AGG ACG) (SEQ ID NO: 22)和 mcGAS rev Xho (5, -ATC CTC GAG TCA AAG CTT GTC AAA AAT TGG AAA CC) (SEQ ID NO: 23)从上文描述的小鼠 cDNA克隆扩增全长mcGAS，并使用Sail和 XhoI将其克隆至pET28a-H6SUM0中，以制成表达与N端His6 SUMO标签融合的全长mcGAS 的 pET28a-H6SUM0-mcGAS。
[0248] E.蛋白质纯化
[0249] WspR构建体（pQE-WspR*)是来自Steve Lory (Harvard)的慷慨的礼物。如以前 的描述（Merighi等，Mol Microbiol (2007)65:876)进行WspR纯化和环状二GMP合成反 应。DncV和突变体DncV的过表达株和质粒由J. Mekalanos提供。如以前的描述（Davies 等）过表达和纯化DncV蛋白。简略而言，在对数中期，以ImM IPTG于37°C下诱导DncV蛋 白产生3小时。裂解细胞，并在变性的条件下纯化DncV蛋白。将澄清的裂解物与Ni-NTA 孵育，并在尿素洗脱缓冲剂（2M尿素 ，IOmM Tris pH = 8· 0,150mM NaCl，250mM咪唑）中洗 脱。将洗脱的蛋白质透析至 25mM Tris-Cl，pH= 7.5,300mM NaCl，5mM Mg(0Ac)2，10% 甘 油，2mM DTT。通过用0.5mM IPTG在18°C下诱导过夜，在Rosetta(DE3)pLysS细胞中表达 H6SUM0-mcGAS。用 French Press 将细胞裂解至 50mM Tris-Cl，pH = 8,300mM NaCl，20mM 咪唑，5mM BME和0. 2mM PMSF中。用Ni-NTA孵育澄清的裂解物，并用20mM Tris-Cl，pH = 7. 4,150mM NaCl，300mM咪唑洗脱结合的蛋白质。将洗脱物透析至20mM Tris-Cl，pH = 7. 4， 150mM NaCl，5mMf3-巯基乙醇以及10%甘油。将蛋白质迅速冷冻，并储存于-80°C。
[0250] F. cGAS产物纯化和结构表征
[0251] 使用反相HPLC在配备有Agilent Polaris C18-A柱（5ym，250mmX10mm，1瀬 A) 的Agilent 1260Infinity HPLC上纯化cGAS产物。纯化条件包括于50°C和5mL/分钟的流 量下在20分钟内，100 %至0 %梯度的溶剂A，其中溶剂A是IOOmM在水中的乙酸铵并且溶剂 B是乙腈。将纯化的洗脱级分蒸发多次，以除去过量的氨。使用COSYjH-13C HSQC、N0ESY、 1H-13C HMBC 和1H-31P HMBC 来完成共振分配。cGAS 产物的表征：? NMR(900MHz, D20,50°C， δ ) ： 8. 44 (1H, s), 8. 42 (1H, s), 8. 03 (1H, s), 6. 31 (1H, s), 6. 09 (1H, J = 8Hz, d), 5. 75 (1H, m), 5. 18 (1H, m), 4. 93 (1H, s), 4. 74, 4. 62, 4. 59 (1H, J = 12Hz, d), 4. 55 (1H, s), 4. 38 (1H, m), 4. 3 3(1H, J= 12Hz, d), 4. 28(1H, J= 12Hz, d) JlPi1H解偶联}NMR(600MHz，D20, 5(TC，δ ):(所 有共振都是单峰）-0.96,-1.86 ;HRMS(m/z) : [1-!1]-(：2。!^1。01芯的单一同位素质量计算 值为673. 0927 ;实测值为673. 0909. [M+Na2H]-C2QH24N1Q013P 2的单一同位素质量计算值为 695. 0752 ;实测值为 695. 0728。
[0252] G.荧光素酶测宙
[0253] 以0. 5%° 106%细胞％ ml-1将HEK293T细胞涂布于TC处理的96孔板上。 第二天，用所指定的构建体与IFN- β -萤火虫荧光素酶和TK海肾属荧光素酶报告子构建体 一起转染细胞。在用所指定的配体刺激6%小时后，在被动裂解缓冲剂在25°C下裂解细胞 5%分钟。用萤火虫荧光素酶底物（Biosynth)和海肾属荧光素酶底物腔肠素（Biotium)孵 育细胞裂解物，并在SpectraMax L微板读数器（Molecular Devices)上测量发光。将相对 Ifnb表达计算为相对于海肾属发光的萤火虫发光。
[0254] H.体外环状二核苷酸合成
[0255] 体外 DncV 反应在 20mM Tris-Cl，pH = 8,20Mg(0Ac)2，10 % 甘油和 ImM DTT， O.lmg/mL BSA中进行。如图所示，反应物包含250 μ M GTP，250 μ M ATP或125 μ M GTP和 125μΜ ATP。此外，在指定的情况下将 33nMa32P-GTP(3000Ci/mmol，Perkin-Elmer)或 33nMa 32P-ATP(3000Ci/mmol，Perkin-Elmer)并入反应中。通过添加 1 μΜ 纯化的 DncV 蛋 白来起始反应。体外 cGAS 反应在 40mM Tris-Cl，pH = 7. 5, IOOmM NaCl，IOmM MgC12 中进 行。冷核苷酸和α标记的GTP的浓度与DncV反应中相同。通过添加200nM纯化的cGAS 起始反应。在指定的情况下，以0. lmg/mL的终浓度将鲱鱼睾丸DNA (Sigma)添加至反应物。 WspR反应如以前的描述（14)进行。将反应物在37°C下孵育1小时，在95°C下煮沸5分钟， 并在13, OOOrpm下旋转10分钟。移除反应物，并以1:5与TLC运行缓冲剂（1:1.5 (v/v)饱 和的NH4S04和I. 5M KH2P04，pH 3. 6)混合，并在PEI纤维素 TLC板（Sigma)进行点样。在 溶剂迀移后，使TLC板暴露于磷屏成像仪，并使用Typhoon扫描仪成像。对于体外产物转染 至293T细胞中，按比例放大反应，去掉放射性标记的核苷酸，并将ATP和GTP的浓度提高至 2mM〇
[0256] I.核酸酶消耗
[0257] 来自橘青霉（Penicillium citrinum)核酸酶Pl和来自菱背响尾蛇（Crotalus adamanteus)的蛇毒磷酸二酯酶I购自Sigma。将来自用a 32P-GTP标记的体外环状二核苷 酸合成的反应以1:5稀释于Pl缓冲剂（40mM Tris-Cl，pH = 6,2mM ZnC12)中或SVTO缓冲 剂（40mM Tris-Cl，pH = 8, IOmM MgC12)中，然后分别用2. 5mU的核酸酶Pl或SVPD消化。 消化物于37°C下孵育45分钟，并通过TLC解析核苷酸产品。
