专利名称：构建抗黄瓜花叶病毒的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明为用基因重组技术构建抗黄瓜花叶病毒(CMV)感染的转基团植物的制备方法及转基因产物，更具体的说，本发明涉及构建CMV-JV株外壳蛋白基因，将外壳蛋白基因和卫星RNA基因同时整合到转移载体中，构建出能同时表达这两个转基因产物的方法及转基因产物。
CMV能引起属于85科，365属的755种植物病害，是我国危害最严重的病害之一。由于在大多数植物中未找到抗CMV因子，加之其又属非持久性蚜虫介体传染，难于进行治蚜防病，故无有效的防治办法。自从发现致弱病毒的卫星RNA和外壳蛋白可用于植物病毒的防治，已有许多报导用植物基因工程的方法获得抗病毒的转基因植物，证实了外壳蛋白(CP)基因和卫星RNA(Sat)基因的抗病作用。EP-279433号专利公布了CMV-Y株外壳蛋白的基因，用于产生抗CMV感染的植株的方法。美国尼普约翰公司从CMV-C株得到了外壳蛋白基因，构建转化载体，在植株中表达(W08905858)。另一种制备抗CMV转基因植物的方法是将卫星RNA基因引入植物染色体中，以获得抗性基因。CMV具有三分段基因组(RNA1，RNA2，RNA3)和一个为外壳蛋白编码的亚基因组(RNA4)，此外有些CMV中含有第五种分子量为1.1×105D的小分子RNA(卫星RNA)。卫星RNA不能独立复制，但能干扰病毒复制，改变寄主植物中症状的表达，并往往引起症状的减弱，卫星RNA已用于生物防治(田波等，科学通报，31(6)475，1986)。Baulcombe等报道将卫星RNA-1-17N的cDNA引入烟草，转化植株产生了对CMV的抗性。田波领导的实验室报道用CMV卫星RNA-1构建抗CMV的转基因烟草和番茄(吴世宣等，中国科学B辑，1989，9948-956.赵淑珍等，中国科学B辑，1990，7708-713.)，具有对CMV侵染的抗性;含有外壳蛋白基因的抗性植株产生抗病毒侵染的早期抗性，晚期效果不明显，而卫星RNA产生抗病毒复制的晚期抗性。转单基因的植株，只在不同时期以不同特性表现出各自不同的抗性，对完全防治病毒都有一定的局限性。
本发明的目的在于提供一种转基因植物的方法，在转基因植物中能同时表达卫星RNA和外壳蛋白基因，产生高抗性的植株。本发明的另一目的是提供带有上述两种基因的嵌合基因的转基因产物。
本发明的主要特征是把具有病毒早期抗性的外壳蛋白基因和病毒晚期抗性的卫星RNA基因构建在同一载体上，一起引入植物中。两个基因各自带有自己的表达盒，转基因产物能同时表达外壳蛋白和卫星RNA。
从感染CMV卫星RNA-1的烟草叶片中提取卫星双链RNA作为模板，合成全长的卫星RNA-1互补DNA，得到含卫星RNA-1cDNA的克隆pUI(张春霞等，科学通报34(7);540，1989)。该克隆含有
图1的卫星RNA-1基因。
外壳蛋白基因的合成以极强株CMV-JV为材料，接种烟草，两周后采集病叶，提纯病毒，从纯化的病毒提取病毒RNA作为反转录的模板，用3′端及5′端两个引物进行全长CP序列cDNA的合成。其引物序列为3′-引物5′-TCAGACTGGGAGTACTCT-3′5′-引物5′-ATGGACAAATCAAA-3′在3′端引物引导下，反转录合成第一条cDNA链。碱解模板RNA链，再加入5′端引物，合成第二条cDNA链，并以T4DNA聚合酶除去伸出的3′端以获得平端双链cDNA。将合成的CP的双链cDNA连接到E.coli质粒pUC19，转化大肠杆菌。在T4多核苷酸激酶的作用下标记3′引物的5′端，并以此作为探针。菌落杂交筛选出阳性克隆，经酶切筛选出插入片段大小在0.7kb左右的阳性克隆，测定插入片段序列，所得的CP序列如图2。
