二醇（"PEG化"）至双层来修饰脂质体以使它们的表面更亲水，从而提高它们 在血流中的循环时间。这些被称为"潜伏"脂质体，并且特别可用作用于亲水性（水溶性） 分子（例如所述环状二核苷酸活性剂）的载剂。
[0211] 在某些实施方案中，由生物可降解材料例如聚（乳酸）、聚（γ-谷氨酸）、聚（羟 基乙酸）、聚乳酸-Co-羟基乙酸制成纳米颗粒或微颗粒。可使用聚乙烯亚胺或藻酸微颗粒 以及阳离子微颗粒（包括树状聚物（dedrimer)，例如环糊精）作为环状二核苷酸或STING 活性剂的递送载剂，以促进细胞摄入。参见例如，美国专利号8187571，Krishnamachari等 Adv Drug Deliv Rev 2009 61:205，Garzon等，2005 Vaccine 23:1384,通过引用并入本文。
[0212] 在另一个实施方案中，可使用光化学内化来增强环状二核苷酸或STING活性剂的 胞浆摄入。参见例如，美国申请号20120226217,通过引用并入本文。在这样的实施方案中， 可将所述环状二核苷酸或STING活性剂与光敏化试剂共施用。然后，将靶细胞暴露于特定 波长的光，触发所述环状二核苷酸或STING活性剂的内化。
[0213] 在某些实施方案中，用于递送所述环状二核苷酸或STING活性剂的递送媒介物还 可为革G向递送媒介物，例如，包含处于脂质体表面上的一种或多种革El向部分或生物分布修 饰剂的脂质体。靶向部分可为能够与期望的标靶特异性结合或相互作用的任何试剂。
[0214] 所述特异性结合剂可为特异性结合所靶向的蛋白质、肽、生物大分子、细胞、组织 等（例如，其中所述环状二核苷酸或STING活性剂发挥其期望的影响的蛋白质肽、生物大分 子、细胞、组织等）的任何分子。根据靶位点的性质，所述特异性结合剂可为但是限于，针对 肽分析物的表位的抗体，或任何识别分子，例如特异性结合对的成员。例如，合适的特异性 结合对包括但不限于：受体/配体对成员；受体的配体-结合部分；抗体/抗原对的成员； 抗体的抗原结合片段；半抗原；凝集素/碳水化合物对的成员；酶/底物对的成员；生物素 /抗生物素蛋白；生物素/链霉亲和素；地高辛/抗地高辛；肽适体结合对的成员；等。
[0215] 在某些实施方案中，所述特异性结合部分包括抗体。如此处定义的抗体可包括保 留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源 化抗体、单链抗体，和包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白质，以及非抗体蛋白质。所述抗 体还可包括Fab'、Fv、F(ab' )2，和/或保留对抗原的特异性结合的其他抗体片段。
[0216] 在某些实施方案中，所述靶向部分是与肿瘤细胞或免疫细胞上表达的分子（例 如，⑶4、⑶8、⑶69、⑶62L等）特异性相互作用的粘结剂，以使将包含所述环状二核苷酸或 STING活性剂的靶向递送媒介物递送至肿瘤位点或特定的免疫细胞。
[0217] 在期望的情况下，可有利地使用上文所列的递送媒介物的任何组合，以所述增强 环状二核苷酸或STING活性剂至靶细胞的递送。
[0218] 所述药物组合物的组分可分开提供或在单元剂型（例如作为冻干粉末或不含水 的浓缩物）中混合一起。在通过输注施用所述组合物的情况下，可使用装有无菌药物级水 或盐水的输注瓶来分散所述组合物。在通过注射来施用组合物的情况下，可提供一安瓿的 注射用无菌水或盐水，从而可在施用前混合成分。
[0219] 在一些实施方案中，将所述药物组合物提供为干燥无菌的冻干粉末，其能够重构 至合适的浓度以用于施用至受试者。在一些实施方案中，所述药物组合物提供为不含水的 浓缩物。在一些实施方案中，所述药物组合物提供为以下单位剂量的干燥无菌冻干粉末： 至少0· 5mg、至少lmg、至少2mg、至少3mg、至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少 30mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少60mg或至少75mg。
[0220] 用于可重构递送系统的溶液剂、混悬剂和粉剂包含媒介物，例如，助悬剂（例如， 树胶、黄原胶、纤维素和糖）、湿润剂（例如，山梨醇）、增溶剂（例如，乙醇、水、PEG和丙二 醇）、表面活性剂（例如，月桂基硫酸钠、司班（Span)、吐温和十六烷基吡啶）、保存剂和抗氧 化剂（例如，对羟基苯甲酸酯、维生素 E和C，以及抗坏血酸）、防裂剂、涂层剂和螯合剂（例 如，EDTA)。
[0221] 在一些实施方案中，所述药物组合物配制为盐形式。药学上可接受的盐包括与阴 离子形成的盐，例如衍生自氯化氢、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的 盐，例如衍生自钠、钾、铵、妈、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡 因等的盐。
