段就造成了一种抑制PCR效果，由于短分子更易形成环状结构，因此这种抑制效果对于非常短的cDNA(200bp以下)而言尤其明显。这样就大大的提高了长分子的含量，从而平衡差减过程中由短片段更易杂交、扩增和克隆而造成的潜在优势。第一次扩增后，只有两端含有不同Adaptor的ds cDNA片段能以指数形式扩增。然后再用与接头内侧序列互补的另一对巢式引物进行第二次PCR扩增，以进一步降低背景、富集差异表达的cDNA片段。
将经过第二次扩增的PCR产物直接与pMD18-T Vector(TaKaRa)进行连接，转化大肠杆菌DH5α热激感受态细胞，构建了1个代表了盐藻受0.5M～2.0M高盐渗透诱导过程中特异表达基因片段的差减cDNA文库(SSH cDNA文库)。利用接头引物(Nested PCR primer 1，Nested PCR primer 2R)对SSH文库的部分克隆进行PCR鉴定，其插入片段的平均大小为300bp左右。
以差减cDNA第二轮PCR产物为探针，用α-32p dCTP标记，通过Micro-Array技术对所得到的SSH cDNA文库384个克隆做进一步鉴定，每张膜上的矩阵分布为8*2，即每一个克隆在一个矩阵里有两个重复。根据杂交信号的强弱，其中有11个cDNA克隆其表达明显地受高盐胁迫诱导而增强表达，并对这些克隆进行了测序和BLASTX分析(表1)。SEQ ID NO1～11参见序列表SEQ ID NO1～11。其中SEQ ID NO8编码了一个已知的叶绿素a/b结合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO1～7及SEQ ID NO9～11在基因库(Genbank)中无同源序列发现，均为可能的新基因。
实施例2盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道基因的分离及序列分析(a)盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道基因全长cDNA的克隆及序列分析通过利用SSH差异片段CP1A60(SEQ ID NO1)为探针筛选盐藻cDNA文库，得到1个特异阳性克隆，测序鉴定结果表明，cDNA全长是2649bp(SEQID NO12)，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA(Andrens HW等，Primarystructure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerant algaDunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28657-666)及poly(A)结构，命名为DvSPT1。Vector NTI8.0软件的分析结果显示，最长读码框编码了一个含672个氨基酸的蛋白(图3)(SEQ ID NO13)，蛋白分子量大小为73.3kDa，蛋白分子量大小为73.4kDa，等电点为5.29的酸性蛋白，命名为DvSPT1。
表1 SSH阳性克隆及可能编码蛋白
序列分析显示，CP1A60处在全长cDNA的3’端非翻译区的2064-2304bp处，可见，所获得的SSH cDNA片段并不在基因编码区而在多变的非编码区。
利用BLASTP程序对DvSPT1预测得到的氨基酸序列分析发现，该蛋白与其它物种来源的无机磷通道中的钠/磷共转运膜通道蛋白同源性较高(图2)，如周氏扁藻的TcPHO，衣藻的B2型磷通道蛋白(BAB96548)，酵母的高亲合性钠依赖型磷通道蛋白PHO89(NP-009855)，链孢霉的高亲合性钠依赖型磷通道蛋白PHO4，白血病病毒受体高亲合性钠依赖型磷通道蛋白Na-Pi III(AAA52572)等。其中，DvSPT1编码的蛋白同周氏扁藻TcPHO同源性最高，同源性可以达到31.2％，其次是衣藻的B2型磷通道蛋白，同源区段主要集中在N端和C端的跨膜区域(图2)。进一步对所编码的蛋白进行跨膜区的预测(http//www.ch.embnet.org/)显示，DvSPT1蛋白为包含11个跨膜区的膜蛋白(图1，图2)，与以往描述的其它物种来源的无机磷通道蛋白有10-12个跨膜区的特征十分相似。但需要指出的是，DvSPT1的11个跨膜区呈不对称分布，7个跨膜区分布在N-端，4个跨膜区分布在C-端，这与其它物种中发现的跨膜区通常呈对称分布不同。
此外，DvSPT1这个蛋白中含有二段7个氨基酸残基的保守重复序列-GANDVAN-(图1，图2)，与所有已报道的磷转运通道蛋白中几乎包含两段-GANDVAN-保守序列的特征非常一致。DvSPT1的两段-GANDVAN-保守序列处在N端的第一和第二跨膜区之间(57-63Aa)和C端的第八跨膜区(405-411Aa)处。
(b)盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道基因全长基因组序列的克隆及序列分析用CP1A60(SEQ ID NO1)为探针，从盐藻的基因组文库(Yang Zhiyong等，Construction of a genomic DNA library of Dunaliella viridis.ActaPhytophysiologica sinica 26(2000)75-78)经过两轮筛选得到1个特异的噬菌体克隆(λGDvSPT1-1)。提取噬菌体DNA，SacI酶切电泳，利用DvSPT1全长cDNA为探针进行Southern分析，杂交后只有一个单一的杂交带(～8kb)，说明这个杂交片段已完全覆盖了DvSPT1的cDNA全长序列。
将与DvSPT1全长cDNA杂交的λGDvSPT1-1#单一片段亚克隆并进行了测序，结果显示，得到的基因序列全长为7925bp，包括位于第一翻译起始密码子上游的1321bp的5’启动子序列(图3)，同时也包括终止密码子下游的1921bp的3’端终止序列。将DvSPT1cDNA序列与得到的基因全长序列通过GCG网站的BESTFIT程序进行分析，这个片段确实完全覆盖了DvSPT1的编码区域，因此将这个基因命名为GDvSPT1(SEQ ID NO14)。该基因包括20个外显子(平均大小132bp)和19个内含子(平均大小185bp)，所有内含子的5’端都是GT，3’端都是AG(表2)(Shapiro，M.B.等，RNA splice junctionsdifferent classes of eukaryotes sequence statistics and functionalimplications in gene expression.Nucleic Acids Res.15(1987)7155-7174)。
