专利名称:志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对志贺氏 菌特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩 增法检测志贺氏菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病 率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测志贺氏菌的检测方法和检测试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种志贺氏菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所 述靶基因为志贺氏菌的ipaH-—GenBank登陆号M32063，所述引物与所述靶基因的 1095-—1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
本发明的另一个目的在于，提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物组。[0010]上述目的是通过如下技术方案实现的
一种志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成
正向外引物F3-ipa ATACCGTCTCTGCACGCA
反向外引物B3-ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC
正向内引物FIP-ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT
反向内引物BIP-ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT
可以扩增志贺氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095-—1299bp位的核酸序列的 一部分或其互补链。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述引物组还可以包括
正向环引物LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT
反向环引物LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测志贺氏菌的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的
一种志贺氏菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在志贺氏菌，其特征在 于，以志贺氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095—1299bp位的核酸序列的一部分或其互 补链为靶，通过LAMP法用上述引物或引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待 检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃 其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul 上清液做待检模板DNA;2)志贺氏菌的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约65°C条件下恒温保温约40-90分钟，然后置于80°C的 环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul IOOul)
权利要求
一种志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物F3 ipa ATACCGTCTCTGCACGCA反向外引物B3 ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC正向内引物FIP ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT反向内引物BIP ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT可以扩增志贺氏菌的ipaH基因 GenBank登陆号M32063，1095 1299bp位的特异性核酸序列。
2.根据权利要求
1所述的志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组还包括正向环引物 LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT反向环引物 LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG。
3.—种志贺氏菌的检测方法，该方法用于检测食品样品中是否存在志贺氏菌，其特征 在于，以志贺氏菌的ipaH基因序列的1095—1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链为 靶，通过LAMP方法用权利要求
1或2所述引物组选择性扩增所述靶基因，确认是否存在有 扩增产物。
4.根据权利要求
3所述的志贺氏菌检测方法，其特征在于，具体检测方法为1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品标本；细菌待检标本用相应肠道增 菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA 提取试剂盒提取模板DNA或加20 30 μ 1三蒸水煮沸5分钟，再取2 μ 1上清液做待检模 板 DNA ；2)志贺氏菌的环介导等温扩增取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20 μ 1 100 μ 1的反应体系，混勻点离后在约65°C条件下恒温保温约40-90分钟，然后置于80°C的 环境下2分钟灭活酶；反应总体积20 μ 1 100 μ 1的反应体系为
5.根据权利要求
4所述的志贺氏菌检测方法，其特征在于，所述扩增反应液还包括 正向环引物LF-ipa 0. 6-1. 0 μ M反向环引物 LB-ipa 0. 6-1. 0 μ Μ。
6.根据权利要求
5所述的志贺氏菌检测方法，其特征在于，当反应总体积为25μ 1时， 所述反应体系具体为
7. —种志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利要求
1或2 所述引物组的扩增反应液、酶；所述扩增反应液中包括如下试剂
8.根据权利要求
7所述的一种志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液 还包括正向环引物LF-ipa 0. 6-1. 0 μ M反向环引物 LB-ipa 0.6-1.0 μ Μ。
9.根据权利要求
8所述的一种志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，扩增反应液包含 1/10预定反应体积IOXBst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3· 6福硫酸镁、1. 6 μ M正 向内引物FIP-ipa、l. 6 μ M反向内引物BIP_ipa、0. 2 μ M的正向外引物F3-ipa、0. 2 μ M的反 向外引物B3-ipa.0.8uM正向环引物LF-opa、0.8uM反向环引物LB-ipa.I. 4mM dNTP禾口 IM 甜菜碱；所述酶为每微升含8个活性单位，0. 32U/ μ 1的Bst DNA酶。
10.根据权利要求
8所述的志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴 性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为1 100mM志贺氏菌 基因组DNA。
专利摘要
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种志贺氏菌检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为志贺氏菌的ipaH---GenBank登陆号M32063，所述引物与所述靶基因的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在志贺氏菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在志贺氏菌。
文档编号C12Q1/04GKCN101153326 B发布类型授权 专利申请号CN 200710030435
公开日2011年3月23日 申请日期2007年9月21日
发明者张丽荣, 张彩虹, 谭爱军, 魏泉德 申请人:珠海市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (3),