[0222] 在某些实施方案中，所述药物组合物包含任何本文提供的环状二核苷酸或STING 活性剂的前药衍生物。随后这样的前药可在被施用所述药物组合物的受试者的身体中转化 成环状二核苷酸或STING活性剂的活性形式。
[0223] 药剂盒
[0224] 提供了具有例如呈经口剂量或可注射剂量的单元剂量的所述主题环状二核苷酸 活性剂（例如一种或多种环状二核苷酸）的单元剂量。在所述主题药剂盒中，如可方便的 或期望的，一种或多种组分存在于同一容器或不同容器。
[0225] 除了含有单元剂量的容器外，还将存在描述所述环状二核苷酸在治疗所关注的病 理学病况中的用途和伴随的益处的说明。可以以多种不同格式来提供说明。在某些实施方 案中，所述说明可为用于实施主题方法的完整方案，或用于得到所述方案的工具（例如，将 用户引导至提供说明的网页的网站URL)，其中可将这些说明印刷于基材上，其中所述基材 可为以下中的一种或多种：包装插入物、包装物、试剂容器等。
[0226] 以下实施例的陈述是为了为本领域普通技术人员提供如何实现和使用本发明的 完全的公开内容以及描述，而不是意图限制发明人所认定的发明范围，也不是意图表示以 下的实验是所进行的所有实验或仅有的实验。已经做出了努力以确保关于所用数字（例 如，量、温度等）的精确性，但是应当考虑一些实验误差和偏离。除非另有指明，否则份是重 量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度计的，并且压力为大气压或近似大气压。
[0227] 实验
[0228] I.结果和讨论
[0229] 识别来源于病原体的核酸是哺乳动物中起始先天免疫应答的主要机制（Barbalat 等，Annu Rev Immunol (2011) 29:185)。已经描述了一些编码核酸传感器的种系家族，包括 toll 样受体（TLR)和 RIG-I 样受体（RLR) (Palm 等，Immunol Rev(2009)227:221 Jakeuchi 等Cell (2010) 140:805)。在结合核酸后，这些传感器起始信号转导级联反应，导致产生细胞 因子和提供宿主防御的其他免疫效应蛋白。
[0230] 外源双链（ds)DNA的胞浆存在触发通过产生I型干扰素（IFN)来控制的强效抗 病毒应答（Ishii 等，Nat. Immunol. (2006) 7:40 ;Stetson 等，Immunity (2006) 24:93)。但 是，将dsDNA与干扰素产生连接的分子机制尚未良好表征（Burdette&Vance, Nat. Immunol. (2013)14:19)。宿主蛋白质STING被鉴定，并且示出为对胞浆dsDNA的IFN应答所需（Is hikawa&Barber, Nature(2008)455:674 ;Ishikawa 等，Nature(2009)461:788 ;Sun 等，Proc Natl Acad Sci U S A(2009) 106:8653;和 Zhong 等，Immunity (2008) 29:538)。STING 还 示出为对称为环状二核苷酸（CDN)的细菌衍生的第二信使的干扰素应答所需（Jin等，J Immunol (2011) 187:2595;和 Sauer 等，Infect Immun(2011)79:688)。CDN 被某些细菌病 原体分泌或释放至胞衆中（Woodward等，Science (2010) 328:1703)并直接与STING结合 (Burdette 等，Nature (2011)478:515)。但是，有趣的是，小鼠 STING 的突变体（R231A)等 位基因被鉴定为去除了对CDN的应答性，但是没有明显影响干扰素对胞浆DNA(Id)的应答。 相比之下，表达野生型小鼠 STING的293T细胞对⑶N有应答性，但是对dsDNA没有。因此， 虽然IFN对胞浆⑶N和dsDNA二者的应答都需要STING，但是对这些化学不同的配体的应答 可为在基因上非偶联的。
[0231] 基于两个研究（Sun 等，Science (2013) 339:786 ;和 Wu 等，Science (2013) 339:826 )，提出dsDNA的胞浆存在导致通过被称为cGAMP合酶（cGAS)的DNA依赖性传感器产生⑶N 环状GMP-AMP(cGAMP)。cGAMP示出结合并活化STING。但是，尽管缺乏对CDN的反应性， STING R231A突变体如何仍然起始对dsDNA的应答，这尚不清楚。因此，对cGAS活化STING 的机制进行研究。