网上(http//genes.mit.edu/McPromoter.html)预测(图3A)显示，GDvSPT1基因启动子核心区域包括了一段50个碱基的序列，这段序列的起始点在-40bp处，在+10bp处终止，其中包括了可能的TATA box序列(TATAA)和转录的起始位点 如果将转录起始位点 定义为该基因序列的“+1”，其编码区的第一个可能的起始密码子ATG就位于在+462～+464bp处。值得注意的是，一个受Pho4p结合的核心序列(CACGT)(Uthappa T.Mukatira等，Negative regulation of phosphate Starvation-induced genes.PlantPhysiology.127(2001)1854-1862)位于-711～-715bp的位置，而Pho4p在酵母中研究的比较清楚，这提示从盐藻克隆的这个基因很可能也是受PHO调控系统的调节。而且，CACGT这个顺式元件也是植物界一个与逆境相关的极其保守的调控元件(Heinemeyer T.等，Databases on transcriptionalregulationTRANSFAC，TRRD，and COMPEL.Nucleic Acids Res.26(1998)364-367)，表明所分离的这个基因跟适应外界逆境具有极为密切的关系。
实施例3盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道基因在高盐胁迫和无机磷饥饿条件下的诱导表达(a)盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道基因在高盐胁迫条件下的诱导表达为了研究DvSPT1这个基因在盐藻细胞体内转录水平及与盐浓度之间的相关性，首先将盐藻细胞在含1.0M NaCl的DM培养基中进行培养，在2×106cell/ml的时候收集细胞，然后将其转移至含有2.0M NaCl的新鲜DM培养基中继续培养，分别在含有2.0M NaCl的新鲜DM培养基中继续培养0分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、9小时、12小时和24小时，然后提取盐藻细胞总RNA，采用α-32P-dCTP标记的DvSPT1(2121bp-2633bp)的3‘端特异片段(PCR扩增引物DvT1RTS5’-ccctgttccactcactgc-3’(SEQ ID NO16)，DvT1RTA5’-gaacaggggtggtgcttaca-3’(SEQ ID NO17)，)为探针进行Northern分析(图4A)。结果表明，盐藻细胞经历1.0M NaCl→2.0M NaCl高渗振荡后，DvSPT1基因受到诱导而表达增强。从杂交信号可以看出，这两个基因的表达模式基本一致，在高渗振荡1小时后2小时之前就开始受到诱导，而且到3小时快速积累到最高的转录水平。随着诱导时间的延长，转录水平又逐渐降低，到24小时基本降低到正常培养条件下的表达水平。
(b)盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道基因在无机磷饥饿条件下的诱导表达为了进一步研究DvSPT1这个基因的表达水平是否受到无机磷饥饿的诱导，将生长在含有2.0M NaCl的DM培养基(0.2mM KH2PO4)中的盐藻细胞，在其生长达到2×106cell/ml的时候收集，然后用新鲜的无磷培养基洗涤细胞两次，再重悬于无磷的等渗培养基中继续培养，分别取继续培养0小时、1小时、3小时、6小时、18小时和36小时的盐藻细胞提取总RNA，同上述相关实验一样，用α-32P-dCTP标记的DvSPT1的3‘端特异片段为探针进行Northern分析(图4B)。结果显示，DvSPT1的转录水平在无机磷饥饿处理1小时的时候开始受到明显的诱导，在6小时转录水平达到最高，到18小时往后表达水平逐渐回落到一较为恒定的表达水平。Meira Weiss等(Meira Weiss，Gal Haimovich，Uri Pick，Phosphate and sulfate uptake in thehalotolerant alga Dunaliella are driven by Na+-symport mechanis m.J.Plant Physiology 158(2001)1519-1525)诱导动力学研究结果显示盐藻在无机磷饥饿3～6小时才可以检测到无机磷的诱导吸收，这种诱导吸收主要是依赖于吸收速率的增加而不是Km值的变化，因此他们推测无机磷的诱导吸收是由于管家基因的诱导合成起作用而不是新的转运系统的诱导产生。研究结果显示DvSPT1在无机磷饥饿诱导6小时转录水平达到最高，这与Meria W.等所得到的动力学结果正好相符合，可以推断，无机磷的诱导吸收是发生在无机磷转运通道诱导转录完成之后或转录产物积累到一定的量的时候才开始的，这时候重新合成的转录产物经过翻译和后加工产生了足够的无机磷转运蛋白来增加细胞对环境中有限的无机磷的吸收来满足正常的生长需要。
表2盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道基因(GDvSPT1)内含子和外显子组成
序列表<110>上海大学<120>受高盐胁迫诱导的盐藻基因片段和一个盐藻Na+/H2PO4-共转运通道基因的分离及鉴定<160>17<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>241<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>1gtacgagaac gtgtctgagc agaccatgcc ttaattctga agtcttgaca atcttttccc 60tgttccactc actgcactct tgctcttcag ttaccaattc atcctttttg aagtcttgct120tttgttctga gattgaacac taagcatgac ccgttctgtt gtgttcacat agccatatca180tttagtcagg tgttgtggct ggttcatatc ctgaccaaat ttagatctat tgctggtatt240g241<210>2<211>349<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<220>
