专利名称：Tcrp1基因在制备肿瘤细胞铂类耐药逆转剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地讲，涉及TCRPl基因在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的新用途。
背景技术：
自1967年发现顺钼(cisplatin )具有抗肿瘤活性以来，钼类金属抗肿瘤药物的合成、应用和研究得到了迅速的发展，目前其发展已经历了三代顺钼、卡钼和奥沙利钼。凭借其良好的疗效，钼类药物已被广泛应用于多种恶性实体肿瘤的一线治疗，如卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌等头颈部实体瘤，成为癌症化疗不可或缺的药物。据统计，在中国以钼类药物为主或有其参加配伍的化疗方案占所有化疗方案的70%-80%。但肿瘤细胞对钼类药物耐药性的产生常使化疗难以奏效并最终导致化疗失败。因此研究钼类药物耐药分子机制及寻找逆转耐药的靶点已成为目前肿瘤治疗研究中的一个焦点。肿瘤钼类耐药的产生是一个多因素参与的复杂过程，其耐药机制尚需进一步阐明。目前认为耐药的主要机制有1.胞内药物蓄积减少。包括胞内药物摄取减少和药物排出增多。如与摄取钼类药物相关的膜蛋白CTRl (copper transporter I)的表达降低；与药物排出相关的多药耐药蛋白，MDR、MRP2、ATP7A/7B等表达增高。2.活化减少，失活增加。一些内生的亲核物质，如谷胱甘肽，蛋氨酸和金属硫蛋白能与钼类药物结合导致其在体内失活。3. DNA修复能力增强。如DNA修复系统蛋白ERCCl、BRCA1/BRCA2的活性与钼类药物敏感性负相关。4.钼类药物对细胞损伤能力减弱。如p53基因的突变，导致细胞凋亡抑制，存活能力增强。5. DNA甲基化以及信号传导通路异常等。TCRPl (Tongue Cancer Resistance-associated Protein I )基因是本课题组前期在分析自主建立的多药耐药 细胞株人舌鳞癌细胞Tca8113/PYM (对平阳霉素、顺钼、奥沙利钼等耐药，耐药指数RI>18)与其亲本敏感细胞株Tca8113的cDNA芯片结果时，得到一个新的EST序列。通过利用生物信息学分析技术，申请人对这一个EST序列(GenBank ID:AL707095; UniGene Cluster ID:Hs475334)进行 Blast 延伸拼接分析，结合 PCR 扩增，得到一个全长cDNA序列，命名为TCRPl基因(NCBI提交号EF363480)。TCRPl 基因位于人类染色体 Ilql3. 4 (NCBI Human Genome Project database,Build37. 3)也命名为 FAM168A 或者 KIAA0280。其于 1996 被日本 Kazusa DNA ResearchInstitute报道为预测基因，命名为KIAA0280，但生物学功能一直不明。TCRPl在NCBIBuild 37.3中确定其mRNA全长为1834bp，共8个外显子，预测可转录编码235个氨基酸。
发明内容
本发明的目的是提供TCRPl基因作为肿瘤细胞钼类耐药逆转剂的新的应用，为肿瘤耐药机制提供新的资料，并且为抗肿瘤耐药药物的设计和筛选提供了新的靶点。具体的讲，我们利用RT-PCR和Western blot发现TCRPl在多种继发性钼类耐药细胞株(A549/DDP、COCI/DDP, Tca8113/PYM)表达相对于其亲本敏感细胞株升高，在肺癌原发性钼类耐药细胞株95D中也明显高于其他钼类敏感肺癌细胞株。进一步，我们发现利用SiRNA干扰技术，通过降低TCRPl的表达水平可逆转继发性和原发性耐药细胞株对钼类药物的反应，增强其对钼类药物(顺钼、奥沙利钼)的敏感性。因此首次提出TCRPl基因是肿瘤细胞耐药相关基因，主要为钼类耐药相关基因。另外TCRPl的siRNAs分子可作为肿瘤细胞钼类耐药逆转剂，在逆转肿瘤钼类耐药性中发挥重要作用。此外本发明还涉及该核酸分子TCRPl的抗体制备，包含TCRPl核酸分子的重组表达载体。发明保护了 TCRPl基因在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用，所述的TCRPl基因的序列如SEQ ID NO:1所不；
以及TCRPl多肽在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用，所述的TCRPl多肽的序列如 SEQ ID NO:2 所示；
以及TCRPl基因抑制剂在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用；