[0232] 以前的研究（Sauer等，Burdette等）主要集中于小鼠 STING，并且不清楚人STING 是否可应答 CDN(Conlon 等，J Immunol, (2013) 190:5216)。如以前所报道的（Sun 等，Wu 等），发现，人THP-I细胞系以依赖于STING的方式强力地应答⑶N (图1A、B)。从THP-I细 胞克隆hSTING，并将hSTING的氨基酸序列与以前广泛研究的参照等位基因（NP_938023. 1， 这里称为hSTINGREF) (7)进行比较（图2)。发现，hSTINGREF和hSTING?P 1在四个氨基酸位置 上有差异。显然，hSTINGREF编码氨基酸位置232上的组氨酸（H)，而hSTING? P1编码该位置 上的精氨酸（R)，对应于mSTING中的对⑶N的应答性十分重要的R231。因此，通过在没有内 源STING的293T细胞中表达这些等位基因来测试hSTING等位基因的功能（Burdette等）。 如以前观察到的（Burdette等），mSTING在293T细胞中的过表达足以诱导不依赖于配体的 IFN-荧光素酶报告子构建体的活化；但是用更低量的mSTING对293T细胞的转染使细胞对 ⑶N有应答性。类似地，表达hSTING? P 1的293T细胞对⑶N刺激有应答性。相比之下，表达 hSTINGREF的细胞应答性差或无应答性（图1C)。有趣的是，观察到，结合环状二GMP的STING 的三种最新晶体结构是应答性差的hSTINGREF蛋白（Huang等，似丨证6 3廿11(^.&1〇1.81〇1· (2012) 19:728 ;Ouyang 等，Immunity (2012) 36:1073 ;Yin 等，Mol Cell (2012) 46:735)〇
[0233] 293T细胞对dsDNA的刺激无应答性，可能是由缺乏cGAS(Sun等）的表达或可能 其他DNA传感器所致。因此，为了测试hSTING变体是否可应答DNA刺激，空STING( "金票 (goldenticket)"）（Sauer等），但（CGAS+)的巨噬细胞用hSTING表达载体转导。有趣的是， 即使对⑶N无应答性的hSTING REF变体亦赋予对dsDNA的应答性（图1D)。因此，hSTING REF 模拟小鼠 STING的R231A突变体的表型，如前文所述，该R231A突变体解偶联对CDN和dsDNA 的应答性（Burdette 等）。像mSTINGR231A变体一样，hSTINGREF仍然与 CDN结合（图 IE) (Huang 等，Ouyang等和Yin等），说明该等位基因在CDN结合的下游步骤处受损。
[0234] 与以上用hSTING等位基因的结果一致，mSTING的R231H突变体对⑶N具有差的 应答性，如hSTING?%^ R232A变体或R232H变体一样（图3A)。因此推断，精氨酸231/232 对针对小鼠/人STING中的⑶N的应答性十分重要。但是，在hSTING REF中引入H232R突变 不足以恢复对CDN的应答性；事实上，观察到还需要第二替换（G230A)(图4)。再次，测试 结合环状二GMP的所有变体STING等位基因在这样的事实上都一致，即，残基230和232定 位于覆盖但不形成⑶N结合袋的环中（图3B) (Burdette&Vance)。
[0235] 重要的是，mSTINGR231A?对化学合成的cGAMP无应答性（图IF) (Kellenberger等，J Am Chem Soc. (2013). 135:4906)。这产生的问题是，STING的R231A/R232H变体是否将对被 认为经cGAMP产生来活化STING的cGAS酶有应答性。发现，人或小鼠 cGAS表达足以强健地 活化hSTINGREF和mSTINGR231A变体，甚至在非常低的cGAS表达水平下亦如此（图5A)。针对 该结果考虑了一些解释。一种解释是，简单地由于哺乳动物细胞中的合酶的过表达所致；然 而，产生cGAMP的细菌酶（来自霍乱弧菌的DncV)的过表达（Davies, Cell (2012) 149:358) 不活化hSTINGREF或mSTING R231A，但是活化野生型mSTING和hSTING?P 1 (图5B)。一个可选 假说是，cGAS可能以物理的方式与STING相互作用，从而以独立于cGAMP产生的方式来活 化STING。然而，该解释似乎不对。如以前所示（Sun等），催化死亡的人或小鼠 cGAS的过 表达未能活化STING (GS>AA ;图2A)，表明cGAS信号转导取决于第二信使的产生而非取决于 与STING的直接物理相互作用。为了确认该解释，通过提供ATP、GTP和dsDNA至体外的重 组cGAS，以产生cGAS的酶促产物。作为阴性对照，从平行反应中去掉dsDNA(刺激cGAS活 性所需）。然后纯化所得的cGAS产物，并将其转染至表达STING变体的293T细胞中。与合 成的cGAMP不同，所述cGAS产物能够活化hSTING REF和mSTING R231A (图5C)。该实验排除了 其中cGAS通过直接的物理相互作用来活化hSTINGREF的模型。