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<221>misc_feature<222>(213)..(213)<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature
<222>(227)..(227)<223>n is a，c，g，or t<400>2cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 60ccattccaca ccacatacga gccggaagca taaagtgtaa aagctggggt gcctaatgag120tgagcttact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc ttccagtcgg ggannctgtc180gtgccagctg cattaatgat ccgccaacgc gcngggagag gccgttngcc tattgggcgc240tcttccggct tcctcgctca ctgactcgct gcggctcggt cgtttcggct gcggcgagcg300gtatcagctc actcaaaggc ggtattacgg gttattccac gaaatcagg349<210>3<211>257<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>3acaaacagga tgcattattc tcagatgcaa gtcacagatg cgagtcacaa aataccacca 60ggaaacaaga cgagctgcac atcaaacggg cagcaaagaa tagtattgag ttcagtgcac120agcacacatc cccaagccaa tggaaggtgt gtatgatctc aagccacagt tcggaaatcc180aaggggagtc cgcatgtgca tacagcattt atgaattgag tgaagcatac caatgaaatt240ccaattcagt tgtatgt 257<210>4<211>375<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>4acaggattgg gctagcttgg tcaggagcgt aactctgttt tgtgctgaga gttctgcttt 60aggcagcagg cacgcttgca tgagcagccc agttggatcc atttccaagc atgactcggt120tagcgcagtg ccaggcctaa taacagcact gttgctttcc aggtgcgcgg ttagagaaga180
gatgcacaca ttttgatgcc tgaataaact tgggaggcca tatctaggtc tgtgattttg240aacgggaagg gcagcttgct ctagaatttg aggtgtgata accttattat tttgctcggg300acccgtcttg gcagctctct cccgctggat tgtcatgcat agaaacatgt gtgttcatcg360gcgtgctttt aaagt 375<210>5<211>238<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>5accacataac accaaggtcg taaatatcta caaggatcca ctttcaggat ccccgccttg 60agtgcctgtc tctctcccga cagcttctac tactggcact actctctgcc tacccagcaa120tgccagctca gacacagagc tctaggtccc agctacaact acacctgcaa actacctagg180aaataatcta atctagacct cggccgcgac cacgctaatc tctagaggat ccccgggt 238<210>6<211>496<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>6acattcgcat gcgtcctttg tgtgcaccac caactctcca tccagtccct gctcatccct 60gtccttgtgt gtatgtgtgt gaggtgtttg aaactgtggc atctgtgcgt gtatgatgct120catgcgcagc gtggaaatgc acagatgtgt tcgcgtgtgc atgcctcagt gtgtgtgctt180gtaggccagg gaccccctgt agttgcctgg cacaaaaatg caatccctgc atctgccaat240gttgcagacg taggcaggga aggctgagaa gaacactctt aataggcctt tcccatgttt300cgcgcatgtc caagcattcc aagatgatcc tgcttgctct gttttcattt catggagacc360tcgacctagc ttgtttctct ctctgctaca ttgcacggat gagtgtgtgt gtgtgtgtgt420gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgttgtc ttcccgctca tatataagtg480
