I型干扰素的环状二核苷酸诱导的制作方法

I型干扰素的环状二核苷酸诱导的制作方法
【专利说明】I型干扰素的环状二核苷酸诱导
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 在35 U.S.C. § 119(e)下，本申请要求于2013年5月3日提交的美国临时专利申 请序列号61/819, 499的提交日期的优先权；该申请的公开内容通过引用并入本文。
[0003] 政府权利
[0004] 本发明在由美国国立卫生研究院资助的基金号AI063302、AI075038、AI080749、 AI082357和0D008677下经政府支持下完成。政府在本发明中享有一些权利。
[0005] 引言
[0006] 干扰素（也称为"IFN"）是具有多种生物学活性的蛋白质，其中一些是抗病毒、免 疫调节和抗增殖。它们相对较小的物种特异的单链多肽，由哺乳动物应答暴露于多种诱导 物例如病毒、多肽、促分裂原等而产生。干扰素保护动物组织和细胞免受病毒攻击，并且是 重要的宿主防御机制。在大多数情况下，与其他组织和细胞类型相比，干扰素提供了对产生 它们的组织和细胞类型的更好的保护，这说明来源于人的干扰素可比来自其他物种的干扰 素更有效地治疗人疾病。干扰素可分为I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。哺乳动 物 I 型干扰素包括 IFN- a、IFN- β、IFN- κ、IFN- δ、IFN- ε、IFN- τ、IFN- ω 和 IFN- ζ (也 称为限制素，limtin)。
[0007] 诱导干扰素产生的试剂可用作疫苗佐剂，以及用于启动效应T细胞应答和记忆T 细胞应答的制剂。有效的佐剂增强针对抗原的特异性免疫应答，同时最小化毒副作用，降低 疫苗接种的次数和剂量，并且扩展免疫应答。仍然存在对这样的有效佐剂的需要，所述佐剂 可与来源于细胞内病原体和癌细胞的抗原共配制以活化有效的细胞免疫应答和体液免疫 应答，从而治疗细胞内病原体以及降低肿瘤负荷。干扰素蛋白的免疫调节活性和调控干扰 素产生的信号通路作为用于设计新佐剂的标靶吸引了兴趣。
[0008] 干扰素具有治疗很多人癌症的潜力，因为这些分子具有在多重水平起作用的抗癌 活性。首先，干扰素蛋白可直接抑制人肿瘤细胞的增殖。该抗增殖活性还与多种批准的化疗 剂协调，例如，顺铂、5FU和紫杉醇。其次，干扰素蛋白的免疫调节活性可导致诱导抗肿瘤免 疫应答。该应答包括活化NK细胞、刺激巨噬细胞活性和诱导MHC I型表面表达，导致诱导 抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞活性。此外，在免疫系统中干扰素起交叉呈递抗原的作用。此 外，一些研究还显示，IFN-β蛋白可具有抗血管生成性活性。血管发生、新血管形成是固体 肿瘤生长的临界点。有证据显示，IFN-β可通过抑制原血管生成性因子例如bFGF和VEGF 的表达来抑制血管发生。最后，干扰素蛋白可通过调节在组织重塑方面重要的酶例如胶原 酶和弹性酶的表达来抑制肿瘤侵袭性。
[0009] 干扰素还表现出具有基于两种不同机制的抗病毒活性。例如，I型干扰素蛋白（α 和β)可直接抑制人乙肝病毒（"HBV"）和丙肝病毒（"HCV"）的复制，并且还可刺激攻击 被这些病毒感染的细胞的免疫应答。
[0010] 概述
[0011] 本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素（IFN)的产生的方法和组合物。所述 方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素（IFN)的方式提高所述细胞中的包含 2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该主题方法的组合物和药 剂盒。
[0012] 在一个方面中，本文提供了一种用于提高细胞中I型干扰素（IFN)的产生的方法， 这通过以足以提高细胞产生所述I型干扰素（IFN)的方式提高所述细胞中的包含2' -5' 磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平来进行。
[0013] 在某些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接触的步骤。 在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2' -5'磷酸二酯键。在另一些实施方案 中，所述环状二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯键和3' -5'磷酸二酯键。
[0014] 在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述 环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在 一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷 酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
[0015] 在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0017] 其中X和Y分别是：
[0019] 在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0020]
