专利名称：N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种N-乙酰-p-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，同时本发 明还涉及测定N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶活性浓度的测定方法，属于医 学检验测定技术领域。
背景技术：
N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是细胞内溶酶体的一种酸性水 解酶。研究结果表明，人体液(血液、尿液)中NAG活力的大小可用作 多种疾病的有效辅助诊断指标，检测体液中NAG活力具有重要的临床 价值。NAG可作为肾损伤一个极为灵敏的指标，由休克引起急性肾功 能衰竭患者尿中极度增高，最高可达正常人的1200倍。急性肾小球肾 炎、肾病综合征，毒物或药物引起的肾毒性反应均可使NAG增加。肾 移植后，酶测定可用来判断有无排斥反应。病理性增高见于各种肾实 质性病变，肾移植排异反应，肾毒性药物使用过多。某些肾小球肾炎、 肾病综合征也有部分升高。
NAG活力的测定主要有荧光分光光度法和可见分光光度法。前者 因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜用作一般 医院的常规检验；后者已见报道的方法在各种实验条件的选定上虽各 有千秋，但有的操作麻烦费时，有的所选定的条件或试剂稳定性欠佳， 难以满足临床检验要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法 (Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶 (还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定N-乙酰-卩-氨基葡萄糖苷酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该 方法的N-乙酰-(3-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以 在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行N-乙酰-卩-氨基 葡萄糖苷酶活性浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以 得到切实的推广应用。
本发明N-乙酰-p-氨基葡萄糖苷酶活性浓度测定方法原理如下 苯基-(3-乙酰氨基葡萄糖苷乙酰氨基葡萄糖苷酶石碳酸+
乙酰氨基葡萄糖苷 石碳酸+氧儿茶酚氧化酶苯醌(Quinone) +水
苯醌+还原型辅酶--^石碳酸+辅酶
这种方法应用N-乙酰-p-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2丄30; NAG; N-Acetyl-|3-glucoseaminidase)作为作用酶，功能为将苯基-P-乙酰 氨基葡萄糖苷酶解产生石碳酸。儿茶酚氧化酶(catechol oxidase EC 1.10.3.1)作为循环酶和还原型辅酶共同作用儿茶酚氧化酶的酶 促氧化作用产生苯醌(Quinone);还原型辅酶再将苯醌再次变回 石碳酸，使石碳酸不断地被重复循环利用，同时使还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收 峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通
过测量340nrn处吸光度下降的速度，可以测算出N-乙酰-(3-氨基 葡萄糖苷酶活性浓度。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
儿茶酚氧化酶 8000 U/L
苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷 12 mmol/L
本发明的N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶活性诊断试剂盒可以是单剂，包 括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、儿茶酚氧化酶、苯基-p-乙酰氨基 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成
液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷。
试剂2
缓冲液、稳定剂、儿茶酚氧化酶。 还原型辅酶、儿茶酚氧化酶、苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷在试剂1 或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷。
试剂3
缓冲液、稳定剂、儿茶酚氧化酶。
还原型辅酶、儿茶酚氧化酶、苯基-(3-乙酰氨基葡萄糖苷在试剂1 、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷 酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶诊断/测定试剂为单试剂， 包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
儿茶酚氧化酶 6000 U/L
苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷 12 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；
使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间1O分钟，起
始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样
品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方
法为速率法，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生
化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出N-
乙酰-p-氨基葡萄糖苷酶活性浓度的大小。
实施例二
本实施例的N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂为双试剂，包括
试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
苯基-|3-乙酰氨基葡萄糖苷 16 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
儿茶酚氧化酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃,反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测样品 与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出N-乙酰 -p-氨基葡萄糖苷酶活性浓度大小。实施例三
本实施例的N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 5Ommol/L还原型辅酶0.25mmol/L 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂50mmol/L
苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷 6mmol/L 试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100mmol/L 稳定剂50mmol/L
儿茶酚氧化酶6000U/L
50 mmol/L 6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶活性浓度时，在全自动生化分析仪 上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品与试剂l、试剂2、试剂3 的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为 速率法，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出N-乙酰 -p-氨基葡萄糖苷酶活性浓度的大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化 分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外 源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性浓度测定方法，其方法原理如下苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷 乙酰氨基葡萄糖苷酶石碳酸+ 乙酰氨基葡萄糖苷石碳酸+氧 儿茶酚氧化酶 苯醌(Quinone)+水苯醌+还原型辅酶→石碳酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性浓度大小测定结果。N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.30；NAG；N-Acetyl-β-glucoseaminidase)作为作用酶，功能为将苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷酶解产生石碳酸。儿茶酚氧化酶(catechol oxidase EC 1.10.3.1)作为循环酶和还原型辅酶共同作用儿茶酚氧化酶的酶促氧化作用产生苯醌(Quinone)；还原型辅酶再将苯醌再次变回石碳酸，使石碳酸不断地被重复循环利用，同时还原型辅酶不断地氧化成辅酶，在340nm波长下发生吸光度下降，从而可以测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性浓度。 还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
2. —种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 40——500 mmol/L稳定剂 1——50 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L儿茶酚氧化酶 200——50000 U/L苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷 2—~"20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述N-乙酰-卩-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特 征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、儿茶酚氧化酶(catecho1 oxidase EC 1.10.3.1 )、苯基-卩-乙酰氨基葡萄糖苷组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述N-乙酰-卩-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷、儿 茶酚氧化酶(catechol oxidase EC 1.10.3.1)组成双剂试剂；试剂1 ， 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、苯基-|3-乙酰氨基葡萄糖苷组成； 试剂2，由缓冲液、稳定剂、儿茶酚氧化酶组成。还原型辅酶、苯 基-P-乙酰氨基葡萄糖苷、儿茶酚氧化酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。
5. 根据权利要求2所述N-乙酰-卩-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、苯基-P-乙酰氨基葡萄糖苷、儿 茶酚氧化酶(catechol oxidase EC 1.10.3.1)组成多剂试剂；试剂1 ， 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 苯基-p-乙酰氨基葡萄糖苷组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、儿茶酚氧化酶组成。还原型辅酶、苯基-|3-乙酰氨基葡萄糖苷及儿茶酚 氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述N-乙酰-P-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特 征在于还包括稳定剂1—4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所 述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二 醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至 少一种。
全文摘要
本发明涉及一种酶循环扩增法的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、儿茶酚氧化酶、还原型辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度大小，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N21/78GK101173903SQ20061009733
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司