caattatatg taaaaa496<210>7<211>287<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>7acatgctgag gcagatcaac agcctgttca agttcacctt cttccccaga aacttctccg 60agttcgcggg cgcttctaac cagaccgttc cctagattag attatttcct aggtagtttg120caggtgtagt tgtagctggg acctagagct ctgtgtctga gctggcattg ctgggtaggc180agagagtagt gccagtagta gaagctgtcg ggagagagac aggcactcaa ggcggggatc240ctgaaagtgg atccttgtag atatttacga ccttggtgtt atgtggt 287<210>8<211>290<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>8acccaggcga ggccttcgac ccccctgggc ctggctgatg accctgacac cttcgctgag 60ctgaaggtca aggagatcaa gaacggccgt ctggctatgt tetcttgcct aggcttcttc120gtccaggcca ttgtgaccgg caagggcccc attgagaacc tgatggacca cctggccaac180cccgctgaga acaacgcctt cgccttcgcc accaagttca cccccaacgc ataaatgccg240gactctccct cccgatagta gttttcaatg taatgtaggt ctccagctgt 290<210>9<211>517<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<220>
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<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>11acaagctctc tcgttggcca ctcgataaca ccaacccagt gcagaaacaa taataaaatt 60ggcaatggaa atgctgtgca ttagagcaca tggagtggcc tttattcatc acagggctct120ggaaacaagc ttgctcacat cttactgttc aggatgcacc ttgttagcct ccttagtggc180ttccacgtcc gactttccac tgtcgctttc acctgctaga agcttctcat acgcagcctt240gccacgcatt gacctactct ccatggcaaa ccgcagaacc tgcccgggcg gccgctcgaa300atctctagag gatccccggg t 321<210>12<211>2649<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<220>
<221>CDS<222>(79)..(2097)<400>12cttgtacatc ggtgcacgca ccgagcccct ccccaccgcc acttcgtctg cgaaagcagg 60aggggtaggc acgcagcc atg acg gac gtg gac agc ttc agc ggc aac atg 111Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met1 5 10ccc aac ctc tcg ggc ttt gag tcc gca gcg ggc tgg caa ggc gag aac 159Pro Asn Leu Ser Gly Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn15 20 25ttc acc tac cac gat ggc aag tgg tct gcc tac gtg tgg ctg ctg gtc 207Phe Thr Tyr His Asp Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val30 35 40atc ggc tcc ttc acc tca ttc atg gct gca tgg ggc atc ggt gcc aac 255Ile Gly Ser Phe Thr Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn45 50 55
gat gtg gcc aac tcc ttc gcc aca agt gtg ggc tcc aag gct ttg acc303Asp Val Ala Asn Ser Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr60 65 70 75atg ttc caa gcc tgc gtg att gcg ggc atc ttt gaa ttt gtc ggc gct351Met Phe Gln Ala Cys Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala80 85 90gtg tcc ctg ggt ggt act gtt gtg aag acc gtg aag ggc tcc atc act399Val Ser Leu Gly Gly Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr95 100 105gac ccc tca atg ttc aag cac cag ccc cag att ttt gcg tac ggc atg447Asp Pro Ser Met Phe Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met110 115 120ctt ggt gcc tct act tct gta gcc att gtg ctc ttc ctg gcc aca tac495Leu Gly Ala Ser Thr Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr125 130 135ttg aag cag gct gtg tcc acc aca cac act gca att ggg tct gtg ctt543Leu Lys Gln Ala Val Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu140 145 150 155ggc ttc ggc ttg gtg tat gga ggc gct gat ggt gtg acc tgg aac gag591Gly Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu160 165 170gtg tcc gat gag ttc ccc ttc cgc aag ggg ttc aca cct