烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法

专利名称：烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法
技术领域：
本发明属于检测材料，尤其涉及一种烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸 条的制备方法。
技术背景烟草黄瓜花叶病在我国各产烟区均有发生，近年来危害逐步重于普通花叶 病，在河南、山东、陕西、四川、黑龙江、辽宁等省每年都造成较大的经济损失，是我国重要的病毒病之一。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 的核酸是三分体线状正链ssRNA，主要在越冬蔬菜、多年生杂草上越冬，来年 春天由带毒有翅蚜虫刺吸烟叶，形成初侵染，田间通过蚜虫和摩擦接触形成再 侵染。侵染烟草初期仅表现心叶脉明、花叶等症状，严重者后期则表现为整株 矮化，上部叶花叶、畸形，下部叶坏死纹、坏死斑等出现。目前烟草花叶病毒病的检测方法有电镜法和血清学法两种。电镜法是检测 病毒最可靠最有效，主要有负染法和组织超薄切片法，可以直接观察到病毒的 形态特征、内部结构及病毒混合感染的情况。血清学法需要制备完整病毒的抗 血清，用各种血清反应方法进行检测。但这两种方法都需要将样品中病毒或核酸提取和纯化，需要超高速离心机 以及电子显微镜等设备，虽然血清学法特异性比较强，但在病毒浓度较低时， 制备的抗血清效价不高,检测效果不理想。因此需要有一个快速简便、可靠性高 的检测方法来进行检测。发明内容本发明的目的是提供一种烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方 法，有这种试纸条可快速简便地进行检测，且可靠性高。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案 一种烟草黄瓜花叶病毒田间 快速检测试纸条的制备方法，包括制备抗体、制备胶体金、制备胶体金一抗体 结合物、制备硝酸纤维素膜和制备胶体金层析检测试纸的步骤，在制备抗体的步骤中，要制备兔多克隆抗体用无菌生理盐水将烟草黄瓜花叶病毒抗原稀释为2mg/ml，然后加Freund's佐剂，第一次为完全佐剂，以后用不完全佐剂；抗 原注射量为0.1 0.2mg/kg，选用2~3Kg的兔子，采取静脉注射方式，分三次完 成，每次注射抗原用量0.03 0.1mg，间隔时间为10d，末次注射10d后进行放血， 放血前动物禁食12h，采用耳静脉放血40 60ml，收集后离心除去血细胞，纯化 后零下2(TC保存；并用同样的方法制备羊抗兔抗体。在制备胶体金的步骤中，取1%氯金酸0.6ml在30ml超纯水中加热煮沸， 快速一次加入37。C预温的l^柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸 3 5min，补水至30ml;冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾调pH至7.2~7.5， 然后用0.22nm滤膜进行过滤，制备20 30nm胶体金颗粒。在制备胶体金一抗体结合物的步骤中，取lmg纯化的烟草黄瓜花叶病毒抗 体，边搅拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌lh，然后加10%牛血清 蛋白2ml，室温下搅拌5min，再加10%聚乙二醇lml,室温下搅拌5min， 12000 15000 rpm离心50min，沉淀溶于5ml保存液中，用0.45pm滤膜过滤，4°C 保存。在制备硝酸纤维素膜的过程中，将3ml胶体金-抗体结合物和3ml TBS缓冲 液混匀，放入硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡10mln，取出在37"C烘箱中烤干，热 合封口， 4"C保存备用；然后将烟草黄瓜花叶病毒的兔多克隆抗体和羊抗兔抗体 分别用固相溶液稀释成3mg/ml和lmg/ml，两种抗体分别取1^1，依次点样在 NC膜上，即检测线和质控线，固相抗体NC膜在0.5。/。BSA封闭液中，37。C下 孵育lh后，洗涤液中洗2次，室温下风干，4 8。C保存。在制备胶体金层析检测试纸的步骤中，取一块洁净的PVC板，将包被的NC 膜固定在适当的位置上，将引水材料连接在NC膜的下端，吸水材料连接在NC 膜的上端，胶体金-抗体结合物硝酸纤维素膜置于引水材料下与NC膜衔接，用 切割机将组装后的PVC板纵向切成6mm宽的测试条，将其装入板壳即可。采用上述技术方案制备的烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条，检测适 温15 35。C，检样量0.1 0.3g的样品，相当于叶面积大约3~5cm2;将烟叶在装 有缓冲液的塑料袋中研磨后，将试纸条浸入，30min出结果；假阳性率低于1%。 可见本发明使用方便，特别适用于田间快速检测，并且可靠性很高。