以ROKⅡ为中间载体构建含有上述两个基因的表达载体。ROKⅡ是由Binl9衍生而来的，其结构如图3所示。它含有T-DNA的左右边界序列，花椰菜花叶病毒35s启动子，蓝曙红合成酶转录终止序列，在两者之间含有5个单一酶切位点(XbaⅠ，BamHⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ，SacⅠ)，此外还具有既在细菌中，也在植物中表达的抗卡那霉素的选择标记。
以XbaⅠ与SacⅠ双酶切下pUⅠ上的卫星cDNA片断，其方向与ROKⅡ中的35s启动子方向一致，低熔点琼脂糖胶回收卫星cDNA片断。中间载体RoK-Ⅱ以同样的酶双酶切，并以低熔点琼脂糖胶回收质粒片断。卫星cDNA片断与RoKⅡ进行连接。连接产物转化Ca2+方法处理的E.coli感受态细胞，制备转化菌落质粒，以XbaⅠ与SacⅠ双酶切并电泳分析插入片断以确定阳性克隆(pRⅠ)。
以BamHⅠ与SacⅠ双酶切含CP基因质粒中外壳蛋白基因片断，以低熔点琼脂糖胶回收，构建外壳蛋白基因片断到RoKⅡ中，其方法同上所述。制备转化菌落质粒并酶切分析以鉴定筛选插入有外壳蛋白基因片断的阳性克隆(pRCP).
按图3所示将卫星cDNA与壳蛋白基因构建到同一ROKⅡ载体中。以BamHⅠ和SacⅠ双酶切RoRⅡ，以低熔点琼脂糖胶回收载体片断，以EcoRⅠ酶切上述含CP的质粒pRCP，用大片断酶补齐，以BamHⅠ酶切并回收有终止序列的外壳蛋白基因片断(CP-ter片断)。含有卫星RNA基因的质粒pRⅠ以HindⅢ酶切，以大片断酶补齐，然后以SacⅠ酶切，回收连有35S启动子片断的卫星cDNA片断(35S-Sat片断)。将CP-ter片断与35S-Sat片断连接到上述制备的RoKⅡ上，连接产物转化Ca2+方法处理的E.coli感受态细胞。制备转化菌落的质粒，鉴定插入有CP基因和卫星RNA基因的克隆(pRCPⅠ).所得到的植物转化载体(pRCPⅠ)含有两个表达盒，外壳蛋白基因与卫星cDNA分别插入到这两个表达盒中(图3)。
按本技术领域的专业人员使用的常规方法进行三菌接合，将上述构建的含CP基因和卫星RNA基因的载体引入含Ti质粒的农杆菌中，将上述三菌接合的克隆转化植物叶片，转化的植物可以为双子叶植物的叶片，特别是茄科，十字花科和葫芦科的植物。
用组织培养的方法从转化的叶片中再生出植株。
在转基因植株中测定CP和卫星RWA的表达。
转基因的当代植株中测定CP的表达，用Western杂交测定转基因产物中的外壳蛋白。从转基因植株叶中提取蛋白，电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，与CMV抗血清反应。用Northern杂交测定植株中CP基因的转录产物RNA，从转基因植物的叶片中提取总RNA，电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，与DNA探针杂交。放射自显影检测杂交结果。
用电泳法和点杂交两种方法检测卫星RNA在转基因植物中的表达。转化植株和对照植株分别接种不含卫星RNA的CMV-B，提取核酸进行电泳、染色，进行点杂交。
