专利名称：高产酸性糖苷水解酶的分枝杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体地涉及高产酸性糖苷水解酶的菌株。
背景技术：
在植物细胞壁中，纤维素和半纤维素是自然界中最丰富的可再生的生物质资源；其结构与组成十分复杂。但这一重要的可再生资源一直难以得到有效的利用。尤其在饲料行业，由于动物胃肠道处于酸性PH下，需要添加大量的微生物来源的酸性糖苷水解酶，例如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等复合酶进行饲料有效利用。嗜酸菌是一类极其重要的微生物，广泛分布在酸性矿山废水、含硫温泉和土壤中。其中，酸性矿山废水PH值通常在3以下，并含有高浓度的铁、铝、铜等重金属阳离子和硫酸根阴离子。嗜酸菌分泌的胞外酶往往是相应的嗜酸酶。多种嗜酸酶已经被分离纯化，如用于淀粉降解的嗜酸淀粉酶、嗜酸木聚糖酶、嗜酸甘露聚糖酶以及嗜酸纤维素酶。其在酸性条件下也具有较高活力，这些优良的酶学性质使其在饲料、能源工业等领域具有潜在的应用价值。嗜酸菌作为极端微生物的重要类群，在工业生产及人类生活中发挥着巨大的作用。但目前，对嗜酸菌的研究还十分有限，只对少数几种菌的生理生化和分子遗传学特征进行了研究，而对许多在自然界发挥着重要作用的嗜酸菌知之甚少。因此，还需要对嗜酸菌进行更为广泛深入的研究，以真正发挥其科学价值和应用价值。本发明从江西铀矿微生物浸铀尾液(PH2. 0-3. O)这一极端嗜酸环境中分离嗜酸菌株，并利用液体发酵的方法分析其产酶情况，结果发现分枝杆菌Mycobacterium sp. RBS-4产丰富的糖苷水解酶,其最适PH3. O - 4. O,在酸性和中性条件下具有很高的酶活力。为研究嗜酸菌的产酶特性及后期应用提供了良好的科研材 料。
发明内容
基于目前对嗜酸菌研究不足，本发明的目的是从特色的嗜酸环境江西铀矿微生物浸铀尾液中分离产酸性酶的菌株，从而研究嗜酸及产酶机制。本发明提供了高产酸性糖苷水解酶的菌株，该细菌菌株命名为分枝杆菌(Mycobacterium sp. ) RBS-4,于2012年4月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101 )，其保藏编号是CGMCC No. 5986。根据本发明的具体实施方式
，从江西铀矿微生物浸铀尾液分离产酸性糖苷水解酶菌株，其分离方法是取样品20mL，加入到80mL富集培养基(pH3. O)中30°C、160rpm振荡培养72h后，分别转接至LB培养基以同样的条件培养两代，平行重复3次。取富集培养物在YF固体培养基和BSYG固体培养基进行划线稀释，获得单菌落，多次重复划线稀释以获得纯培养，斜面保藏于4°C冰箱。本发明的再一目的是提供一种产酸性糖苷水解酶的液体发酵方法。
因此,本发明还提供了上述分枝杆菌Mycobacterium sp. RBS-4用于发酵制备酸性糖苷水解酶的应用。根据本发明的具体实施方式
，上述细菌在LB液体培养基(pH3. O)培养16h后获得新鲜种子液，再将种子液按照1%的接种量转入产酶培养基中，30°C，160rpm振荡培养72h后，离心取上清液，利用不同糖苷水解酶标准测定方法测定其酶活，并利用不同pH缓冲液测定酶的最适pH。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有对嗜酸环境微生物分离，提供一种产酸性酶的菌株。本发明的菌株最适pH为3. 0，其产酶在pH3. O 4. O都有较高的酶活性；可使其在需求酸性环境的工业生产上应用。
图1菌株RBS-4菌落及菌体形态；图2菌株RBS-4所产葡萄糖苷酶的最适pH ；图3菌株RBS-4所产a_半乳糖苷酶的最适pH ；图4菌株RBS-4所产β -半乳糖苷酶的最适pH ；图5菌株RBS-4所产甘露聚糖酶的最适pH。分枝杆菌(Mycobacterium sp. ) RBS-4,于2012年4月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编 号是CGMCC No. 5986。
具体实施方式
实施例1菌株分离YF 液体培养基(300mL) :8ml HBS (50 X)(基础盐溶液)；0· 08g yeast extract ；0. 12g Fructose ；292ml distilled water ；0.4ml trace elements solution ；pH3. 0 (H2SO4)。富集培养基(g/L): (NH4)2SO4 3.0，KCl 0. LK2HPO4 0· 5，MgSO4 ·7Η20 0. 5, Ca(NO3)2O. 01，FeSO4 · 7Η20 3. 0，葡萄糖 2，pH 值 2· O 2. 5。分离培养基(g/L)=(NH4)2SO4 2. O, KCl 0. 1，MgS04 · 7H20 O. 25，Ca (NO3) 2 0.01，葡萄糖1. 0，酵母提取物0. 1，pH值2. 5 3. O。LB培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水配制，pH值自然。