具体实施方式
实施例1:抗体的制备制备烟草黄瓜花叶病毒兔多克隆抗体用无菌生理盐水将抗 原即纯化的CMV稀释为2mg/ml，然后加Freund，s佐剂，第一次为完全佐剂， 以后用不完全佐剂。抗原注射量为0.1~0.2mg/kg，选用2 3Kg的兔子，采取静 脉注射方式，分三次完成，每次注射抗原用量0.03 0.1mg，间隔时间为10d。末 次注射10d后进行放血。放血前动物禁食12h，采用耳静脉放血40 60ml。收集 后离心除去血细胞，纯化后零下2(TC保存。羊抗兔抗体同样制备。胶体金颗粒的制备取1X氯金酸0.6ml在30ml超纯水中加热煮沸。快速
一次加入37。C预温的1 %柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸4min， 补水至30ml。冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾调pH至7.5。用0.22pm滤 膜进行过滤，制备20 30nm胶体金颗粒。胶体金一抗体结合物的制备取lmg纯化的烟草黄瓜花叶病毒抗体，边搅 拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌lh。加10X牛血清蛋白2ml，终浓 度为0.4%，室温下搅拌5min。加10%聚乙二醇lml，终浓度为0.2%，室温下 搅拌5min。然后12000 15000 rpm离心50min，沉淀溶于5ml保存液中。用0.45pm 滤膜过滤，4'C冰箱保存。胶体金-抗体结合物硝酸纤维素膜的制备将3ml胶体金-抗体结合物和3ml TBS缓冲液混匀，放入硝酸纤维素膜浸泡10mln，取出在37"C烘箱中烤干，热 合封口 ，4。C保存备用。TBS缓冲液的成份是:pH7.6的Tris-HCL溶液0.05mol/L， NaCL0.15mol/L。烟草黄瓜花叶病毒的兔多克隆抗体和羊抗兔抗体分别用固相溶 液稀释成3mg/ml和lmg/ml。两种抗体分别取1^1，依次点样在NC膜上，加羊抗兔抗体的为检测线，加烟草黄瓜花叶病毒的兔多克隆抗体的为质控线。固相 抗体NC膜在0.5。/。BSA封闭液中，37。C下孵育lh后，洗涤液中洗2次，室温下 风干，4 8"C保存备用。胶体金层析检测(GICA)试纸的制备取一块洁净的PVC板，将包被的 NC膜固定在适当的位置上。将引水材料连接在NC膜的下端即进样端，吸水材 料连接在NC膜的上端，胶体金-抗体结合物硝酸纤维素膜置于引水材料下与NC 膜衔接。用切割机将组装后的PVC板纵向切成6mm宽的测试条，将其装入板 壳，即为CMV胶体金免疫层析检测试纸，加干燥剂密封保存。试纸条总长度大 约为8cm，引水部位即与样品接触的部位长约4cm， NC这段大约长1.5cm，吸 水部位长2.5cm。试纸条的使用步骤取0.1 0.3g的烟叶样品，叶面积大约3 5cm2，在装有 缓冲液的塑料袋中研磨后，将试纸条引水端插入检测样中，样品向试纸的另一 端爬行。若试纸条上只有质控线出现红色而检测线未显色，结果为阴性；若试 纸条上质控线和检测线均出现红色，结果为阳性；若试纸条上质控线和检测线 均未显色，则说明次试纸条己经失效，结果无效。实施例2:在本实施例中，制备胶体金颗粒时取l^氯金酸0.6ml在30ml 超纯水中加热煮沸。快速一次加入37。C预温的1X柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐 渐变为紫红色，煮沸3min，补水至30ml。冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾 调pH至7.5。其它与实施例l相同。实施例3:在本实施例中，制备胶体金颗粒时取1X氯金酸0.6ml在30ml
超纯水中加热煮沸。快速一次加入37"C预温的1X柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐 渐变为紫红色，煮沸4min，补水至30ml。冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾 调pH至7.4。其它与实施例1相同。实施例4:在本实施例中，制备胶体金颗粒时取1 %氯金酸0.6ml在30ml 超纯水中加热煮沸。快速一次加入37"C预温的1X柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐 渐变为紫红色，煮沸5min，补水至30ml。冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾 调pH至7.2。其它与实施例l相同。实施例5:在本实施例中，制备胶体金颗粒时取r^氯金酸0.6ml在30ml 超纯水中加热煮沸。快速一次加入37'C预温的1X柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐 渐变为紫红色，煮沸3min，补水至30ml。冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾 调pH至7.3。其它与实施例l相同。