以及TCRPl基因的干扰siRNAs在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用。上述的干扰siRNAs的核苷酸序列如SEQ ID NO:3。上述的逆转剂为原发性肿瘤细胞钼类耐药逆转剂或继发性肿瘤细胞钼类耐药逆转剂。优选地，所述肿瘤细胞为实体瘤细胞。优选地，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞、卵巢癌细胞、和/或舌鳞癌细胞。作为优选的方案 ，所述肿瘤细胞为继发性钼类耐药细胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/DDP和舌癌Tca8113/PYM ;或原发性钼类肺癌耐药细胞株95D ；
优选地，钼类药物为顺钼和奥沙利钼。本发明的有益效果主要体现在
TCRPl不仅在钼类继发性耐药肿瘤细胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表达升高，也在原发性钼类耐药细胞株，如肺癌％D细胞中表达明显高于肺癌其他敏感细胞株。降低TCRPl基因的表达可增强细胞株对钼类药物的敏感性。该基因定位于人染色体llql3. 4，序列全才1834bp，开放读码框708 bp，编码235个氨基酸。本发明不仅为肿瘤耐药机制提供新的资料，而且为抗肿瘤耐药药物的设计提供了新的靶点。本发明的TCRPl基因可作为抗钼类耐药肿瘤药物的作用靶点，进行抗肿瘤耐药的设计和抗耐药肿瘤治疗。以这一基因为靶点，在基因水平上和蛋白水平上设计新的化学实体，避免肿瘤细胞钼类耐药的产生或者逆转已经产生的耐药性，从而提高治疗的疗效。
图1为继发性耐药肿瘤细胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/ DDP、舌鳞癌Tca8113/PYM、乳腺癌MCF7/5Fu，对顺钼耐药性的检测图，显示A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM继发性耐药细胞株，相对各自敏感细胞株A549、Cocl、Tca8113，对顺钼有强的耐药抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU对顺钼敏感，无耐药性。图2为继发性耐药肿瘤细胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/ DDP、舌鳞癌Tca8113/PYM、乳腺癌MCF7/5Fu，对奥沙利钼耐药性的检测图，显示A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM继发性耐药细胞株，相对各自敏感细胞株A549、Cocl、Tca8113，对奥沙利钼有强的耐药抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU对奥沙利钼敏感，无耐药性。图3为TCRPl在继发性耐药肿瘤细胞株中表达量；
A :TCRP1基因的实时定量PCR检测图，显示TCRPl在mRNA水平上，在顺钼和奥沙利钼耐药性强的继发性肿瘤耐药细胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表达水平高于各自敏感株，而在对顺钼和奥沙利钼无耐药性的MCF7/5FU中TCRPl的表达没有改变；
B: Western Blot检测图，显示TCRPl在蛋白水平上，在顺钼和奥沙利钼耐药性强的继发性肿瘤耐药细胞株A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM表达高于各自敏感株，而在对顺钼和奥沙利钼无耐药性的MCF7/5FU中TCRPl的表达没有改变。图4为siRNAs干扰TCRPl后可逆转继发性耐药肿瘤细胞株对钼类药物的敏感性；
A C0C1/DDP, A549/DDP 和 Tca8113/PYM 中 siRNA 干扰组(-sitcrpl)与对照组(-con)比较，干扰组对顺钼的药物敏感性增强；
B C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对顺钼的IC50值减小；
C C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对顺钼的药物敏感性增强；D C0C I/DDP, A549/DDP和Tca8113/PYM中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对顺钼的IC50值减小。图5为人肺癌先天性钼类药物耐药株的筛选；
A、B :显示人非小细胞肺癌细胞H1299、人非小细胞肺腺癌细胞H1975、人大细胞肺癌H460、人肺腺癌细胞SPC-A-1、人肺腺癌细胞LTEP-a-2、人小细胞肺癌H446、高转移肺癌95D、人肺鳞癌细胞SK-MES-1对顺钼的药物敏感性，表明肺癌95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1细胞对顺钼敏感性较其他细胞低；
C :不同肺癌细胞对顺钼的IC50值，其中肺癌高转移细胞9邪对顺钼的IC50值明显高于其他细胞；
D :肺癌％D和H1299细胞对奥沙利钼药物敏感性；