[0021] 在所述方法的某些实施方案中，通过提高所述细胞中的cGAMP合酶（cGAS)的活性 来提高所述环状二核苷酸的水平。在一些实施方案中，通过增强编码cGAS的核酸的表达来 提高所述cGAS的活性。在一些实施方案中，通过将编码cGAS的核酸引入所述细胞中来提 高所述cGAS的活性。
[0022] 在某些实施方案中，所述方法用于提高干扰素（IFN) α的产生。在另一些实施方 案中，所述IFN是干扰素 β。
[0023] 在某些实施方案中，所述方法用于提高哺乳动物细胞中的I型干扰素（IFN)的产 生。在一些具体实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体外 的。在另一些实施方案中，所述细胞是体内的。
[0024] 在另一个方面中，本文提供了用于提高受试者中I型干扰素（IFN)的产生方法，所 述方法包括将有效提高所述受试者中的所述I型干扰素的产生的量的包含2' -5'磷酸二 酯键的环状二核苷酸活性剂施用至受试者的步骤。
[0025] 所述活性剂可包括但不限于本文描述的任何包含W -5'磷酸二酯键的环状二 核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个W -5'磷酸二酯键。在另一些 实施方案中，所述环状二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯键和3' -5'磷酸二酯键。
[0026] 在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在某些实施方案中，所述 环状二核苷酸包含两个鸟苷。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一 些具体实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核 苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0028] 其中X和Y分别是：
[0030] 在主题方法的一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0032] 在某些实施方案中，所述包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂是提高 cGAMP合酶（cGAS)的细胞活性的药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述 cGAS的核酸。
[0033] 在某些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素（IFN) α的产生。在另一 些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素 β的产生。
[0034] 在某些实施方案中，所述对象患有病毒性感染。在某些实施方案中，所述对象患有 细菌性感染。在另一些实施方案中，所述对象患有肿瘤性疾病。在某些实施方案中，所述受 试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
[0035] 在另一个方面中，本文提供了一种用于提高受试者中干扰素基因（STING)的刺激 物介导的应答的方法，所述方法包括将有效提高所述受试者中STING介导的应答的量的 STING活性剂施用至所述受试者。在某些实施方案中，所述STING介导的应答是对具有两个 3' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸无应答性。
[0036] 所述STING活性剂可包括但不限于本文描述的任何包含2' -5'磷酸二酯键的环 状二核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2' -5'磷酸二酯键。在另 一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯键和3' -5'磷酸二酯键。
[0037] 在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在某些实施方案中，所述 环状二核苷酸包含两个鸟苷。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一 些具体实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核 苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0039] 其中X和Y分别是：
[0041] 在主题方法的一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0043] 在某些实施方案中，所述STING活性剂包含提高cGAMP合酶（cGAS)的细胞活性的 药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。
[0044] 在某些实施方案中，所述STING活性剂包含提高STING的细胞活性的药剂。在一 些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述STING的核酸。
