专利名称：水稻osa-miR171a基因的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及水稻osa-miR171a基因的启动子MIR171aP的应用，利用此启动子可诱导基因组织特异性表达及改变所启动基因在干旱胁迫下的表达量。
背景技术：
miR171在拟南芥等植物中的相关研究很早就有报道，但是在水稻中的研究相对较
少。2002年David P. Bartel等从拟南芥幼苗和花中分别克隆了大量的小RNAs,Northern分析发现ath-miR171在花中表达量较高；2002年James C. Carrington等的研究发现，miR171在拟南芥、水稻和烟草的花中积累量相对比较高，而在叶和茎杆中表达量较少或不能被检测到；2005年Vincent L. Chiang等发现miR171在毛果杨莖杆中特异表达,可能参与了木质组织的形成，木质组织机械损伤胁迫导致ptr-miR171下降；miR171在小麦的各种组织中都有表达，特别是根中相对较高(孙其信，2007)；2009年薛红卫等对水稻miRNA做了表达谱分析，得出osa-miR171g/h在水稻根中选择性优先表达。可见miR171在不同植物的各个组织中表达量是有差异的。本发明启动子MIR171aP克隆自水稻第6染色体。结合⑶S染色及qRT_PCR结果可知，其主要在根、节及花药中表达，且对干旱胁迫有响应。
发明内容
本发明的目的在于提供OMnTtV/ia基因的启动子MIR171aP，该启动子主要在根、节及花药中表达，并且响应逆境胁迫。本发明从水稻中分离克隆了 osa-miR171a的上游调控区，并命名为启动子MIR171aP。从水稻中分离克隆了 osa_miR171a的上游调控区的启动子MIR171aP通过Plant-CARE (http://bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/) 分析可知，该启动子中存在多个抗逆相关的顺式作用元件，如ABRE (cis-acting elementinvolved in the abscisic acid responsiveness), MBS (MYB binding site involvedin drought-1nducibility),TCA-element (cis-acting element involved in salicylicacid responsiveness),TGACG-motif(cis-acting regulatory element involved in theMeJA-responsiveness),这些保守序列的存在预示着该启动子与植物的抗逆性存在密切关系。本发明采用的技术方案是，提供一种启动子MIR171aP，所述启动子MIR171aP序列表为下列之一
如 SEQ ID NO:1 所示；
或基本上相当于SEQ ID NO:1所示的90%同源的DNA序列；
或功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。
本发明还提供一种包含上述启动子MIR171aP的重组载体，其中，构建所述重组载选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体，所述表达的载体为Ti质粒或植物病毒载体。
本发明还提供一种包含启动子MIR171aP的转化体，其中，所述转化体的宿主为植物，所述植物为水稻。
本发明还提供一种包含上述启动子MIR171aP在水稻旱胁迫中的应用。其采用的操作步骤是a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、组织或器官；b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到响应干旱胁迫的转基因植物，本发明还提供一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP在驱动水稻基因特异表达中的应用，其中，所采用的操作步是a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、 组织或器官；b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因在特定的组织部位表达的转基因植株。
实现上述技术方案采用的方法是，采用已克隆的MIR171aP启动子为探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子片段或其同源序列。也可以采用PCR技术，从基因组中扩增得到本发明的MIR171aP启动子片段以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段 DNA。采用以上技术，可以分离得到包含MIR171aP启动子的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得在根、节及花药中特异表达且对逆境响应的转基因植株。
本发明的技术效果是本发明的MIR171aP启动子主要在根、节及花药中表达，因此以本发明MIR171aP启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可使其下游基因主要在根、节及花药中表达。
本发明的MIR171aP启动子可响应干旱，调节下游基因表达。因此以本发明 MIR171aP启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可使其下游基因在干旱胁迫下的表达发生变化。
本发明采用的技术方案可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法，及该启动子序列差异对此基因表达的影响。
由于水稻基因及其启动子对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。
图1水稻苗期MIR171aP启动子在干旱胁迫下对O1SanTtV77a基因启动表达分析； 图2为本发明水稻MIR171aP启动子在各组织器官对O1SanTtV77a基因启动表达分析； 图3为本发明水稻MIR171aP启动子驱动⑶S报告基因表达结果。
具体实施方式
下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1
水稻苗期MIR171aP启动子在干旱胁迫下对O1SanTtV77a基因启动表达分析1.选取材料
本实验以粳型旱稻品种IRAT109 (Oryza sativa L. ssp. Japonica,国外引进的旱稻品种，上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存)为基因表达量分析的实验材料。挑选饱满的IRAT109水稻种子，1%次氯酸钠消毒后，4°C条件下清水浸泡24小时。然后转入35-38°C环境里破胸20小时，待露白后置25-28°C环境下催芽至半粒谷长，胚根为谷粒长。选择Wagner’ s规格(1/5000 a)大小的塑料小桶,采用穴播的方式,每个小桶种16株。正常条件下生长至五叶一心时进行旱处理，分别在旱处理前、旱处理后3d、5d、7d、9d、11d和复水后Ih、3h、6h、12h、24h、48h取样。取样时，只选择倒数第二片叶片，用于总RNA的提取。 2. RNA提取与第一链cDNA合成
RNA的提取所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有ImlTRNzol-A+试剂(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加
0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min ;后于4°C,12000rpm离心IOmin后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100耵RNase-free ddH20溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。反转录之前需用DNaseI消化所提取样品，反应体系如下
权利要求
1.水稻OMnTtV/ia基因的启动子MIR171aP，其特征在于，所述启动子具有下列核苷酸序列之一 SEQ ID NO:1中所示的DNA序列； 与SEQ ID NO:1至少90%同源的DNA序列； 功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。
2.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，构建所述重组载选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于构建重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。
5.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP的转化体。
6.根据权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为植物。
7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述植物为水稻。
8.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP在水稻旱胁迫中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的操作步骤 a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、组织或器官，b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到响应干旱胁迫的转基因植物。
10.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP在驱动水稻基因特异表达中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用的操作步骤 a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、组织或器官，b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因在特定的组织部位表达的转基因植株。
全文摘要
本发明提供一种从水稻DNA片断中分离克隆的启动子MIR171aP，该启动子驱动osa-miR171a基因表达。启动子MIR171aP能响应干旱胁迫，与水稻抗旱性相关，该启动子主要在水稻根、节及花药中驱动基因表达，具有一定的组织特异性，本发明的水稻启动子可驱动基因组织特异性表达及改变所启动基因在干旱胁迫下的表达量。
文档编号C12N15/63GK102994505SQ20121055707
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者孔德艳, 刘灶长, 周立国, 秦剑英, 马瑞芳, 罗利军 申请人:上海市农业生物基因中心