专利名称：黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及黄瓜绿斑驳花叶病毒 检测用引物及探针。
背景技术：
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cwcww6w grew moM/g Wrw^,
CGMMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus )葫芦科的重要病毒之一， 给葫芦科作物的生产造成严重威胁。在黄瓜叶片上引起色斑、水泡 及变形，使植株矮化、结果延时，果实大部分黄化或变白并产生黑 绿色水疱状的坏死斑，产量15%;在前苏联的Georgia地区，发生 率达80%~100%，可延缓黄瓜植株的生长发育，甚至导致不孕。 早期受侵染的西瓜植株生长缓慢，出现花叶，果实内部严重变色或 造成腐烂，果肉纤维化，产量下降30%; 1998年在韩国发生面积达 463hm2，造成较严重损失；2005年，在我国辽宁盖州地区造成西瓜 大面积毁灭，引起农业部、质检总局等相关部门的高度重视。因国 内学者对该病毒的研究较少，相关资料及防治经验缺少。
CGMMV分布比较广泛，首次报道于英国，此后在希腊、以色 列、法国、印度、日本、韩国、印尼和巴基斯坦等地均有发生。目 前已报道的CGMMV分离物多为西瓜株系(CGMMV-W)， CGMMV-W侵染西瓜后可引起典型的斑驳和花叶症状，在成熟期还 可导致西瓜果实内部出现果肉变色和腐烂，失去食用和商业价值， 造成重大经济损失，该病毒已被列入我国新修订的禁止进境的有害 生物名录之中。CGMMV非常稳定，在种子表面可存活数月，从土 壤中的植物病残体中仍可分离到具有侵染活性的病毒粒子。近年来， 我国进口的葫芦科作物种子的数量逐年增加，而且每年都要从
CGMMV发生地日本引进种子，因此该病毒随进境种子传入的风险很高。
本研究选择黄瓜绿斑驳花叶病毒3，端非翻译区基因设计的用于 荧光PCR检测的引物和探针序列，通过对反应的退火温度建立了黄 瓜绿斑驳花叶病毒的荧光PCR检测方法，反应结東即可根据扩增曲 线判定是否有黄瓜绿斑驳花叶病毒。
发明内容
本发明目的在于提供用于黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检 测的引物及探针序列。
本发明通过分析已报道黄瓜绿斑驳花叶病毒3'端非翻译区序列 的基础上，分别设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向 引物组成，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo. 1和2所示；所述探 针核苷酸序列如序列表SEQIDNo. 3所示，该探针的一端标记有报 告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。可用的报告荧光染料有 Fam\hex\tet\joe\vic\fitc\cy3\cy5 , 可用的淬灭荧光染料有 tamra\rox\dabcyl\bhq 1 \bhq2 。
根据TAQMAN技术，在常规PCR的基础上添加了 一条标记了 两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针 的5，端，淬灭荧光染料标记在探针的3，端，两者构成能量转移结构， 即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离 变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程 中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5，端到3， 端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑 制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对黄瓜绿斑驳花叶 病毒的检测。
本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方 法，其以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循
环结束釆集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR 反应，即在50pL反应体系中加入20.25 (xLDEPC处理水，25 2xMaster Mix without UNG, 1.25 |iL 40xMultiScribe and RNase Inhibitor Mix, 1 jiL引物CGMMV -FP ( 20 (rniol/L), 1 |iL引物 CGMMV -RP ( 20 jamol/L), 0.5 fiL探针CGMMV - FAM ( 20 |imol/L )， 1.6 ng总RNA。 TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents购自Applied Biosystems公司。
其中，上述反应条件可以是42 °C, 30min; 95 °C 5 min; 95 °C 15s, 60°Clmin，共40个循环。
当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计 其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。
进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂 盒，以方便使用。
本发明的根据黄瓜绿斑驳花叶病毒3'端非编译区序列设计引物 及探针，该引物特异性好，用于荧光PCR检测灵敏性高。本发明检 测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有黄 瓜绿斑驳花叶病毒，为进出口安全提供了保证。
图l是实时荧光RT-PCR技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的结果； 图2是本发明检测方法的灵敏度实验。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明 的范围。
实施例l引物及探针的设计和合成