[0236] 因此假设，cGAS的实际产物可能不是向以前提出的那样的典型⑶N(Sun等，Wu 等）。假设，cGAS可产生包含f -5 ^磷酸二酯键的新⑶N，其将能够刺激变体STING等位 基因。重要的是，这样的非典型CDN将具有与典型的:V -5'磷酸二酯连接的CDN -样的质 量，并且因此，这两个产物将也不容易通过已公布的对cGAS产物进行质谱分析来鉴别（Sun 等，Wu等）。为了测试该假设，将放射性标记的a 32P-GTP或a 32P-ATP提供至重组纯化的 cGAS或霍乱弧菌DncV，并通过薄层色谱来分析产物。如以前所报道的，如果仅提供ΑΤΡ，则 DncV产生一些环状二AMP，并且如果仅通过GTP则产生一些环状二GMP，但是当提供ATP和 GTP 二者时，优选制成 cGAMP(Davies等，Cell(2012) 149:358)。（图 6A)。有趣的是，cGAS 需要ATP底物和GTP底物二者，并且所得的产物明显与由DncV产生的任何典型的⑶N不同， 这表明，cGAS产生新的非典型⑶N (图6A)。
[0237] 通过特异性核酸酶消化来分析cGAS和DncV产物。cGAS产物将被核酸酶Pl部分 切割，该酶选择性地消化Y -5'磷酸二酯键，表明cGAS产物包含至少一个:V -5'磷酸 二酯键（图6B)。但是，与用切割2' -5'磷酸二酯键和3' -5'磷酸二酯键二者的蛇毒磷 酸二酯酶cGAS处理cGAS产物相比，核酸酶Pl消化是不完全的，因为它不导致生成GMP (图 3B)。这表明，所述cGAS产物包含W -5'磷酸二酯键。
[0238] 已经提出，CDN可用作疫苗佐剂或免疫治疗剂（Chen等，Vaccine (2010) 28:3080)。 已经在人临床试验中测试了合成的STING活化剂DMXAA作为新化疗剂。不幸的是，未发现 DMXAA在人中有用，这很可能是因为其不能刺激hSTING (Conlon等）。在该上下文中，我们 的结果是意义重大的，因为它们显示，非典型的W -5'连接的CDN充当多样的STING变体 的强效泛激动剂，所述变体包括对典型的CDN或DMXAA仅具有差应答性的那些变体。
[0239] II.材料与方法:
[0240] A.小鼠和细朐系
[0241] 使THP-I细胞在添加有10% FBS、青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI 1640 中生长。使HEK293T细胞在添加有10% FBS、青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM中生 长。将包装Gp2逆转录病毒的细胞系维持于添加有10% FBS、青霉素-链霉素和L-谷氨 酰胺的DMEM中。动物方案得到了加州大学实验动物管理和施用委员会（University of California, Berkeley Animal Care and Use Committee)的批准。
[0242] B. STING 敲除
[0243] 使用 pLKO. I (The RNAi Consortium)来实现人 STING (克隆 ID ΝΜ_198282· 1-901 slcl)的敲除。用于敲除人 STING 的序列是 5'-GCA GAG CTA TTT CCT TCC ACA(SEQ ID NO: 07)，其对应于 5'-CCG GGC AGA GCT ATT TCC TTC CAC ACT CGA GTG TGG AAG GAA ΑΤΑ GCT CTG CTT TTT G (SEQ ID NO:08)正向寡聚物和 5'-AAT TCA AAA AGC AGA GCT ATT TCC TTC CAC ACT CGA GTG TGG AAG GAA ATA GCT CTG C(SEQ ID NO:09)反向寡聚物。使寡聚 物退火，并克隆至AgeI和EcoRI消化的pLKO. I (Addgene)，通过逆转录病毒转导至THP-I细 胞中，以混杂shRNA对照构建体为平行。使用嘌呤霉素选择稳定的细胞系。用lyg/mL PM 分化THP-I细胞24小时。使细胞静止24小时，然后用所指定的配体重新刺激6小时。如 下文所述，通过qRT-PCR测量IFN诱导。
[0244] C.细朐刺激和试剂