从上述方法检测结果表明在转基因植株中两种基因都得到表达。
用本方法构建的转基因植物可同时表达外壳蛋白和卫星RNA，嵌合基因植株接种病毒后，病情指数明显下降。
本发明提供了CMV-JV株外壳蛋白的基因，含有图2的序列。
本发明提供一种含有
图1的卫星RNA的基因和图2的蛋白外壳基因的转化载体，所说的外壳蛋白基因和卫星RNA基因各带有花叶菜花叶病毒35S启动子和蓝曙红合成酶转录中止子序列。
一种含有上述的转化载体的细菌细胞。
一种转化植物细胞，含有CMV-JV株外壳蛋白基因，CMV卫星RNA-1基因，所说的外壳蛋白基因和卫星RNA基因各带有花椰菜花叶病毒35S启动子和蓝曙红合成酶转录中止子序列。
来自上述转化细胞的双子叶植株，特别是茄科，十字花科和葫芦科转化植株，能同时表达CMV-JV株外壳蛋白和CMV卫星RNA-1，表现对CMV的高度抗病性。
实施例
1.CMV卫星RNA-1的cDNA合成克隆及序列分析用于cDNA合成的模板RNA为双链卫星RNA(dsRNA).将含卫星RNA-1的CMV接种于生长6-8周的普通烟上。两周后采集感病叶，感病叶在GPS缓冲液(200mM甘氨酸，100mM Na2HPO4，600mM NaCl，pH9.5)及1%SDS中研磨，加酚与氯仿抽提，离心取上清，以2.5倍体积乙醇沉淀上清，沉淀物溶于含15%乙醇的STE溶液(50mM Tris-Cl，100mM NaCL，1mM EDTA，pH7.0)，加入适量微晶纤维素，4℃过夜，上柱，用15%乙醇-STE平衡，洗柱，换用STE洗脱，在紫外监测仪监测下收集核酸峰。乙醇沉淀，离心即得纯度较高的双链RNA。采用低熔点琼脂糖凝胶回收卫星dsRNA.
用Applied Biosystem 381A型DNA合成仪合成两个引物。3′-端引物为5′CCCGGGTCCTGTATAGG-3′;5′端引物为5′-GTTTTGTTTGA-TGG-3′。引物在使用前磷酸化。其反应条件为50mM Tris-Cl，pH7.6，10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM亚精胺，0.1mMEDTA，2mMATP，5单位T4多核苷酸激酶，37℃保温30分钟。反转录合成cDNA的条件为，50mM Tris-Cl(pH8.0)，10mM MgCl，140mM KCl，100mM巯基乙醇500mM dATP，dGTP，dTTP，dCTP，50单位RNasin，60单位反转录酶，3-端引物及5′-端引物各150pm，42℃保温1小时后，加EDTA至终浓度10mM终止反应。酚提取后加入NaOH至0.2M，70℃反应25分钟以降解RNA，后用盐酸中和。SephadexeG-200柱分离，冷冻干燥后，退火并加DNA聚合酶Ⅰ大片断酶将cDNA两端补齐。
克隆载体为pUC12.以SmaⅠ酶解切成平端，70°保温10分钟以灭活酶。连接条件为，15mM Tris-Cl，pH7.0，5mM MgCl，5mM DTT，0.25mM亚精胺，1mM ATP，100mg/ml BSA，25mM三氯化六氨钻，400ng pUC12(SmaⅠ切)，30ng dscDNA，3单位T4DNA连接酶，22℃反应24小时。反应完毕，转化Ca2+法处理的E.coliJM107的感受态细胞，以3′端引物与5′端引物作探针，菌落杂交，分别筛选出3′端部分与5′端部分的克隆，构建全长的cDNA基因(pUI).