[0258] L NMR 数据
[0259] 在图6C中示出了1H-31P HMBC谱中，磷核P-Il与鸟苷的W核糖质子（H-12)以及 腺苷的Y核糖亚甲基质子（H-10)和V核糖质子（H-9)相关。另一个磷核（P-22)与腺 苷的：V核糖质子（H-8)以及鸟苷的Y核糖亚甲基质子（H-21)和V核糖质子（H-20)相 关。因此，磷酸二酯键的区域化学被确定为环状[G(2' -5' )pA(3' -5' )p]。为了指定 上述峰，精确鉴定分别与鸟苷和腺苷相应的核糖自旋系统是十分重要的。基于用于单个核 碱基的参照谱1H-13C HMBC和1H-13C HSQC NMR分配与腺嘌呤核碱基（H-2，H-5)和鸟嘌呤 核碱基（H-17)相关的质子（图7A和7B)。1H-1H NOESY实验示出了腺嘌呤质子H-5与:V 核糖质子（H-8)之间的通过-空间的相互作用以及鸟嘌呤质子H-17与1'核糖质子（H-18) 之间的通过-空间的相互作用（图7D)。通过1H-1H COSY (图7C)和多重性编辑的1H-13C HSQC(其特别地区分Y亚甲基质子（H-10和H-21))(图7A和7B)鉴定了相应核糖自旋系 统中剩余的质子。
[0260] K. RNA、cDNA 合成和宙量 RT-PCR
[0261] 使用 Trizol 试剂（Invitrogen)或 RNeasy Mini 试剂盒（Qiagen)提取哺乳 动物细胞系的RNA。用不含RQlRNA酶的DNA酶（Promega)处理RNA。用Superscript III(Invitrogen)反转录RNA。相对于以前描述的小鼠 rpsl7(Woodward等），对小鼠 ifnB 进行定量。相对于以前描述的人S9 (Wu等），对人ifnB进行定量。
[0262] 尽管具有所附的条目，本公开还由以下条目定义：
[0263] 1. 一种用于提高细胞中I型干扰素（IFN)的产生的方法，所述方法包括：
[0264] 以足以提高所述细胞产生所述I型干扰素（IFN)的方式提高所述细胞中的包含 2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。
[0265] 2.如条款1所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接 触。
[0266] 3.如条款2所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2' -5'磷酸二酯键。
[0267] 4.如条款3所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2' 5'磷酸二酯键和 3' -5'磷酸二酯键。
[0268] 5.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
[0269] 6.如条款5所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
[0270] 7.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
[0271] 8.如条款7所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
[0272] 9.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
[0273] 10.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0275] 其中X和Y分别是：
[0277] 11.如条款10所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0279] 12.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0280]
[0281] 其中X和Y分别是：
[0283] 13.如条款1所述的方法，其中通过提高所述细胞中的cGAMP合酶（cGAS)的活性 来提高所述环状二核苷酸的水平。
[0284] 14.如条款13所述的方法，其中通过增强编码cGAS的核酸的表达来提高所述 cGAS的活性。
[0285] 15.如条款13所述的方法，其中通过将编码cGAS的核酸引入所述细胞中来提高所 述cGAS的活性。
[0286] 16.如条款1所述的方法，其中所述IFN是干扰素 α。
[0287] 17.如条款1所述的方法，其中所述IFN是干扰素 β。
[0288] 18.如条款1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
[0289] 19.如条款18所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
[0290] 20.如条款1所述的方法，其中所述细胞在体外。
[0291] 21.如条款1所述的方法，其中所述细胞在体内。
[0292] 22. -种用于提高受试者中I型干扰素（IFN)的产生的方法，所述方法包括：
[0293] 将有效提高所述受试者中I型干扰素的产生的量的包含2'_5'磷酸二酯键的环状 二核苷酸活性剂施用至所述受试者。
[0294] 23.如条款22所述的方法，其中所述包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性 剂包含包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
[0295] 24.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2' -5'磷酸二酯键。
[0296] 25.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5' 憐Ife^?醋键。
[0297] 26.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
[0298] 27.如条款26所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
[0299] 28.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
[0300] 29.如条款28所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
[0301] 30.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷 酸。
