专利名称:轮状病毒a组g3型检测用引物组、检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对轮状病 毒A组G3型特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介 导等温扩增法检测轮状病毒A组G3型的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157 :H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病 率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题，而轮状病毒 引起的食物中毒绝大多数为G3型所致。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1M6825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料STOR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测轮状病毒A组G3型的检测方法和检测试剂盒，以及针对轮状病毒A组G3型特定 基因片段的LAMP引物及引物组的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对轮状病毒A组G3型特定基因片段具有特异性 的引物组。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种轮状病毒A组G3型检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组 成[0009]正向外引物F3-G3 ACTGAAGCAGCAACAGAA
反向外引物B3-G3 ACATGTCCAGTTGCAGTG
正向内引物FIP-G3
AGATCCTGTTGGCCATCCTTTAATAATTCATGGAAGGATACACTTTC 反向内引物 BIP-G3
TATTGCCTCGTTTTCAGTTGATCCGCGTCGTATTTCATTAATACCAA 可以扩增轮状病毒 A 组 G3 型的VP7 (D86272)基因序列的307位-—505位的
核酸序列的一部分或其互补链。
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测轮状病毒A组G3型的检测试剂盒。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种轮状病毒A组G3型检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上 述引物或引物组的扩增反应液、酶。
所述扩增反应液中包括如下试剂
权利要求
1.一种轮状病毒A组G3型检测用引物组，其特征在于，所述引物组 由下列引物组成正向外引物 F3-G3 ACTGAAGCAGCAACAGAA 反向外引物 B3-G3 ACATGTCCAGTTGCAGTG 正向内引物FIP-G3AGATCCTGTTGGCCATCCTTTAATAATTCATGGAAGGATACACTTTC 反向内引物 BIP-G3 TATTGCCTCGTTTTCAGTTGATCCGCGTCGTATTTCATTAATACCAA可以扩增轮状病毒A组G3型的VP7—基因库登录号D86272基因序列的307 位一505位的核酸序列的一部分或其互补链。
2.根据权利要求
1所述的一种轮状病毒A组G3型检测用引物组，其特征在于，所述引 物组可以扩增轮状病毒A组G3型的如下片段或互补链所述正向外引物F3-G3 扩增始于307-324bp ；所述正向内引物FIP-G3 扩增始于372-393bp的互补序列和332_;356bp ； 所述反向外引物B3-G3 扩增始于488-5(^bp的互补序列； 所述反向内引物BIP-G3 扩增始于417-440bp，和463_485bp的互补序列。
3.一种轮状病毒A组G3型检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利 要求1-2任意一项所述引物组的扩增反应液、酶。
4.根据权利要求
3所述的一种轮状病毒A组G3型检测用试剂盒，其特征在于，所述扩 增反应液中包括如下试剂
5.根据权利要求
4所述的一种轮状病毒A组G3型检测用试剂盒，其特征在于，所述扩 增反应液包含1/10预定反应体积IOXBst DNAPolymerase Buffer反应缓冲液、3. 6mM硫 酸镁、1. 6 μ M正向内引物FIP-G3、1. 6 μ M反向内引物BIP-G3、0. 2 μ M的正向外引物F3-G3、 0. 2μΜ的反向外引物B3-G3、1.4mM dNTP禾口 IM甜菜碱；所述酶包括储存液浓度每微升含8个活性单位、终浓度0. 32U/ μ 1的BstDNA聚合酶和储存液浓度每微升含20个活性单位、终浓度0. 4U/ μ 1的AMV反转录酶。
6.根据权利要求
3或4或5所述的一种轮状病毒A组G3型检测用试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模 板为1 IOOnM轮状病毒A组G3型基因组DNA。
专利摘要
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种轮状病毒A组G3型检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为轮状病毒A组G3型的VP7---基因库登陆号D86272，所述引物与所述靶基因的307位---505位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对轮状病毒A组G3型特定基因片段具有特异性的引物或引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在轮状病毒A组G3型特定基因片段，进而确定标本中是否存在轮状病毒A组G3型。
文档编号C12Q1/68GKCN101153342 B发布类型授权 专利申请号CN 200710030431
公开日2011年6月29日 申请日期2007年9月21日
发明者张丽荣, 张彩虹, 谭爱军, 魏泉德 申请人:珠海市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (1),