gtc gtc atc639Val Ser Asp Glu Phe Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile175 180 185tcc tgg ttc gtc tcc ccc gtc ttc act gcc att ctg tcc tcc gga ttc687Ser Trp Phe Val Ser Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe190 195 200ttc atc atc acc agg att gtc tgc ctg cag cgc cag caa tcc tac aag735Phe Ile Ile Thr Arg Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys205 210 215att gcc ttc ttc atg atc cct gtg ctg atg atg atc acc atc ttc att783Ile Ala Phe Phe Met Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile220 225 230 235gtc ctg ctg gcc atc ttc ctg aag agt gtg gac tct gga cac gac cgt831Val Leu Leu Ala Ile Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg
240 245 250gag ggt gag ctg aac tgg tcc aca gac aag aag gcc tgg gtg gca att879Glu Gly Glu Leu Asn Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile255 260 265gtt gtc ggt gct ggt gcc ggt ctg ctg acc atc ccc tac acc atc tgg927Val Val Gly Ala Gly Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp270 275 280ctg agg aag tcc atg ctc cag gag gac cag gaa gtg cac gag gag aat975Leu Arg Lys Ser Met Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn285 290 295atg gct cgt gat gct gag acc gcc cac gtc gca gct ggt ggc aca ctg 1023Met Ala Arg Asp Ala Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu300 305 310 315aag gag aag aac cct gag gat gat gtg cat gag ctg acc aag gct gag 1071Lys Glu Lys Asn Pro Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu320 325 330aag ttt atg gag tgg ttc aac ggc acc tgg ttc ggc cag aga cag ttt 1119Lys Phe Met Glu Trp Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe335 340 345gtg aag aac ttt gtt gca gct atg aca tac gat gtg cac gcc cat gtg 1167Val Lys Asn Phe Val Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val350 355 360gcc acc atg gac aac ccc aag gtt gcc cag atg cat gca gat gct gag 1215Ala Thr Met Asp Asn Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu365 370 375gtc ttc gac ccc cgc act gag gat gtg ttt aag cgc atg cag atc atc 1263Val Phe Asp Pro Arg Thr Glu Asp Val Phe Lys Arg Met Gln Ile Ile380 385 390 395act gcc tct gct gtg gcc ttc gtg cac ggt gcc aat gat gtc gcc aac 1311Thr Ala Ser Ala Val Ala Phe Val His Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn400 405 410ggt gtg ggc cct ctt gcc ggt atc tgg gac acc tac aac acc tac cag 1359Gly Val Gly Pro Leu Ala Gly Ile Trp Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gln415 420 425