[0245] 使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)刺激骨髓巨噬细胞和HEK293T细胞。除非 另有说明，否则如以前的描述（Burdette等）来制备环状二GMP、环状二AMP、polyI:C和牛 痕病毒70聚体DNA，并在相似的浓度下使用。仙台病毒购自Charles River Laboratories。 如以前的描述（Kellenberger等）来合成cGAMP。
[0246] D.克降、诱夺和质粒
[0247] 使用 5，hSTING HindIII (5' -ATCGAA GCT TCC ACC ATG CCC CAC TCC AGC CTG) (SEQ ID NO: 10)和 3，hSTING NotI (5' -ATC GGC GGC CGC TCA GGC ATA GTC AGG CAC GTC ATA AGG ATA AGA GAA ATC CGT GCG GAG AG) (SEQ ID NO: 11)从 cDNA 扩增 THP-I STING 等位基因。使用Hindlll/Notl消化，将所导致的PCR产物克隆至p⑶NA3中。使用上述的 3' 引物和 5' hSTING XhoI (5' -ATC GCT CGA GCC ACC ATG CCC CAC TCC AGC CTG) (SEQ ID N0:12)以及Xhol/Notl消化，来扩增THP-I STING并克隆至MSCV2. 2中。如以前的描 述（Burdette等）使用IFN-荧光素酶、TK-海肾属和小鼠 STING质粒。使用Quikchange 定点诱变试剂盒（Stratagene)将突变引入人STING。从Open Biosystems和对应于之前 描述的那些（Sun等，Wu等）得到与小鼠 cGAS和人cGAS对应的cDNA克隆（MGC全测序人 MB21DlcDNA，登录号：BC108714. 1，克隆 ID :6015929 ;EST全测序小鼠 E330016A19Rik cDNA， 登录号：BC145653.1，克隆 ID:40130956)。用正向寡聚物 5' -mcGAS-KpnI(5' -ATCGGG TAC CCC ACC ATG GAT TAC MG GAT GAC GAT GAC MG GAA GAT CCG CGT AGA AGG) (SEQ ID NO: 13)和反向寡聚物 3' -mcGAS-Notl (5' -ATC GGC GGC CGC TCA AAG CTT GTC AAA AAT TGG) (SEQ ID NO: 14)从具有N端flag标签的cDNA克隆扩增小鼠 cGAS。类似地，用正向寡 聚物 5' -hcGAS-flag-KpnUS' -ATC GGG TAC CCC ACC ATG GAT TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG CAG CCT TGG CAC GGA AAG G) (SEQ ID NO: 15)和反向 3' -hcGAS-Notl (5, ATC GGC GGC CGC TCA AAA TTC ATC AAA AAC TGG AAA C) (SEQ ID NO: 16)扩增 hcGAS。将这 两种PCR产物都克隆至pcDNA3中的KpnI和NotI限制性内切酶位点处。使用DncV fwd BamHI (5, -GCA TGG ATC CGC CAC CAT GAC TTG GAA CTT TCA CCA G) (SEQ ID NO: 17)和 DncV rev NotI(5'-GCA TGC GGC CGC TCA GCC ACT TAC CAT TGT GCT GC)(SEQ ID NO:18) 扩增DncV，并使用BamHI和NotI将其克隆至pCDNA3中。为了克隆至MSCV2. 2中，使用DncV fwd XhoI(5, -GCA TCT CGA GCC ACC ATG ACT TGG AAC TTT CAC CAG) (SEQ ID NO:19)和 DncV rev NotI扩增DncV。将所得的DNA克隆至用Xhol/Notl消化的MSCV 2. 2中。按如下 构建用于细菌mcGAS过表达的构建体。使用His6SUM0 Nco(5'-TAA TAA GGA GAT ATA CCA TGG GCA GCA GCC) (SEQ ID NO :20)和 Hi s6 SUMO Sal (5, -GAA TTC GTC GAC ACC AAT CTG TTC TCT GTG AGC) (SEQ ID N0:21)从pCDF-Duet2 模板（来自 M. Rape lab, UC-Berkeley 的 礼物）通过PCR扩增N端His6-SUM0标签，并使用NcoI和Sail将其克隆至pET28a中，以 制成 pET28a-H6SUM0。使用 mcGAS fwd Sal (5' -GAT GTC GAC ATG GAA GAT CCG CGT AGA