E :肺癌95D和H1299细胞对奥沙利钼的IC50值。图6为TCRPl在不同人肺癌肿瘤细胞株中表达量；
A :实时定量PCR检测图，显示在原发性耐药肺癌细胞株95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1中TCRPl在mRNA水平上表达高于其他敏感细胞株，其中％D细胞尤其明显；
B Western Blot检测图，显示原发性耐药肺癌细胞株95D，LTEP-a-2和SPC-A-1，SK-MES-1中TCRPl在蛋白水平上表达高于其他敏感细胞株。图7为siRNAs干扰TCRPl后可逆转原发性钼类耐药肺癌细胞株95D的敏感性； A :原发性耐药肺癌％D细胞中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对顺钼的药物敏感
性增强。而敏感肺癌H1299细胞中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对顺钼的药物敏感性无明显区别；
B :原发性耐药肺癌％D细胞中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对顺钼的IC50值减小。而敏感肺癌H1299细胞中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对顺钼的IC50值无明显区别；C :原发性耐药肺癌％D细胞中SiRNA干扰组与对照组比较，干扰组对奥沙利钼的药物敏感性增强。而敏感肺癌H1299细胞中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对奥沙利钼的药物敏感性无明显区别；
D :原发性耐药肺癌％D细胞中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对奥沙利钼的IC50值减小。而敏感肺癌H1299细胞中siRNA干扰组与对照组比较，干扰组对奥沙利钼的IC50值无明显区别。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此
实施例1 :细胞培养
A549 (人肺癌细胞系)，A549/DDP (A549细胞耐药亚株)，Cocl (人卵巢癌细胞系)，Cocl/DDP (Cocl细胞耐药亚株)，Tca8113 (人类舌鳞癌细胞系)，购自中国典型培养物保藏中心。Tca8113/PYM由本室诱导建立。采用4个剂量的平阳霉素(PYM) (1、2、5和l(^g/mL)反复间歇24 h或48 h暴露法处理舌癌细胞系Tca8113细胞，最后直到细胞能在含PYM100 ng/mL培养基中呈指数生长，得到耐药细胞系命名为Tca8113/PYM。
人肺癌肿瘤细胞系，SK-MES-1 (肺鳞癌细胞)，LTEP_a_2 (肺腺癌细胞)，SPC-A-1(肺腺癌细胞)，95D (高转移肺癌细胞)，NC1-H1299 (非小细胞肺癌细胞)，NC1-H1975 (肺腺癌细胞)和NC1-H446 (小细胞肺癌细胞)，NC1-H460 (大细胞肺癌细胞)购自上海中科院细胞库。SK-MES-1用含10%胎牛血清及1. OmM丙酮酸钠，O.1mM非必需氨基酸和1. 5g/L碳酸氢钠的DMEM培养，其余细胞均用含10%胎牛血清的RPM1-1640培养，置于37°C，5% CO2培养箱培养。实施例2 :细胞系耐药性分析
选取生长至对数期的培养细胞，弃去细胞培养液，1*PBS液漂洗2次，消化后制成细胞悬液，计数器计数以每孔1000-5000接种到96孔培养板中(180 μ I/孔)，37° C，5%C02培养箱中孵育至细胞贴壁。在96孔培养板中加入不同浓度药物(如顺钼，奥沙利钼)，每种浓度5孔，于37° C培养箱中孵育72h ;每孔加入MTS 20 μ I,混匀后孵育3小时，于酶标仪上检测490波长下各组OD值。计算平均细胞存活率(Survival Rate)，以药物浓度为横坐标，细胞存活率(Survival Rate)为纵坐标绘制回归曲线，并通过曲线计算IC50值。以上实验重复3次。结论继发性耐药细胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，相对各自敏感细胞株A549、CocU Tca8113，对顺钼和奥沙利钼有强的耐药抵抗性，而乳腺癌MCF7/5FU对顺钼和奥沙利钼敏感，无耐药性(如图1、2所示)。肺癌95D，LTEP-a-2和SPC_A_1，SK-MES-1细胞对顺钼敏感性较其他细胞低，其中肺癌高转移细胞％D对顺钼和奥沙利钼的敏感性明显低于于其他肺癌细胞(如图5所示)。实施例3 :实时定量PCR分析TCRPl在各细胞系中的表达
取生长至对数期的各种培养细胞，TRIZOL方法提取总RNA。DNaseI消化后，测量RNA.以 oligdT 为引物取等量的 RNA 按照 Fermentas 公司 Reverse Transcription System 程序逆转录成cDNA。以cDNA为模板，按照SYBGreen操作说明，用以下引物进行实时定量PCR扩增，TCRPl基因编码区引物