将全长cDNA片断亚克隆到M13mp18与mp19上，以双脱氧法进行序列分析。RNA-1卫星cDNA全长序列见
图1。
2.CMVCP基因的合成、克隆、序列分析和表达用CMV一个强株系JV为材料，接种生长6-8周的普通烟，两周后采收病叶，在含0.1%巯基乙醇的柠檬酸钠(0.5MpH7.0)缓冲液中匀浆，加等体积氯仿搅拌30分钟，离心取上清，以10%(w/v)PEG6000沉淀过夜，沉淀悬浮在含2%Triton-100的柠檬酸钠(0.05MpH7.0)中，离心取上清，超离心(28000rpm，2小时)，重复差速离心得病毒纯化样品。
病毒核酸的提取按酚-SDS法，抽提缓冲液为20mMTris-ClpH8.0，100mMNaCl，1mMEDTA，1%SDS，等体积酚氯仿抽提3次，乙醇沉淀三次。
用3′端及5′端两个引物进行全长CP基因的合成。用AppliedBiosystem381A型DNA合成仪合成两个引物3′-引物5′-TCAGACTCCC-ACTACTCT-3′;5′-引物5′-ATCCACAAATCACAA-3′。将合成的引物溶于TE(10mMTris-Cl，1mMEDTApH8.0)中，用无水乙醇沉淀。引物使用前需将其5′端磷酸化，反应条件为50mM Tris-Cl，10mM MgCl2，5 DTT，0.6mM ATP，pH7.5，5μ F4多核苷酸激酶37℃保温30分钟后，在65℃保温10分钟以使酶灭活。反转录合成第一条链，反应混合物(50ul)包含50mM Tris-Cl(pH8.3)，75mM KCl，10mM DTT，3mM MgCl2，500uM dNTPs，100ng 3′-引物，5ug模板RNA，500U M-MLV-RTase(BRL)，取5ul反应混合物加入5uCi[α-32p]以标记第一条链的合成。在37℃保温1小时后，加入EDTA(pH8.0)至终浓度20mM以终止反应，并加入5ul 2mM NaOH及双蒸水至总体积100ul，置此混合物于65℃保温30分钟，然后将其置于冰上，加入12ul 3mM NaAC(pH5.2)以中和碱液，并加入2.5倍体积无水乙醇，液氮中放置10分钟后离心回收DNA.第二条链cDNA的合成是在5′-引物引导下以大片断酶完成延伸的，反应混合物(50ul)包含50mM Tris-Cl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，200ug/ml BAS，500uM dNTPs，5u大片断酶，取10ul反应混合物加入5μCi[α-32P]-dCTP标记第二条链的合成，37℃保温1小时，加入EDTA(pH5.2)到终浓度20mM，用酚-氯仿混合物(1∶1 V/V)抽一次，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀过夜。
cDNA克隆载体为pUC19，载体以SmaⅠ酶切成平端，连接反应的条件为20mMTris-Cl(pH7.6)，10mMDTT，0.6mMATP，100ngpUC19(SmaⅠ)，1/5量的合成cDNA，2uT4DNA连接酶，总反应体积20ul，16℃保温24小时。
转化受体菌为E.coli JM107，感受态细胞的制备采用CaCl2处理的方法，加入连接产物到感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热击90秒钟后加入LB液体培养基并在37℃保温1小时，涂布含氨苄青霉素+X-gal+IPTG的LB板，37℃培养过夜。
将白色克隆接种放置于LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)上的硝酸纤维膜上，37℃培养过夜，裂解，变性，中和并在80℃处理2小时固定核酸于膜上，50℃洗膜30分钟，预洗液为5xSSC，0.5%SDS，1mMEDTA(pH8.0)，预杂交液为6xSSC，10xDenhardt溶液，0.1%SDS，125ug/ml小牛胸腺DNA，预杂交在65℃保温2-4小时，预杂交后，加入以[r-32P]-ATP标记的3′-引物作为探针，37℃过夜，洗膜溶液为6xSSC，温度为52℃，洗膜时间5分钟，-70℃放射自显影，根据酶切分析结果挑选插入片断在0.7kb左右的重组克隆。以煮沸法提质粒，质粒以NaOH(0.2M)碱变性(65℃保温30分钟)，加入NaAC(pH5.2)中和，加入2.5倍无水乙醇沉淀，以双脱氧法进行DNA序列分析，分析插入片断的两端序列，以确定完整的CP基因(pRCP).
