专利名称:诺如病毒gⅱ型检测用引物、检测方法、检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalampl ification, LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对诺如病毒G II型特定 基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩增法检 测诺如病毒G II型的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒G II型引起的食物中毒， 其发病率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测诺如病毒GII型的检测方法和检测试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的 引物。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种诺如病毒G II型检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所 述靶基因为诺如病毒G II型的衣壳蛋白一GenBank登陆号X86557，所述引物与所述靶基 因的5095位一5319位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
本发明的另一个目的在于，提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物组。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种诺如病毒G II型检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成
正向外引物F3-G II CGTCGAATGACGCCAACC
反向外引物B3-G II CGCTCCACAGTATCTCACCT
正向内引物FIP-G 11CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG 反向内引物 BIP-G II
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA
可以扩增诺如病毒G II型的衣壳蛋白(X86557)基因序列的5095位-—5319位 的核酸序列的一部分或其互补链。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述引物组还可以包括
正向环引物LF-G II TTATTGACCTCTGGGACGAGG
反向环引物LB-G II GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测诺如病毒G II型的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种诺如病毒G II型的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在诺如病毒G II 型，其特征在于，以诺如病毒G II型的衣壳蛋白(X86557)基因序列的5095位一5319位 的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域， 确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于细胞培养上清液、粪便、呕吐物等病毒待 检标本；取粪便、腹泻物用适量生理盐水稀释，离心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNAMini Kit)；
2)诺如病毒G II型的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C的 环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul IOOul)
3) LAMP反应产物的检测
A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为 阴性；或，
B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000 X SYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，
C)电泳检测2_3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征 性梯状条带，最小片段在180bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括
正向环引物LF-G II 0. 6-1. OuM
反向环引物LB-G II 0. 6-1. OuM
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测诺如病毒G II型的检测试剂盒。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种诺如病毒G II型检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述 引物或引物组的扩增反应液、酶。
所述扩增反应液中包括如下试剂
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM ρΗ 8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；
所述酶为包括，每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单 位的AMV反转录酶。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括
正向环引物LF-G II 0. 6-1. OuM
反向环引物LB-G II 0. 6-1. OuM
所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性 对照模板为诺如病毒G II型基因组cDNA(l IOOnM)。
本发明通过提供一种对诺如病毒G II型特定基因片段具有特异性的引物组，及其 用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在诺如病毒G II型特定基因片段，进而确 定标本中是否存在诺如病毒G II型。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、 方便快捷、不需特殊仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层 普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性 强、敏感性比PCR高或相当、比PCR省时约2小时、不需特殊仪器(扩增反应在水浴锅中即 可完成)等优点。
图1本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)后通过肉眼观察的结果。图 例1、阳性扩增结果；2、阴性扩增结果。
图2本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)后加入染料观察的结果。图 例1、阴性扩增结果；2，3、阳性扩增结果。
图3本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)结果的电泳图；
图例1 =IOObp marker ；3-6 分别为诺如病毒G II病毒标本；7_8 分别为轮状病 毒A组G 1和G 3型毒株(标准毒株)对照。
具体实施方式
下面通过具体的诺如病毒G II型检测过程来对本发明进行说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例一对已知诺如病毒G II病毒标本衣壳蛋白基因的扩增
一)引物组的设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出诺如病毒G II型特异性衣壳蛋白基 因的5095-—5319bp核酸序列，针对该片段的六个位点(这六个位点分别5095_5112bp、 5113-5130bp、5158-5178bp、5207-5228bp、5267-5286bp、5300-5319bp)设计出 LAMP 引物并 合成，得到如下的引物。引物设计通过LAMP专用引物设计软件结合分子生物学分析软件 Advance Vector NTI 完成。