[0045] 在某些实施方案中，所述对象患有病毒性感染。在某些实施方案中，所述对象患有 细菌性感染。在另一些实施方案中，所述对象患有肿瘤性疾病。在某些实施方案中，所述受 试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
[0046] 在另一个方面中，本文提供了一种环状二核苷酸，其包含2' -5'磷酸二酯键。这 样的环状二核苷酸可用于例如实施主题方法，包括但不限于用于提高细胞或受试者中I型 干扰素的产生的方法。
[0047] 在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2' -5'磷酸二酯键。在另一些 实施方案中，所述环状二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯键和3' -5'磷酸二酯键。
[0048] 在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述 环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在 一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷 酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
[0049] 在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0051] 其中X和Y分别是：
[0053] 在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0054]
[0055] 在另一个方面中，本文提供了一种组合物，其包含包含2' -5'磷酸二酯键的环 状二核苷酸和药学上可接受的载体。
[0056] 在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2' -5'磷酸二酯键。在另一些 实施方案中，所述环状二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯键和3' -5'磷酸二酯键。
[0057] 在某些组合物的实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方 案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核 苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环 状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
[0058] 在主题组合物的某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0060] 其中X和Y分别是：
[0061]
[0062] 在主题组合物的某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
[0064] 附图简述
[0065]当结合附图来阅读时，本发明将从以下详细描述中得到最佳理解。强调的是，按照 惯例，附图的多个特征不是按比例的。相反，为了清楚，任意扩展或缩小多个特征的尺寸。附 图中包括以下图：
[0066] 图IA至IF示出了人STING变体对映射至精氨酸232的环状二核苷酸的可变应答 性。㈧用编码靶向STING的shRNA或对照shRNA的载体转导THP-I细胞。然后用环状二 GMP (cdG)、dsDNA、环状二AMP (cdA)、多肌苷：胞嘧啶（pi: C)或仙台病毒刺激细胞，并通过 定量逆转录酶PCR来评估人干扰素 -β mRNA的诱导。（B)蛋白质印迹确认STING的敲除有 效。（C)用指定量的多种小鼠（m)或人（h) STING表达质粒转染HEK293T细胞，然后在6小 时后通过用合成的cdG(5yM)转染来刺激该细胞。GT表示来自Goldenticket(Gt)小鼠的 Sting的空I199N等位基因。通过使用共转染的IFN荧光素酶报告子构建体来评估STING 活化。（D)用编码所指定的STING等位基因的逆转录病毒载体转染Gt (空STING)巨噬细 胞，然后在48小时后通过用cdG (5 μ M)或dsDNA 70聚体的寡核苷酸（0. 5 μ g/mL)刺激该 细胞。通过qRT-PCR测量IFN诱导。ND，未检出。伍)311如与32?-环状二61^的结合测 定。将STING蛋白表达于HEK293T细胞中，并使细胞裂解物经历与 32P-CdG的UV交联，并通 过SDS-PAGE解析。通过放射自显影来对结合进行定量。以抗STING多克隆抗体进行的对 细胞裂解物的蛋白质印迹确认多种STING蛋白的相似表达。（F)mSTING对cGAMP的应答性 受到R231突变的影响。如在C中那样测试所指定的突变体。
[0067] 图2示出了 hSTING变体的序列对齐。从THP-I细胞克隆hSTING，与参照STING等 位基因 （NCBI NP_938023. 1)对比。
[0068] 图3示出，环状二GMP的应答性需要人STING的R232,但环状二GMP的结合不需 要。㈧用所指定小鼠（m) STING或人（h) STING等位基因转染293T细胞，然后用环状二 GMP(cdG)刺激该细胞。通过诱导共转染的IFN-荧光素酶报告子构建体来检测STING活性， 并将该活性表示为相对于未经刺激的细胞的荧光素酶活性的诱导倍数。（B)在α 32P-环状 二GMP的存在下对经转染的293Τ细胞的裂解物进行UV交联，通过SDS-PAGE进行解析，然 后通过放射自显影来分析。还对裂解物进行针对STING和作为平行表达对照的ACTIN的蛋 白质印迹。