[0302] 31.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0304] 其中X和Y分别是：
[0306] 32.如条款31所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0307]
[0308] 33.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0310] 其中X和Y分别是：
[0312] 34.如条款22所述的方法，其中所述包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性 剂是提高cGAMP合酶（cGAS)的细胞活性的药剂。
[0313] 35.如条款34所述的方法，其中所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。
[0314] 36.如条款22所述的方法，其中所述IFN是干扰素 α。
[0315] 37.如条款22所述的方法，其中所述IFN是干扰素 β。
[0316] 38.如条款22所述的方法，其中所述受试者患有病毒性感染。
[0317] 39.如条款22所述的方法，其中所述受试者患有细菌性感染。
[0318] 40.如条款22所述的方法，其中所述受试者患有肿瘤性疾病。
[0319] 41.如条款22所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[0320] 42.如条款41所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0321] 43. -种环状二核苷酸，其包含2' -5'磷酸二酯键。
[0322] 44.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个2' -5'磷酸 -?酯键。
[0323] 45.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含2' -5'磷酸二酯 键和3' -5'磷酸二酯键。
[0324] 46.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
[0325] 47.如条款46所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷 酸。
[0326] 48.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
[0327] 49.如条款48所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷 酸。
[0328] 50.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟 苷核苷酸。
[0329] 51.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0331 ] 其中X和Y分别是：
[0332]
[0333] 52.如条款51所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0335] 53.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0337] 其中X和Y分别是：
[0338]
[0339] 54. -种组合物，其包含包含2' -5'磷酸二酯键的环状二核苷酸和药学上可接受 的载体。
[0340] 55.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含两个2'_5'磷酸二酯键。
[0341] 56.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸还包含2' -5'磷酸二酯键和 3' -5'磷酸二酯键。
[0342] 57.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
[0343] 58.如条款57所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
[0344] 59.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
[0345] 60.如条款59所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
[0346] 61.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷 酸。
[0347] 62.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0349] 其中X和Y分别是：
[0350]
[0351] 63.如条款62所述的组合物，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0353] 64.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0355] 其中X和Y分别是：
[0356]
[0357] 65. -种用于提高受试者中干扰素基因（STING)介导的应答的刺激物的方法，所 述方法包括：
[0358] 将有效提高所述受试者中STING介导的应答的量的STING活性剂施用至所述受试 者。
[0359] 66.如条款65所述的方法，其中所述STING活性剂包含包含2' -5'磷酸二酯键的 环状二核苷酸。
[0360] 67.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2' -5'磷酸二酯键。
[0361] 68.如条款67所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5' 憐Ife^?醋键。
[0362] 69.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
[0363] 70.如条款69所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
[0364] 71.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
[0365] 72.如条款71所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