从重组质粒pRCP上切下CP片断，将其亚克隆到M13mp18与mp19上，采用双脱氧法和用ABI370ADNA序列仪同时进行序列测定，测得的DNA序列如图2。
Westernblotting检测CP基因的表达。将CP基因克隆到pUC18上，用煮沸法小量提取部分重组质粒，酶切后电泳检测插入片断的大小，筛选出插入片断在0.7kb左右的重组克隆，加入IPTG(终浓为1mM)诱导表达，离心收获细胞，用TE悬浮，加入2x上样缓冲液(0.25MTris-ClpH6.8，20%蔗糖，1%SDS，1.0M硫基乙醇，0.25%溴酚兰)，煮沸10分钟，样品经过12%SDS-PAGE电泳后，电转移到硝酸纤维素膜上。预包被液为PBST(10mM磷酸缓冲液，pH7.2，150mMNaCl，0.05%Tween)+4%BSA，预包被时间为1小时(室温)，加入抗血清在室温下反应2小时，在经3次(每次30分钟)的PBST洗膜后，加入羊抗兔IgG-HRP室温反应2小时，以同样的方法洗膜后，加入硒试剂(100mg3，3′-二氨基联苯胺盐酸盐溶于100ml100mMTris-Cl，pH7.5)与双氧水显色。结果显示，外源的CP基因获得相当量的表达，其大小与CMV的外壳蛋白一致(24KD)，说明合成的CMV-JV株系的外壳蛋白基因具有表达活性。
3.构建CMV卫星cDNA与壳蛋白基因至同一转化载体使用的中间载体RoKⅡ其结构如图-3所示。含有T-DNA的左右边界序列，花椰菜花叶病毒35s启动子，蓝曙红合成酶转录终止序列，在两者之间含有5个单一酶切位点(XbaⅠ，BamHⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ，SacⅠ)，此外还具有既在细菌中，也在植物中表达的抗卡那霉素的选择标记。
以XbaⅠ与SacⅠ双酶切下pUⅠ上的卫星cDNA片断，其方向与RoKⅡ中35s启动子方向一致。低熔点琼脂糖胶回收卫星cDNA片断。中间载体RoKⅡ以同样的酶双酶切，并以低熔点琼脂糖胶回收质粒片断。卫星cDNA片断与RoKⅡ的连接反应条件为，20mM Tris-Cl(pH7.6)，10mM MgCl2，10mM DTT，0.6mM ATP，50ng卫星cDNA片断(XbaⅠ+SacⅠ)，2u T4 DNA连接酶，反应总体积为20ul，整个反应在16℃保温过夜。连接产物转化Ca2+方法处理的E.coliMCl022感受态细胞。小量制备转化菌落质粒，以XbaⅠ与SacⅠ双酶电泳分析插入片断以确定阳性克隆(pRⅠ)将外壳蛋白基因组建到ROKⅡ中。先选出外壳蛋白基因片断插入方向与RoKⅡ中35s启动子方向一致的克隆，以BamHⅠ与SacⅠ双酶切下外壳蛋白基因片断并以低熔点琼脂糖胶回收。构建外壳蛋白基因片断到RoKⅡ中，其方法同上所述。小量制备转化菌落质粒并酶切分析以鉴定筛选插入有外壳蛋白基因片断的阳性克隆(pRCP).
构建卫星cDNA片断与外壳蛋白基因到同一RoKⅡ载体中的实验流程见图3。以BamHⅠ与SacⅠ双酶切RoKⅡ并以低熔点琼脂糖胶回收载体片断(RoKⅡ，BamH+SacⅠ)，pRCP经EcoRⅠ酶切后以大片断酶补齐，然后以BamHⅠ酶切并回收连有终止序列的外壳蛋白基因片断(CP-ter片断);pRⅠ经HindⅢ酶切后以大片断酶补齐，然后以SacⅠ酶切并回收连有启动子片断的卫星cDNA片断(35s-Sat片断)。将CP-ter片断与35s-Sat片断连接到RoKⅡ上，其连接条件同前。整个反应在16℃保温24小时。连接产物转化Ca2+方法处理的E.coli MC1022感受态细胞。经小量制备转化菌落质粒并酶切分析以鉴定插入有CP基因片断与卫星cDNA片断的克隆(pRCPⅠ)。pRCPⅠ含有两个表达盒，外壳蛋白基因与卫星cDNA片断分别插入到这两个表达盒中，其排列方向与酶切位点见图3。
经限制性内切酶分析符合图3嵌合基因中各成分的次序。