根据猪链球菌2型两种毒力因子MRP (GenBank No. X64450 ) 和EF ( GenBankNO.A24023 )编码基因的公开序列，釆用探针设计软 件Express 2.0设计引物及探针，引物序列为CGMMV-RP (正向)5，陽GCATAGTGCTTTCCCGTTCAC画3， CGMMV-FP(反向)5'隱TGCAGAATTACTGCCCATAGAAAC-3， 所述探针的序列为5，- CGGTTTGCTCATTGGTTTGCGGA-3' 该探针的5'端用报告荧光染料FAM标记，3'端用淬灭荧光染料
TAMRA标记。
实施例2总RNA的提取
1) 取O.l g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入 灭菌的1.5 ml离心管中，然后加入1 ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇 匀；
2) 4°C， 12000 g离心10 min以除去不溶的成份，将上清液转入 一新的1.5 ml离心管中；
3) 室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15 s，然后在 室温下保持2-15 min后，4°C， 12000 g离心15 min;
4) 将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇， 颠倒混勻，室温下保持15min;
5) 4°C， 12000 g离心10 min， RNA就会在管的侧壁和底部形 成沉淀；
6) 倒掉上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4'C, 7500g 离心5min (如沉淀悬浮起来，则用12000g),弃去乙醇；
7) 沉淀于室温下充分干燥后，溶于30pldH20 (DEPC处理)
中，-2(rc保存备用。
实施例3 Real-timeRT-PCR扩增方法的建立 1、实时荧光RT-PCR反应体系
以总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在50]oL反 应体系中加入20.25 pL DEPC处理水，25 2xMaster Mix without UNG， 1.25 jiL 40xMultiScribe and RNase Inhibitor Mix, 1 引物 CGMMV隱FP( 20 (imol/L )， 1 引物CGMMV -RP( 20 pmol/L ), 0.5(iL探针CGMMV隱FAM (20pmol/L)， 1.6ng总RNA。 2、实时荧光RT-PCR反应条件
将样品管放入ABI公司ABI7700荧光PCR仪后，设置如下条 件进行反应42 °C, 30min; 95 °C 5 min; 95 °C 15s; 60 °C 1 min, 共40个循环。每个循环结束后釆集数据。反应结束后根据扩增曲线 判定结果。
实施例4黄瓜绿斑驳花叶病毒Real-time RT-PCR方法的特异性确 定
以表现症状的菜豆叶片总RNA为模板，以健康叶片最为对照，通 过实时荧光RT-PCR检测荧光强度变化。 试验结果
以表现症状的菜豆叶片总RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检 测可观察到明显的荧光强度变化，而健康对照的荧光强度没有变化， 结果见图l。 实施例5灵敏度实验
用DEPC处理水分别稀释总RNA,进行相对灵敏度检测，在50pL 反应体系中，总RNA分别为130ng、 13ng、 1.3 ng、 0.13 ng、 13pg、 1.3 pg、 0.13 pg。检测结果如图2所示，最低检测限是0.13pg。
序列表
<110>中国检验检疫科学研究院
<120〉黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针
<130>
<160〉 3
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211〉 21
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 1
gcatagtgct ttcccgttca c 21
<210> 2 <211〉 24 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2
tgcagaatta ctgcccateg a犯c 24
<210〉 3 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 3
cggtttgctc attggtttgc gga 2权利要求
1、一种黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物，其核苷酸序列为CGMMV-RP5’-GCATAGTGCTTTCCCGTTCAC-3’CGMMV-FP5’-TGCAGAATTACTGCCCATAGAAAC-3’。
2、 一种与权利要求l所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列 为5，- CGGTTTGCTCATTGGTTTGCGGA-3，，该探针一端标i己有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。
3、 如权利要求2所述的探针，其特征在于，该探针5，端标记有 FAM荧光染料，3'标记有TAMRA荧光染料。
4、 一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA 为模板，利用权利要求l所述的引物以及权利要求2或3所述的探 针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结東釆集数据，反应结束 后根据扩增曲线判定结果。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，实时荧光RT-PCR 的反应过程中的退火温度为60°C。
6、 含有权利要求1所述引物的试剂盒。
7、 如权利要求6所述的试剂盒，其还包括权利要求2或3所述 的探针。
全文摘要
本发明提供了一种黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。本发明还进一步提供了检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/70GK101186950SQ20071010030
公开日2008年5月28日 申请日期2007年6月7日 优先权日2007年6月7日
发明者朱水芳, 李明福, 净 白, 赵文军, 陈红运 申请人:中国检验检疫科学研究院