序列编号1
正向外引物 F3-G II CGTCGAATGACGCCAACC 序列编号2
反向外引物 B3-G II CGCTCCACAGTATCTCACCT 序列编号3
正向内引物 FIP-G II CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG 序列编号4 反向内引物BIP-G II
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA 所述6个位点的序列分别为
5095-5112bp 5113-5130bp 5158-5178bp 5207-5228bp 5267-5286bp 5300-5319bp
cgtcgaatgacgccaacc catctgatgggtccgcag aggttatggctctggagcccg ggcgggccaacaaaacgtaatt tgga gagttcacagtgtccc aggtgagatactgtggagcg
其中，
所述正向外引物 F3 扩增始于 5095-5112bp (cgtcgaatgacgccaacc)；
所述正向内引物FIP 扩增始于5158_5178bp (aggttatggctctggagcccg)的互补序 列和 5113_5130bp (catctgatgggtccgcag)；
所述反向外引物B3 扩增始于5300_5319bp(aggtgagatactgtggagcg)的互补序 列；
反向内引物 BIP 扩增始于 5207-5228bp (ggcgggccaacaaaacgtaatt)和 5267-528 6bp (tggagagttcacagtgtccc)的互补序列。
上述引物组中各引物的共性在于 5095-—5319bp核酸序列互补。
二)本实施例实验的毒株与各毒株的扩增结果如下表一
表一(为了便于理解，本申请人将下列序号与图1中编号设置成-
上述供试毒株部分为标准毒株，购自中国典型培养物保藏中心；部分为检测毒株 标本(经深圳太太基因荧光PCR试剂盒验证)由本申请人保存。“阴”表示无扩增反应，“阳” 表示有扩增反应。
三)上述各毒株基因RNA的提取
取细胞培养上清液、粪便、腹泻物用适量生理盐水稀释，离心取上清液用于RNA抽 提(QIAamp Viral RNA Mini Kit)。
四)基于LAMP法的基因扩增
取扩增反应液14. 6ul，加2. Oul待检模板，加Iul的聚合酶和0. 5ul的反转录酶， 再加6. 9ul ddH20,形成如下表总体积为25ul的反应体系，在温度为65°C的恒温水浴锅保 温约90分钟，然后置于80°C、2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积为25ul)
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液包含IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3. 6mM硫酸镁、 1.6uM正向内引物FIP-G II、1.6uM反向内引物BIP-G II、0. 2uM的正向外引物F3-G II、 0. 2uM 的反向外引物 B3-G II、1.4mM dNTP 和 IM 甜菜碱(betaine)；
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM pH 8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；
酶每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位的AMV反
转录酶。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定 的反应体积。
五)扩增产物的检测
随着扩增反应的进行，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应液中存在的镁离子将 形成焦磷酸镁沉淀。因此，只有在发生核酸扩增的反应液中才会出现白色浑浊。这样可以 通过如下方式进行判断。
A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为 阴性；(参见图1)或，
B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000 X SYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；(参 见图2)或，
C)电泳检测2_3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征 性梯状条带，最小片段在ISObp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。(参见 图3)
经对扩增产物的检测，表明上述引物组只对诺如病毒G II型阳性标本出现LAMP 扩增反应，对照毒株未出现扩增反应，显示了良好的特异性。
6)灵敏度比较
10[0100]以诺如病毒G II型阳性标本为检测毒株，将所提RNA反转录成cDNA后做一系列 稀释JO-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6UO-7,分别用LAMP方法和PCR方法(上下游引物分别为 F3-G II、B3-G II)来检测，检测结果表明LAMP反应敏感性达10_4 ；PCR反应敏感性达10_3 ； 结果显示LAMP反应敏感性比PCR反应敏感10倍。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增阶段，为 了加快扩增反应速度，在所述扩增反应液还包括有
序列编号5
正向环引物LF-G II TTATTGACCTCTGGGACGAGG
序列编号6 反向环引物 LB-G II GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG 此时
所述正向环引物 LF-G II 扩增始于 5135_5155bp(cctcgtcccagaggtcaataa)的互
所述反向环引物LB-G II 扩增始于5242-5265bp
补序列；
(gaaacaattttgtacaagcccctg)
此时反应体系为(反应总体积为25ul)
在加入上述正向环引物LF-G II和反向环引物LB-G II后只需在温度为65°C的恒 温水浴锅保温约60分钟，然后置于80°C、2分钟灭活酶。
实施例三
本实施例与实施例二的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反 应体系为
反应体系为(反应总体积为25ul)[0118]
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液包含10 XBstDNAPolymerase Buffer反应缓冲液、2mM硫酸镁、1. OuM 正向内引物FIP-G II、LOuM反向内引物BIP-G II、0. 15uM的正向外引物F3-G II、0. 15uM 的反向外引物B3-G IIU. OmM dNTP、0. 6uM正向环引物LF-G II、0. 6uM反向环引物LB-G II 和 0. 8M 甜菜碱(betaine)；其中 IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM PH 8. 8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸 镁和曲拉通X-100 ；
酶每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位的AMV反
转录酶。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定 的反应体积。
反应条件在温度为60°C的恒温水浴锅保温约75分钟，然后升温至80°C、2分钟 灭活酶。
实施例四
本实施例与实施例二的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反 应体系为
反应体系为(反应总体积为25ul)