权利要求
1. 一种烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法，包括制备抗体、制备胶体金、制备胶体金-抗体结合物、制备硝酸纤维素膜和制备胶体金层析检测试纸的步骤，其特征在于在制备抗体的步骤中，要制备兔多克隆抗体用无菌生理盐水将烟草黄瓜花叶病毒抗原稀释为2mg/ml，然后加Freund’s佐剂，第一次为完全佐剂，以后用不完全佐剂；抗原注射量为0.1～0.2mg/kg，选用2～3Kg的兔子，采取静脉注射方式，分三次完成，每次注射抗原用量0.03～0.1mg，间隔时间为10d，末次注射10d后进行放血，放血前动物禁食12h，采用耳静脉放血40～60ml，收集后离心除去血细胞，纯化后零下20℃保存；并用同样的方法制备羊抗兔抗体。
2、 如权利要求1所述的烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法， 其特征在于在制备胶体金的步骤中，取1X氯金酸0.6ml在30ml超纯水中加 热煮沸，快速一次加入37"C预温的l^柠檬酸钠0.9ml，溶液由蓝逐渐变为紫红 色，煮沸3 5min，补水至30ml;冷却到室温后，用0.2mol/L的碳酸钾调pH至 7.2 7.5,然后用0.22拜滤膜进行过滤，制备20 30nm胶体金颗粒。
3、 如权利要求1或2所述的烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备 方法，其特征在于；在制备胶体金一抗体结合物的步骤中，取lmg纯化的烟草 黄瓜花叶病毒抗体，边搅拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌lh，然后 加10^牛血清蛋白2ml，室温下搅拌5min，再加10%聚乙二醇lml，室温下搅 拌5min， 12000- 15000 rpm离心50min，沉淀溶于5ml保存液中，用0.45,滤 膜过滤，4"C保存。
4、 如权利要求3所述的烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法, 其特征在于在制备硝酸纤维素膜的过程中，将3ml胶体金-抗体结合物和3ml TBS缓冲液混匀，放入硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡10mln，取出在37。C烘箱中 烤干，热合封口， 4。C保存备用；然后将烟草黄瓜花叶病毒的兔多克隆抗体和羊 抗兔抗体分别用固相溶液稀释成3mg/ml和lmg/ml，两种抗体分别取依次 点样在NC膜上，即检测线和质控线，固相抗体NC膜在0.5。/。BSA封闭液中， 37t:下孵育lh后，洗涤液中洗2次，室温下风干，4 8r保存。
5、 如权利要求1所述的烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法， 其特征在于在制备胶体金层析检测试纸的步骤中，取一块洁净的PVC板，将 包被的NC膜固定在适当的位置上，将引水材料连接在NC膜的下端，吸水材料 连接在NC膜的上端，胶体金-抗体结合物硝酸纤维素膜置于引水材料下与NC 膜衔接，用切割机将组装后的PVC板纵向切成6mm宽的测试条，将其装入板 壳即可。
全文摘要
本发明公开了一种烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法，包括制备抗体、制备胶体金、制备胶体金-抗体结合物、制备硝酸纤维素膜和制备胶体金层析检测试纸的步骤。采用上述技术方案制备的烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条，检测适温15～35℃，检样量0.1～0.3g的样品，相当于叶面积大约3～5cm²；将烟叶在装有缓冲液的塑料袋中研磨后，将试纸条浸入，30min出结果；假阳性率低于1％。可见本发明使用方便，特别适用于田间快速检测，并且可靠性很高。
文档编号G01N33/544GK101210924SQ200610160020
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月30日 优先权日2006年12月30日
发明者戚元成, 梁振普, 邱立友, 高玉千 申请人:河南农业大学