[0069] 图4示出，对环状二核苷酸的最优应答性需要G230A和H232R二者，但对环状二核 苷酸的结合不需要。（Α，Β)用所指定小鼠（m) STING或人（h) STING的等位基因转染293Τ细 胞，然后用环状二GMP(cdG)刺激该细胞。通过诱导共转染的IFN-荧光素酶报告子构建体 来检测STING活性。
[0070] 图5示出，STING变体对cGAS有应答。（A)用所指定的STING等位基因以及用所 指定的人cGAS和小鼠 cGAS (wt和GS>AA突变体）转染HEK293T细胞。通过共转染的IFN 荧光素酶报告子构建体来评估STING活化。（B)用所指定的STING等位基因以及用编码来 自霍乱弧菌（V. cholerae)的cGAMP合酶（DncV)的哺乳动物表达载体转染HEK293T细胞。 如A中一样评估STING活化。（C)将rWspR、rDncV和rcGAS的体外酶促生成的产物转染至 经毛地黄皂苷通透的表达所指定的小鼠 STING蛋白和人STING蛋白的HEK293T细胞中。包 括作为对照的化学合成的环状二GMP (cdG)和cGAMP。如A和B中一样评估STING活化。
[0071] 图6示出，cGAS产生包含W -5'磷酸二酯键的非标准环状二核苷酸。（A)将纯 化的重组WspR、DncV和cGAS与a 32P-GTP或a 32P-ATP和所指定的未经标记的核苷酸混合。 将反应物与TLC电泳缓冲剂混合，并在PEI-纤维素 TLC板上解析核酸物质。（B)用核酸酶 Pl和蛇毒磷酸二酯酶消化经a 32P-GTP标记的WspR、DncV和cGAS产物，并且在PEI-纤维 素 TLC板上解析核酸物质。（C)在600MHz和50°C下得到HPLC纯化的cGAS产物的1H-31P HMBC。指定了磷酸二酯键的通过-结合的关键相关性。还示出了 cGAS产物的NMR显示的 结构。
[0072] 图7A至7D提供了对cGAS产物的附加 NMR分析。所有数据采集都在D20中和50 °C 下进行。（A，B)900MHz场中的多重性编辑的1H-13CHSQC实验。与次甲基和甲基质子对应 的正相信号以绿色示出，与亚甲基质子对应的负相信号以蓝色示出。（C) 600MHz场中的1H-1H COSY 实验。（D) 900MHz 场中的 1H-1H NOESY 实验。
[0073] 详述
[0074] 本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素（IFN)的产生的方法和组合物。所述 方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素（IFN)的方式提高所述细胞中的包含 2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该主题方法的实施方案的 组合物和药剂盒。
[0075] 在更详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这 些当然是可变化的。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定的实施方案，并非旨在限 制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。
[0076] 在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文清楚地另有说明，否则该范围上限 与下限的每个中间值以及指定范围中的任何其他指定值或中间值，直至下限的十分之一单 位，都涵盖与本发明内。较小的范围中可独立地包括这些较小范围的上限和下限，并且这 些上限和下限将涵盖于本发明内，受到所陈述范围中的任何具体排除的限值。在所陈述的 范围包括一个或两个该限值的情况下，本发明中包括排除所包括的限值之一或这二者的范 围。
[0077] 在本文中某些范围是以在数值前加术语"约"来呈示的。本文中使用术语"约"以 提供对其后面的精确数字以及其后面的数字的附近或近似该数字的数字提供字面支持。在 确定数字是否在具体列举的数字附近或近似该数字中，接近或近似的所列举的数字可为在 示出其的上下文中提供具体列举的数字的基本等价物的数字。
[0078] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与由本发明所属 领域的技术人员所通常理解相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的任何 方法和材料都可用于本发明的实施或测试中，但是现在描述代表性的示例性方法和材料。
[0079] 本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本文，就如将每个单独的出 版物或专利特别地和单独地指定为通过引用并入一样，并且所有出版物和专利都通过引用 并入本文以结合所引用的出版物来公开和描述方法和/或材料。对任何出版物的引用都是 针对其在提交日期之前的公开内容，并且其不应解释为承认由于在先发明而使本发明不享 有先于该出版物的权利。此外，提供的出版物的日期可能与实际的公开日期不同，这可需要 进行单独地确认。
[0080] 应注意，除非上下文另有清楚指明，否则本文以及所附权利要求中所用的单数形 式"一个"、"一种"和"该/所述"包括复数指示物。还应注意，可撰写权利要求书来排除任 何可选要素。同样地，该陈述旨在用作与权利要求要素的列举联合使用此类排他性术语如 "单独"、"仅仅"等、或使用"否定"限制的在线基础。