[0366] 73.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷 酸。
[0367] 74.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0369] 其中X和Y分别是：
[0370]
[0371] 75.如条款74所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0373] 76.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
[0375] 其中X和Y分别是：
[0376]
[0377] 77.如条款65所述的方法，其中所述STING活性剂包含提高cGAMP合酶（cGAS)的 细胞活性的药剂。
[0378] 78.如条款77所述的方法，其中所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。
[0379] 79.如条款65所述的方法，其中所述STING活性剂包含提高干扰素基因（STING) 的刺激物的细胞活性的药剂。
[0380] 80.如条款77所述的方法，其中所述药剂包含编码所述STING的核酸。
[0381] 81.如条款65所述的方法，其中所述STING介导的应答是对具有两个3' -5'磷酸 二酯键的环状二核苷酸无应答性。
[0382] 82.如条款65所述的方法，其中所述受试者患有病毒性感染。
[0383] 83.如条款65所述的方法，其中所述受试者患有细菌性感染。
[0384] 84.如条款65所述的方法，其中所述受试者患有肿瘤性疾病。
[0385] 85.如条款65所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[0386] 86.如条款85所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0387] 前述内容仅仅是对本发明的原理的举例说明。应理解，本领域技术人员将能够设 计出多种布置，尽管这些布置没有在本文中确切地描述或示出，但是体现了本发明的原理， 并且落在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有例子和条件性语句都主要旨在帮 助理解本发明的原理以及由发明人为深化本领域而贡献的概念，并且应将这样的具体列举 的例子和条件解释为非限制性的。此外，本文的陈述本发明的原理、方面和实施方案及其特 定例子的所有描述都旨在涵盖其结构等同物和功能等同物二者。此外，预期这样的等同物 包括当前已知的等同物和未来开发的等同物二者，即，所开发的执行相同功能的任何元件， 无论其结构如何。因此，不旨在将本发明的范围限制于本文示出和描述的示例性实施方案 中。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
[0388] 本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，就如特别和单独 地指定每个独立的出版物或专利申请通过引用并入一样。对任何出版物的引用都是针对其 在提交日期之前的公开内容，并且其不应解释为承认由于在先发明而使本发明不享有先于 该出版物的权利。
【主权项】
1. 一种用于提高细胞中I型干扰素（IFN)的产生的方法，所述方法包括： 以足以提高所述细胞产生所述I型干扰素（IFN)的方式提高所述细胞中的包含2' -5' 磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接 触。3. 如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2' -5'磷酸二酯键。4. 如权利要求3所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2'5'磷酸二酯键和3'-5'磷 酸二酯键。5. 如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。6. 如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。7. 如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。8. 如权利要求1所述的方法，其中通过提高所述细胞中的cGAMP合酶（cGAS)的活性来 提高所述环状二核苷酸的水平。9. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IFN是干扰素α或干扰素β。10. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。11. 如权利要求10所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。12. -种环状二核苷酸，其包含2'-5'磷酸二酯键。13. 如权利要求12所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个2' -5'磷酸 -?酯键。14. 如权利要求13所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含2' -5'磷酸二酯 键和3'-5'磷酸二酯键。15. 如前述权利要求中任一项所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷 核苷酸和腺苷核苷酸中的至少一种。
【专利摘要】本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素(IFN)的产生的方法和组合物。所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2ˊ-5ˊ磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该方法的实施方案的组合物和药剂盒。
【IPC分类】C07H19/00, C07K14/555, C12P21/00
【公开号】CN105377867
【申请号】CN201480025096
【发明人】拉塞尔·E.·万斯, 明·C.·哈蒙德, 达拉·伯德特, 埃利·J.·迪纳, 斯蒂芬·C.·威尔逊
【申请人】加利福尼亚大学董事会
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年5月2日
【公告号】EP2992000A1, US20140329889, WO2014179760A1