取江西铀矿微生物浸铀的尾液20mL，加入到80mL富集培养基中30°C、160rpm振荡培养72h后，挑取单菌落分别转接至YF培养基以同样的条件培养两代，平行重复3次。取富集培养物在YF固体培养基进行划线稀释，获得单菌落，再在LB固体培养基多次重复划线稀释以获得纯培养。利用体视显微镜和相差显微镜观察分离到菌株的菌落形态和菌体形态。RBS-4单菌落分离于LB培养基，到2天时，可看见米粒大小的不规则白色菌落，周围有白色菌丝深入培养基，菌落不隆起，粗糙，在培养基盖有白色气生菌丝。在显微镜下观察，菌体呈现分枝状，延伸不明显(图1)。本发明的菌株最适pH为3.0，生长温度为30°C。经16SrDNA比对发现其属于分枝杆菌Mycobacterium,因此，将菌株RBS-4命名为分枝杆菌Mycobacteriumsp. RBS-4ο实施例2菌株液体发酵产酶分析发酵培养基(g/L)=(NH4)2SO4 2. O，K2HPO41. O, ；MgS04 · 7H20 0.5;麦麸豆渣=1:1(总量 1%)，ρΗ 3.0。DNS法具体方法如下在pH4. 0，50°C条件下，ImL的反应体系包括100 μ L适当的稀释酶液，90(^1^胶豆角，反应1011^11，加入1.51^ DNS终止反应，沸水煮5min。冷却至室温后于540nm测定OD值。I个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出I μ mol还
原糖的酶量。pNPG法底物对硝基苯β -D葡萄糖苷(pNPG)或对硝基苯_ β -吡喃半乳糖苷，对硝基苯酚a -D吡喃半乳糖苷以2mM的浓度250uL溶于pH 4. O缓冲液中，加入250uL适当稀释的酶液，在50°C反应IOmin后，加入1. 5mL IM Na2CO3，在405nm下测定OD值。酶活单位定义为在最适温度和条件下，每分钟释放lumol pNP所需要的酶量(U/mL)。用灭过菌的牙签挑取LB固体平板上的单菌落于发酵培养基中，30°C、220r/min、150mL/500mL的条件下振荡培养72h，培养过程中观察菌体生长状况。发酵液经尼龙丝网过滤、在4°C下10000r/min离心20min，上清液即为粗酶液，用于检测α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶等4种不同糖苷水解酶的酶活力。经测定，菌株培养72h后均可检测到4中酶活力，分别为1.2,3. 1,2. 1,4. 5U/ml。实施例3不同酶的最适pH
分离纯化α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶，在不同的PH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的O. lmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50°C下进行酶活力测定。结果(图2)表明，α-半乳糖苷酶的最适pH为4.0，在ρΗ3· 5 6. 5有80%以上的相对酶活性。β _半乳糖苷酶pH为4. 0，在ρΗ3· 0 7· O有50%以上的相对酶活性。β -葡萄糖苷酶的最适pH为3. 0，在pH2. 5飞.O有60%以上的相对酶活性。甘露聚糖酶的最适PH为3. 5，在ρΗ3. (Γ7. O有40%以上的相对酶活性。以上结果表明，菌株RBS-4所产糖苷水解酶最适pH在酸性范围内，并且在酸性及中性pH条件下具有较高的活性。
权利要求
1.高产酸性糖苷水解酶菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo. 5986。
2.权利要求1所述高产酸性糖苷水解酶菌株用于发酵制备酸性糖苷水解酶的应用。
3.一种产酸性糖苷水解酶的液体发酵方法，其特征在于，其特征在于，所述方法包括步骤将权利要求1所述菌株在PH3. O的LB液体培养基培养16h后获得新鲜种子液，再将种子液按照1%的接种量转入产酶培养基中，30°C，160rpm振荡培养72h后，离心取上清液，利用不同糖苷水解酶标准测定方法测定其酶活。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，具体地涉及高产酸性糖苷水解酶的菌株，其保藏编号为CGMCC No.5986。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有对嗜酸环境微生物分离，提供一种产酸性酶的菌株。本发明的菌株经鉴定为分枝杆菌，最适pH为3.0，其产酶在pH3.0～4.0都有较高的酶活性；可使其在需求酸性环境的工业生产上应用。
文档编号C12N9/40GK103045513SQ201210556579
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者李江, 刘亚洁, 吕飞龙, 王学刚, 孙占学, 徐玲玲, 史维俊, 徐蔚云, 石鹏君, 姚斌 申请人:东华理工大学