4.三菌接合将含pRCPⅠ的E.coliMCl022接种于含25ug/ml的卡那霉素的LB培养液中，含pRD2013的E.coliHB101接种于LB培养液中，两者都在37℃摇床培养过夜。pAL4404农杆菌也接种于LB培养液中，30℃摇床培养24小时。在含卡那霉素培养液中生长的MCI022(含pRCPI)离心去上清，沉淀的细菌悬浮于10mlLB中。从3种培养细菌中，各取0.2ml的悬浮液，以不同的组合，涂布于不含抗菌素的MT无机盐培养基上划线，30℃培养3天，然后将其单克隆在同种培养基的不同平板上分别划线培养。如此重复3次以上，得到纯化的克隆作为转化用。
5.叶圆片转化和植株再生将经0.1%升汞消毒的烟草种籽在MS培养基上培养，光照为每天16小时，光强度2000lx，温度为25℃，1-1.5个月以后，将茎尖切下转到新的MS培养基上，4个星期后再将茎尖转到新的培养基上，这样就能不断保证苗源供应。
接种上述三菌接合的克隆至10ml的含50ug/ml卡那霉素的LB培养基上，在30℃摇床上培养24小时，离心，细胞沉淀悬浮于10mlMS培养液中，从生长4星期的烟草幼苗上选取健康而平展的叶片，用消毒的打孔器打取小圆片，放入有菌液的平皿中20-30分钟，不时轻轻摇动。再将这些沾有菌液小圆片放在含NBK培养基的平皿中，此培养皿中预先加进1ml的经两星期培养的烟愈伤组织液，涂平，用消毒过的新华一号滤纸覆盖，小圆片放在滤纸上，培养2天。
将在NBK培养基中生长2天的叶小圆片移到含100ug/ml卡那霉素，500ug/ml羧苄霉素的NBK培养基中培养，光照条件同茎尖培养，培养3-4周后，可形成小芽，将此小芽切下，转到含100ug/ml卡那霉素，200ug/ml羧苄霉素的NM培养基上诱导生根，两星期后开始生根，1个多月后根系发达，移植在温室花盆中培养。
6.检测转基因植物中外壳蛋白和卫星RNA的表达(1)外壳蛋白的检测提取和制备蛋白。将0.2g转基因烟草去中脉的叶片组织在液氮中研碎，转移到5mleppendorf管中，加入200ul抽提缓冲液(30mM磷酸钾pH7.5缓冲液，0.4M氯化钠，10mM2-巯基乙醇)，室温250rpm摇30分钟，10000rpm离心10分钟，取上清液，用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(10%分离胶，3%浓缩胶)。蛋白提取样品加等体积裂解液(0.125MTris-HClpH6.8，4%SDS，10%2-巯基乙醇，0.04%溴酚兰，20%甘油，0.1M二硫苏糖醇)95℃水浴5分钟，加样，先100V电泳，当样品进入分离胶后，150V电泳，直到指示剂移动到分离胶的3/4处，终止电泳。
将提取和制备的蛋白样品进行Western blot杂交。胶在预处理液(20%甘油，50mM Tris-HCl pH7.5)中浸30分钟。电转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。将Whatman滤纸和NC膜在转移缓冲液(10mM NaHCO33mM Na2CO3)中浸润。在电转移阴极依次铺设3张滤纸，凝胶，NC膜和3张滤纸(铺设中防止气泡出现)，300mA电转移30分钟，转移完毕，将NC膜于室温干燥2小时。
将NC膜在缓冲液PBS(10mMpH7.2磷酸纳缓冲液，150mMNaCl)浸润3分钟，加封闭液(PBS加4%BSA)室温封闭2小时，加入1100的CMV抗血清，室温反应2小时。用PBST(PBS+0.05%Tween20)洗膜3次，每次10分钟，加封闭液及11000羊抗鼠IgG，室温反应30分钟，用PBST洗膜三次，每次10分钟。将膜在显色缓冲液(0.1MNaCl 0.1MTris，50mM MgCl2pH9.5)浸润3分钟，加入显色液(显色缓冲液3.7ml+16.5ul NBT+13ul BCIP)显色1-5分钟。CP带出，用蒸馏水冲洗NC膜5次，室温晾干保存。