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。扩增反应液 A 包含IOXBst DNAPolymerase Buffer反应缓冲液、6mM硫酸镁、2. OuM正向内引物FIP-G II、2. OuM反向内引物BIP-G 11,0. 3uM的正向外引物F3-G 11,0. 3uM的反向外引物B3-G II、1.6mM dNTP、l. OuM正向环引物LF-G II、1. OuM反向环引物LB-G II和1.5M甜菜碱 (betaine)。
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM pH 8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100。
酶每微升含16个活性单位的Bst DNA聚合酶和每微升含20个活性单位的AMV 反转录酶。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定 的反应体积。
反应条件在温度为65°C的恒温水浴锅保温约60分钟，然后置于80°C、2分钟灭活酶。
实施例五从腹泻物中分离的毒株的检测
毒株基因DNA的提取及扩增、检测
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于细胞培养上清液、粪便、呕吐物等病毒待 检标本；取粪便、腹泻物用适量生理盐水稀释，离心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNAMini Kit)；
对上述提取的RNA与实施例一同样的通过LAMP法进行核酸扩增并对扩增产物的 进行检测及酶切鉴定。扩增结果与阳性扩增产物的酶切鉴定结果之比较，如下表二。
基于阳性扩增产物的酶切鉴定
将LAMP检测为阳性的扩增产物进行酶切鉴定靶基因序列上含限制性内切酶Hae III位点，位于5211-5214bp，用Hae III来酶切LAMP阳性扩增产物，结果显示酶切片断有 3个，分别为155bp、121bp、90bp大小，与理论预测值相符(参见电泳图3第2道)，因而确 定阳性扩增为特异性扩增。
如表二所示，阳性扩增产物的酶切鉴定符合理论预测片段大小及片段数，只有检 测标本的LAMP特异性扩增才观察到上述结果。
序列表
<110>珠海市疾病预防控制中心
<120>诺如病毒G II型检测用引物、检测方法、检测试剂盒
<160>7
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>1
CGTCGAATGACGCCAACC18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>2
CGCTCCACAGTATCTCACCT20
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物[0167]<400>3
CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG39
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>4
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA 42
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>5
TTATTGACCTCTGGGACGAGG21
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>6
GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG24
<210>7
<211>225
<212>RNA
<213>诺如病毒6 11型
<400>7
5095 cgtcga
5101 atgacgccaa cccatctgat gggtccgcag ccaacctcgt cccagaggtc
aataatgagg
5161 ttatggctct ggagcccgtt gttggtgccg ctattgcggc acctgtggcg
ggccaacaaa
5221 acgtaattga cccctggatt agaaacaatt ttgtacaagc ccctggtgga
gagttcacag
5281 tgtcccctag aaacgctcca ggtgagatac tgtggagcg
权利要求
一种诺如病毒GII型检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物F3 GII CGTCGAATG ACGCCAACC反向外引物B3 GII CGCTCCACA GTATCTCACCT正向内引物FIP GII CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG反向内引物BIP GIIGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA。
2.根据权利要求
1所述的一种诺如病毒GII型检测用引物组，其特征在于，所述引物 组还包括正向环引物 LF-GII TTATTGACCTCTGGGACGAGG 反向环引物 LB-GII GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG。
3.—种诺如病毒GII型检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利要 求1中所述的引物组的扩增反应液、酶；所述扩增反应液中包括如下试剂 其中IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8. 8的三羟基甲硫 氨酸甲烷-盐酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ；所述酶包括每微升含8个活性单位、终浓度0. 16-0. 64U/ul的Bst DNA聚合酶和每微 升含20个活性单位、终浓度0. 4U/ul的AMV反转录酶。
4.根据权利要求
3所述的一种诺如病毒GII型检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应 液还包括正向环引物LF-GII 0.6-1. OuM反向环引物 LB-GII 0.6-1. OuM。
5.根据权利要求
4所述的一种诺如病毒GII型检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应 液，包含1/10预定反应体积的IOXBst DNA PolymeraseBuffer反应缓冲液、3. 6mM硫酸镁、 1. 6uM正向内引物FIP-GIIU. 6uM反向内引物BIP_GII、0. 2uM的正向外引物F3_GII、0. 2uM 的反向外引物B3-GII、0. 8uM正向环引物LF-GI 1,0. 8uM反向环引物LB-GIIU. 4mMdNTP和 IM甜菜碱；所述酶每微升含8个活性单位、终浓度0. 32U/ul的Bst DNA聚合酶和每微升含20个 活性单位、终浓度0. 4U/ul的AMV反转录酶。
6.根据权利要求
4所述的一种诺如病毒GII型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为1 IOOnM 诺如病毒GII型基因组cDNA。
专利摘要
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种诺如病毒GII型检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为诺如病毒GII型的衣壳蛋白---GenBank登陆号X86557，所述引物与所述靶基因的5095位---5319位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对诺如病毒GII型特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在诺如病毒GII型特定基因片段，进而确定标本中是否存在诺如病毒GII型。
文档编号C12N15/11GKCN101153341 B发布类型授权 专利申请号CN 200710030430
公开日2010年12月15日 申请日期2007年9月21日
发明者张丽荣, 张彩虹, 谭爱军, 魏泉德 申请人:珠海市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (3),