tct ggc agt ggc aag gcg tct cag ccc cgc tgg att ctg gtc atc ggt1407Ser Gly Ser Gly Lys Ala Ser Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ile Gly430 435 440gct gct ggc att gtg ttc ggc ctg gcc atg tac ggc tac cgt atc att1455Ala Ala Gly Ile Val Phe Gly Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg Ile Ile445 450 455gcg acc ctg ggt gtg gac ttg gtg gtc atg acc ccc aac cgt ggt tac1503Ala Thr Leu Gly Val Asp Leu Val Val Met Thr Pro Asn Arg Gly Tyr460 465 470 475tct gtg gag ctg gca gca gct gct atc att gcc ctg gcc tcc acg tac1551Ser Val Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Ala Ser Thr Tyr480 485 490ggt ctg ccc gtc tcc act acg caa gtt gtg act ggc ggt aag ata ggg1599Gly Leu Pro Val Ser Thr Thr Gln Val Val Thr Gly Gly Lys Ile Gly495 500 505gtg ggc atg tgc gag agc tgg aag atg aca ggc gtg aac tgg ctc ctg1647Val Gly Met Cys Glu Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu510 515 520ttt atc cgc acc ttc tgg ggc tgg gtt ggt gct ctg gtg act ggc gcc1695Phe Ile Arg Thr Phe Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala525 530 535atc ctc tca gct ctg ctc ttc tcc atc ggt gtg tac ggc ccc agc cgc1743Ile Leu Ser Ala Leu Leu Phe Ser Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg540 545 550 555act gac ctg gac tac gtg acc cac tac cag agg gcg atg aag atc gac1791Thr Asp Leu Asp Tyr Val Thr His Tyr Gln Arg Ala Met Lys Ile Asp560 565 570atc gac cag tcc atg caa gct ctc ctt gac cg atgt gct gct gct cct1839Ile Asp Gln Ser Met Gln Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala Ala Pro575 580 585gca cct acc aat ggt ggt gga ggc tgt ggc acc gga gac ttg aac tgc1887Ala Pro Thr Asn Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp Leu Asn Cys590 595 600tct tgc cag cag agg atc ccc tac acc atg ggt gac ctg caa ggc ctg1935Ser Cys Gln Gln Arg Ile Pro Tyr Thr Met Gly Asp Leu Gln Gly Leu
605 610 615aag acg cag gtt gat ggg ctg ttc aac ttc gag gaa aat ggc cag atc1983Lys Thr Gln Val Asp Gly Leu Phe Asn Phe Glu Glu Asn Gly Gln Ile620 625 630 635aac gag tac aac atg atg tac atg ctg agg cag atc aac agc ctg ttc2031Asn Glu Tyr Asn Met Met Tyr Met Leu Arg Gln Ile Asn Ser Leu Phe640 645 650aag tac acc ttc ttc gat ggc gac ttc tct cag tac gag aac gtg tct2079Lys Tyr Thr Phe Phe Asp Gly Asp Phe Ser Gln Tyr Glu Asn Val Ser655 660 665gag cag acc atg cct taa ttctgaagtc ttgacaatct tttccctgtt 2127Glu Gln Thr Met Pro670ccactcactg cactcttgct cttcagttac caattcatcc tttttgaagt cttgcttttg 2187ttctgagatt gaacactaag catgacccgt tctgttgtgt tcacatagcc atatcattta 2247gtcaggtgtt gtggctggtt catatcctga ccaaatttag atctattgct ggtattgtgt 2307actggtggaa gcttgggttc ccagcatggt cgtctccctc aagtacgcag gctgtattgc 2367attacctctt gttgaccgaa gacagtatct cttctaccaa tgcttgttgc ctgaacctca 2427agcgtgactg tttcgttgct tcactcttgt gtgttggctc atatttcatt ttcaccttct 2487tcagcccact gaactgattg aataatgcaa ctgcaagaat aaacacacgt ctatgtatct 2547gcactgtttg tgcaattgat ccttcttgtt gatcattttg gaatcctccg ctgattgtgt 2607aaattttgta agcaccaccc ctgttcaaaa aaaaaaaaaa aa 2649<210>13<211>672<212>PRT<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>13Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met Pro Asn Leu Ser Gly1 5 10 15
Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn Phe Thr Tyr His Asp20 25 30Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val Ile Gly Ser Phe Thr35 40 45Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn Ser50 55 60Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr Met Phe Gln Ala Cys65 70 75 80Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala Val Ser Leu Gly Gly85 90 95Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr Asp Pro Ser Met Phe100 105 110Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met Leu Gly Ala Ser Thr115 120 125Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr Leu Lys Gln Ala Val130 135 140Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu Gly Phe Gly Leu Val145 150 155 160Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu Val Ser Asp Glu Phe165 170 175Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile Ser Trp Phe Val Ser180 185 190
Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe Phe Ile Ile Thr Arg195 200 205Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys Ile Ala Phe Phe Met210 215 220Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile Val Leu Leu Ala Ile225 230 235 240Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg Glu Gly Glu Leu Asn245 250 255Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile Val Val Gly Ala Gly260 265 270Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp Leu Arg Lys Ser Met275 280 285Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn Met Ala Arg Asp Ala290 295 300Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu Lys Glu Lys Asn Pro305 310 315 320Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu Lys Phe Met Glu Trp325 330 335Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe Val Lys Asn Phe Val340 345 350Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val Ala Thr Met Asp Asn355 360 365Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu Val Phe Asp Pro Arg370 375 380
Thr Glu Asp Val Phe Lys Arg Met Gln Ile Ile Thr Ala Ser Ala Val385 390 395 400Ala Phe Val His Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn Gly Val Gly Pro Leu405 410 415Ala Gly Ile Trp Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gln Ser Gly Ser Gly Lys420 425 430Ala Ser Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ile Gly Ala Ala Gly Ile Val435 440 445Phe Gly Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg Ile Ile Ala Thr Leu Gly Val450 455 460Asp Leu Val Val Met Thr Pro Asn Arg Gly Tyr Ser Val Glu Leu Ala465 470 475 480Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Pro Val Ser485 490 495Thr Thr Gln Val Val Thr Gly Gly Lys Ile Gly Val Gly Met Cys Glu500 505 510Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe Ile Arg Thr Phe515 520 525Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala Ile Leu Ser Ala Leu530 535 540Leu Phe Ser Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg Thr Asp Leu Asp Tyr545 550 555 560