电转移后的凝胶在染色液(20%甲醇，3.5%乙酸，0.25%考马斯亮兰)中染色30分钟，加入脱色液(10%甲醇，10%乙酸)在摇床上脱色过夜，对比胶上分子量标准与NC膜上的色带。
CP基因转录产物RNA的Northernblot杂交检测。从转基因植株中提取和制备RNA，提取的RNA用甲醛/琼脂糖变性胶电泳分离。
将样品电转移到NC膜上。将胶先在水中浸泡，然后浸入50mMNaOH和10mMNaCl室温保持45分钟，用0.1MTris-Cl(pH7.5)中和，浸入20xSSC中1小时。按Westernblot中的同样设计电转。电转后膜用3xSSC浸泡，空气干燥1小时。将NC膜夹在两张Whatman滤纸之间，固定两边，在80℃真空中干燥两小时。
将膜放入杂交袋中，加入预杂交液(3xSSC，0.1%SDS，10xDenharts，100ug/ml鲑鱼精DNA)，65℃预杂交过夜。
将25ngDNA95℃10分钟变性，迅速置冰浴冷却，加1uldGTP，1uldATP1uldTTP，2ul反应混合物(试剂盒)，50uCi[α-32P]dCTP，补水到19ul.加入1ul大片段酶，37℃反应30分钟，将探针在100℃水浴5分钟变性，加入含有预杂交液的杂交袋中，65℃杂交过夜。
将膜小心从杂交袋中取出，用2xSSC0.1%SDS，室温洗3次，每次10分钟，65℃洗二次，每次10分钟，室温干燥，用保鲜膜包好，
将膜放入杂交袋中，加入预杂交液(3xSSC，0.1%SDS，10xDenharts，100ug/ml鲑鱼精DNA，65℃预杂交过夜。
将25ngDNA95℃10分钟变性，迅速置冰浴冷却，加1uldGTP，1uldATP1uldTTP，2ul反应混合物(试剂盒)50uCl[-32P]dCTP，补水到19ul.加入1ul大片段酶，37℃反应30分钟，将探针在100℃水浴5分钟变性加入含有预杂交液的杂交袋中，65℃杂交过夜。
将膜小心从杂交袋中取出，用2xSSC0.1%SDS，室温洗3次，每次10分钟，65℃洗二次，每次10分钟，室温干燥，用保鲜膜包好，放射自显影。
(2)卫星RNA的检测不含卫星RNA的CMV-B分别接种转基因和对照株，接种浓度约为50ug/ml，接种后用水轻轻冲洗，在防虫温室中培养，测定转基因植株中CMV浓度时，将叶片汁液适当稀释后，与未转基因的半叶对比接种于昆诺黎的叶片上，发病后计枯斑数目。
提取卫星dsRNA，将去中脉的0.5g叶片组织在液氮中研碎，迅速转移到10ml离心管中，加入2mlGPS缓冲液(0.2M甘氨酸，0.1M磷酸氢二钠，0.6M氯化钠)10%SDS400ul和2-巯基乙醇3ul。室温200rpm摇10分钟，加入2ml水饱和酚液，室温200rpm摇15分钟。加入1ml氯仿-异戊醇(24∶1)溶液，室温200rpm摇15分钟。10000rpm离心15分钟，取上清液，加入1/4体积的10MLiCl，混匀后放入冰-水浴中2小时。8000rpm离心20分钟。取上清液，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.5)，2.5倍体积冷乙醇，混匀后，-20℃放置4小时。10000离心20分钟，沉淀用70%乙醇洗1次，离心抽干沉淀，溶于200ulTE中，即获得含有dsRNA的核酸样品。
卫星dsRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。将相当于20mg叶片重量的总核酸，加入等体积指示剂(含10%蔗糖，0.02%溴酚兰，0.02%二甲苯兰，用TAE配制)，加样进行电泳后进行银染，经银染的胶片，可清楚地显示出各种核酸样品的dsRNA区带。
为进行点杂交分析，从植物组织提取RNA。取0.6克转基因植株叶片，加液氮磨碎后加入1.0ml预热到90℃的1∶1体积酚-缓冲液(100mMLiCl，1%SDS，100mMTris-Cl，10mMEDTA，4M异硫氰酸胍，0.1M巯基乙醇)，65℃水浴保温10分钟，室温中振摇10分钟，加入0.5ml氯仿，振荡后离心，取上清加入NaAC(pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇沉淀核酸。