[0081] 在阅读本公开后，对本领域技术人员应显而易见的是，本文描述和示出的每一个 单独的实施方案具有单独的组分和特征，该组分和特征可与任何其他一些实施方案的特征 分离或组合，而不脱离本发明的范围和精神。任何列举的方法可按所列举的事件的顺序或 以逻辑可行的任何其他顺序进行。
[0082] 方法
[0083] 如上文所概括，提供了提高细胞中I型干扰素（IFN)的产生（例如在体外或体内） 的方法。提高I型干扰素的产生是指，与对照相比，主题方法提高了细胞中I型干扰素的产 生。该提高的量级可变化，并且在一些例子中为，与合适的对照相比，2倍或更大，例如5倍 或更大，包括10倍或更大。同样，在一些例子中，所述方法是与合适的对照相比，将细胞中I 型干扰素的产生提高2倍或更大的量级，例如5倍或更大，包括10倍或更大。在实施所述 方法之前检测不到干扰素的产生的一些实施方案中，该提高可导致可检测的量的干扰素产 生。可通过使用任何合适的方法来测量干扰素产生，包括但不限于，水疱性口炎病毒（VSV) 激发生物测定、酶联免疫吸附测定（ELISA)、基于复制子的生物测定或通过使用在I型干扰 素信号通路的调控下克隆的报告基因（例如，荧光素酶）。参见例如Meager J. Immunol. Methods 261:21-36(2002) ;Vrolijk 等 C.J.Virol.Methods 110:201-209(2003);和 Francois 等 Antimicrob Agents Chemother 49 (9):3770-3775 (2005)〇
[0084] 所述方法可用于提高任何I型干扰素的产生，包含但不限于：IFN_a、IFN-β、 IFN- κ、IFN- δ、IFN- ε、IFN- τ、IFN-ω 和 IFN- ζ (也称为限制素，limtin)。在一些实 施方案中，所述方法是用来提高IFN-a的产生。在一些实施方案中，所述方法是用来提高 IFN- β 〇
[0085] 所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素的方式提高所述细胞 中的包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。提高包含2' -5'磷酸二酯键的环 状二核苷酸是指，与对照相比，主题方法提高了包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸 的量。如在下面的实验部分中示出，包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸可提高I型 干扰素产生的水平。该提高的量级可变化，并且在一些例子中为，与合适的对照相比，2倍或 更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50 倍或100倍。
[0086] 可使用多种不同的方法来实现提高包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的 水平。在一些例子中，所述方法包括提供具有提高靶细胞中包含2' -5'磷酸二酯键的环 状二核苷酸水平的环状二核苷酸活性剂的靶细胞。环状二核苷酸活性剂可变化，并包括但 不限于：小分子、核酸、蛋白质和肽试剂。
[0087] 在一些实施方案中，与没有与所述环状二核苷酸活性剂接触的对照相比，所述 环状二核苷酸活性剂提高细胞或受试者中的IFN-a、IFN-β、IFN-K、IFN-δ、IFN- ε、 IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ (也称为限制素，limtin)。在一些这样的实施方案中，所述提高 为1. 5倍提高至50倍提高或更高，包括2倍提高至45倍提高、5倍提高至40倍提高、10倍 提高至35倍提高、15倍提高至30倍提高、20倍提高至30倍提高等。
[0088] 在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核 苷酸或其功能类似物。包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸包括但不限于本文描述的 那些包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
[0089] 本文所用的"环状二核苷酸"是指包含两个核酸的化合物（即，第一核苷酸和第 二核苷酸），其中每个核苷酸的2'碳或3'碳通过磷酸二酯键与另一核苷酸的5'碳连 接。因此，包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸是指这样的环状二核苷酸，其中至少第 一核苷酸或第二核苷酸的2'碳与另一核苷酸的5'碳连接。下文中更详细地描述了包含 2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
[0090] 包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的功能类似物是表现出相似的功能活 性（例如，提高I型IFN的产生）的那些化合物，并且可具有与包含2' -5'磷酸二酯键的 环状二核苷酸相似的结构。在一些例子中，所述功能类似物是小分子试剂。所关注的天然 存在的或合成的小分子化合物包括许多化学种类，例如有机分子，包括具有大于50道尔顿 并且小于约2, 500道尔顿的分子量的小有机