专利名称：N－乙酰－β－氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域内对N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的检测，尤其涉及利用酶比色法测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，以及由此制得的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，属于N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性分析检测技术领域。
背景技术：
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG))是细胞内溶酶体的一种酸性水解酶。研究表明，人体液(血液、尿液)中NAG活力的大小可用作多种疾病的有效辅助诊断指标，检测体液中NAG活力具有重要的临床价值。NAG可作为肾损伤一个极为灵敏的指标，由休克引起急性肾功能衰竭患者尿中极度增高，最高可达正常人的1200倍。急性肾小球肾炎、肾病综合征，毒物或药物引起的肾毒性反应均可使NAG增加。肾移植后，酶测定可用来判断有无排斥反应。病理性增高见于各种肾实质性病变，肾移植排异反应，肾毒性药物使用过多。某些肾小球肾炎、肾病综合征也有部分升高。
NAG活力的测定主要有荧光分光光度法和可见分光光度法。前者因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜用作一般医院的常规检验；后者已见报道的方法在各种实验条件的选定上虽各有千秋，但有的操作烦琐费时，有的所选定的条件或试剂稳定性欠佳，难以满足临床检验要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种利用酶比色法测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，采用以下步骤进行首先，将待测样品与含有合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
上述测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法中，所述合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷底物是3，4-双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或者2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷。所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
实现本发明N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂 5～100g/ml，合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷 0.2～10mmol/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂II中的合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂还是双剂，本发明测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，其合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷底物是3，4-双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或者2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液 100mmol/L，稳定剂 2mol/L，
合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷2mmol/L。
本发明利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，连续监测在405nm波长处吸光度的变化，得以测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法。同时，本发明还给出用以实现该方法的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明利用酶比色法技术测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的大小；(6)本发明提供的液态N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，运用N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶酶促反应连续监测法，N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶酶解3，4双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷反应产生3，4双硝基苯或2-氯-4-硝基苯(在405nm处有吸收峰，摩尔消光系数为18.45)，通过测量405nm处吸光度上升的速度，测算N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒咪唑/盐酸缓冲液 50mmol/L，硫酸铵 80g/ml，3，4双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷2mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长405nm，测试副波长505nm，被测N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶样品与试剂的体积比为1∶25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值1409。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒试剂I——磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 50mmol/L，
甘油2mol/L；试剂II——磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 50mmol/L，丙二醇 50％v/v，2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷 2mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长405nm，测试副波长505nm，被测N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值732。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法，包括以下步骤①将待测样品与含有合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷的试剂混匀，使之发生以下反应， ②将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法，其特征在于合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷底物是3，4-双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或者2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷。
3.N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂 0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷 0.2～10mmol/L。
4.根据权利要求3所述的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷底物是3，4-双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或者2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷。
5.根据权利要求3所述的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
6.权利要求3～5中任意一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或者双剂。
7.权利要求3～5中任意一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种N－乙酰－β－氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及N－乙酰－β－氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，运用N－乙酰－β－氨基葡萄糖苷酶酶促反应连续监测法，N－乙酰－β－氨基葡萄糖苷酶酶解3，4双硝基苯－β－乙酰氨基葡萄糖苷或2－氯－4－硝基苯－β－乙酰氨基葡萄糖苷反应产生3，4双硝基苯或2－氯－4－硝基苯，通过测量405nm处吸光度上升的速度，测算N－乙酰－β－氨基葡萄糖苷酶的活性大小。试剂盒成分包括缓冲液、合成硝基苯－β－乙酰氨基葡萄糖苷及稳定剂，将诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响。本发明完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号G01N21/31GK1995975SQ200610161229
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司