以自由引物法制备探针，取50-100ng卫星cDNA片断，100℃处理3分钟以变性DNA加入自由引物，dATP，dGTP，dTTP和50uCl α-32P-dCTP以及大片断酶，37℃保温45分钟，探针使用前需加热变性。
取提取的总RNA样品，加入甲酰胺(终浓度为50%，V/V)，甲醛(7% v/v)，SSC(lx)于68℃保温15分钟使RNA变性。将变性的RNA样品真空抽滤点样于硝酸纤维素膜上。将膜晾干，于80℃烘烤2小时后置于杂交袋中，加入预杂交液(50%甲酰胺，5xSSC，5xDenhardt 0.1% SDS，100ug/ml小牛胸腺DNA，于42℃预杂交2小时。杂交液为预杂交液与32P标计的探针。于42℃杂交过夜。杂交完毕，取出杂交膜，以2xSSC-0.1% SDS洗膜，(室温洗三次，再于68℃洗膜(1xSSC，0.1%SDS)1-1.5小时。将膜取出，晾干，压片，并于-70℃爆光。
(3)转基因烟草中CP和Sat-RNA的表达情况转基因的当代植株移栽花盆中成活后采样测定CP表达。接种不含卫星RNACMV-B两周后，采样测定Sat-RNA的表达。CP以Western和Northern杂交两种方法分析，Sat-RNA以电泳和点杂交两种方法分析。表1是上述结果的总结。用两种方法检测基因产物表达的结果是一致的。大多数转嵌合基因的植株都同时表达两种基因产物。
权利要求
1.一种用植物基因工程技术构建抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因植物的方法，其特征在于将病毒外壳蛋白(CP)基因和卫星RNA(SatRNA)基因同时引入植物染色体中，转基因产物能同时表达病毒外壳蛋白和卫星RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于外壳蛋白基因来自CMV-JV株，具有图2的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的方法其特征在于卫星RNA基因来自CMV卫星RNA-I，具有
图1的DNA序列。
4.根据权利要求1所述的方法其特征在于外壳蛋白基因和卫星RNA基因各自带有自己的表达盒，将两种基因同时引入中间载体，经三菌接合，引入农杆菌，转化植物叶片，再生出植株。
5.来自CMV-JV株的外壳蛋白基因，具有图2的序列。
6.一种植物转化载体，含有权利要求5的外壳蛋白基因和
图1的卫星RNA-1的基因，所说的外壳蛋白基因和卫星RNA基因各带有花椰菜花叶病毒35S启动子和蓝曙红合成酶转录中止子序列。
7.一种含有权利要求6的转化载体的细菌细胞。
8.一种转化植物细胞，含有CMV-JV株的外壳蛋白基因，CMV卫星RNA-1基因，所说的外壳蛋白基因和卫星RNA基因各带有花椰菜花叶病毒35S启动子和蓝曙红合成酶转录中止子序列。
9.一种选自包括权利要求8的转化植物细胞的茄科植物，葫芦科植物或十字花科植物。
10.一种按权利要求9的茄科植物。
11.一种按权利要求9的十字花科植物。
12.一种按权利要求9的葫芦科植物。
全文摘要
本发明为一种用基因工程技术构建新型的抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因植物的方法及基转基因产物。将CMV外壳蛋白基因和CMV卫星RNA基因同时引入植物染色体中，获得再生植株，该两种基因在转基因植物中都得到表达。该方法适用于茄科，十字花科和葫芦科等双子叶植物。
文档编号A01H1/00GK1068144SQ9110407
公开日1993年1月20日 申请日期1991年6月22日 优先权日1991年6月22日
发明者叶寅, 田波 申请人:中国科学院微生物研究所