Val Thr His Tyr Gln Arg Ala Met Lys Ile Asp Ile Asp Gln Ser Met565 570 575Gln Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala Ala Pro Ala Pro Thr Asn Gly580 585 590Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp Leu Asn Cys Ser Cys Gln Gln Arg595 600 605Ile Pro Tyr Thr Met Gly Asp Leu Gln Gly Leu Lys Thr Gln Val Asp610 615 620Gly Leu Phe Asn Phe Glu Glu Asn Gly Gln Ile Asn Glu Tyr Asn Met625 630 635 640Met Tyr Met Leu Arg Gln Ile Asn Ser Leu Phe Lys Tyr Thr Phe Phe645 650 655Asp Gly Asp Phe Ser Gln Tyr Glu Asn Val Ser Glu Gln Thr Met Pro660 665 670<210>14<211>7924<212>DNA<213>盐藻(Dunaliella viridis)<400>14tcacttagaa agtgaaaaaa actgaatgct aagatggagc aagtaattac ttgtttatga 60acaaaacaaa caaggagaag cagagggaag tcctctggcc tcacgcatta catcagggca120gctaaatgct cacacacaca cacgtgcgtt aatgcatacg cgcgtgcaca cacaagcgcg180cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacggt ggtggggctc acactagtca240caatgctggt gttgggtctt tccttaatgc ctgctggtta aatccagcgt agacttttac300ttttttacac acgcatacac gcacgcacgc acgcacgcac gcacgcacgc acgcacgcac360
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权利要求
1.盐藻差减cDNA文库，其特征在于它是用抑制差减杂交法构建的盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库。
2.根据权利要求1所述的盐藻差减cDNA文库，其特征在于它是盐藻在含有0.5M NaCl的DM培养基中培养到对数生长期，然后转移到含有2.0M NaCl的DM培养基中诱导24小时，用抑制差减杂交法构建的差减cDNA文库。
3.根据权利要求2所述的盐藻差减cDNA文库，其特征在于包括SEQ ID NO1～11的cDNA片段。
4.根据权利要求2或3任一所述的盐藻差减cDNA文库的构建方法，包括如下步骤(a)盐藻从低盐到高盐胁迫诱导；(b)提取盐藻诱导前后的mRNA；(c)将(b)所获得的mRNA反转录合成cDNA，诱导后的cDNA为测试cDNA(Tester cDNA)，诱导前的cDNA为参照cDNA(Driver cDNA)；(d)将Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切产生较短的平末端片段；将Tester产物分成两等份，分别与不同的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R，)连接，而Driver cDNA不与接头连接；(e)两份Tester(Tester cDNA-Adaptor1和Tester cDNA-Adaptor2R)分别与Driver cDNA混合，进行第一次差减杂交；(f)将(e)的两份杂交产物未经变性即进行混合，并加入过量Driver cDNA混合，进行第二次差减杂交；(g)接头末端填平；(h)抑制性PCR扩增差异表达的序列；(i)用巢式引物(Nested Primer)进行第二轮PCR扩增，使差异表达的片段得到富集；和(j)将(i)的扩增产物插入克隆载体，转化感受态细胞，构建获得盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库，其特征在于，盐藻在含有0.5M NaCl的DM培养基中培养，然后在含有2.0MNaCl的DM培养基中诱导24小时，诱导前后的盐藻分别提取mRNA，用抑制差减杂交法构建cDNA文库。
5.SEQ ID NO1～11任一的盐藻cDNA片段。
6.含有权利要求5的盐藻cDNA片段的载体。
7.包括权利要求6的盐藻cDNA片段的载体的转化体。
8.盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的全长cDNA，SEQ ID NO12。
9.含有权利要求8的盐藻Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的全长cDNA的载体。
10.包括权利要求9的载体的转化体。
11.盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的全长基因，SEQ ID NO14。
12.盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO13。
13.编码如权利要求12所述的盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的核苷酸序列，SEQ ID NO15。
14.如权利要求13所述的编码盐藻的Na+/H2PO4-共转运膜通道蛋白的核苷酸序列的片段。
15.根据权利要求8、11、13或14任一的核苷酸序列在植物基因工程育种的应用。
全文摘要
本发明受高盐胁迫诱导的盐藻基因片段和一个盐藻Na
文档编号C12N15/63GK1840664SQ200510030910
公开日2006年10月4日 申请日期2005年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者许政暟, 李启云, 高孝舒, 孙煜, 张庆琪, 宋任涛 申请人:上海大学