SEQ ID NO:6 Forward :5’-CCAATAGTCCCAGTTATGCTCCA-3’
SEQ ID NO:7 Reverse :5’-TGCTTGGTAAGTTCGGTTCTCG-3’
扩增片段为134bp GAPDH基因编码区引物
SEQ ID NO:8 Forward :5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3’
SEQ ID NO:9 Reverse :5’-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3’
扩增片段为156bp PCR 反应参数95°C 5min ；95°C 30sec, 59°C 30sec, 72°C 30min 共 40 个循环。70°C至95°C绘制溶解曲线。以上实验重复三次。以GAPDH为内对照，通过2_Λ 法计算各组之间目标基因TCRPl表达水平的差异；按照下列公式计算样本的相对表达量其中Λ ACt =Δ Ct 处理组一Λ Ct 对照组；Λ Ct = Ct TCRPl - Ct GAPDH ；
结论在继发性顺钼和奥沙利钼耐药细胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM中TCRPl的表达明显高于各自敏感细胞株A549、Cocl、Tca8113 ;而在对顺钼和奥沙利钼敏感的而乳腺癌MCF7/5FU细胞中，TCRPl表达无明显的改变(如图3A所示)。在原发性顺钼和奥沙利钼耐药肺癌细胞95D、LTEP-a-2、SK-MES-1中TCRPl的表达明显高于其他敏感肺癌细胞。表明TCRPl的表达与顺钼和奥沙利钼的耐药性成正相关(如图6A所示)。实施例4 :Western Blot分析TCRPl在各细胞系中的表达
取生长至对数期的培养细胞，用含蛋白酶抑制剂的新鲜细胞裂解液，裂解细胞提取总蛋白。用Bio-Rad公司Bradford方法测定蛋白浓度。按每个泳道加40Pg蛋白质计算细胞蛋白体积，按1:4的比例加5XSDS上样缓冲液将其溶解，100° C变性5min，立即置于冰上5min，短暂快速离心。上样后进行电泳，先在80V下电泳至溴酚蓝染料进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。Bio-Rad电泳仪120mV恒压进行70min蛋白质的电转移，使分离的蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上。滤膜用PBST溶剂配制的5%脱脂牛奶在室温下封闭2H。反贴法孵育一抗4H，一抗孵育后用PBST洗膜3次，每次15min。辣根过氧化物酶标记的抗兔及鼠二抗以1:4000稀释在5%脱脂牛奶中，室温孵育滤膜1H，PBST洗膜3次，每次15min。洗膜后进行ECL化学发光、X光片曝光并显影、定影，分析结果。结论在继发性顺钼和奥沙利钼耐药细胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM中TCRPl的蛋白表达水平高于各自敏感细胞株A549、Cocl、Tca8113 ;而在对顺钼和奥沙利钼敏感的而乳腺癌MCF7/5FU细胞中，TCRPl蛋白的表达无明显的改变(如图3B所示)。在原发性顺钼和奥沙利钼耐药肺癌细胞95D、LTEP-a-2、SK-MES-1中TCRPl的蛋白表达水平高于其他敏感肺癌细胞。表明TCRPl在蛋白水平上的表达与顺钼和奥沙利钼的耐药性也成正相关(如图6B所示)。实施例5 :筛选高效的干扰TCRPl的siRNAs片段
设计和合成针对TCRPl基因的瞬时干扰寡核苷酸序列三条 SEQ ID NO:3 5’ -AACCGAACUUACCAAGCAU-3，
SEQ ID NO:4 5’ -ACCCUAAGAACAUGGCCUA-3’
SEQ ID NO:5 5’ -AUGGCAACCCUAAGAACAU-3’按Lipofectamin2000说明书进行转染,步骤如下于转染前24小时接种细胞于六孔板，待细胞融合至60 80%时进行转染。将IOOpM siRNA溶于250 μ I无血清细胞培养基中混匀，5. O μ I Lipofectamin2000溶于另外250 μ I无血清细胞培养基中混匀，室温放置5min后将以上两者混合，总体积为500 μ 1，室温放置20min后将其加入待转染孔中，再加入1. 5ml无血清细胞培养基，置于37°C细胞培养箱中培养，5小时后更换成含血清细胞培养基，于细胞培养箱中继续培养。培养24小时后，提取细胞总蛋白验证siRNA干扰效果。结果SEQ ID NO: 3干扰序列，转染入各组细胞后其干扰效果显著。遂本实验皆采用SEQ ID NO:3处理细胞进行下一步研究。实施例6 :siRNA干扰TCRPl的表达可逆转继发性和原发性肿瘤细胞对顺钼和奥沙利钼的敏感性
用TCRPl的siRNA干扰序列SEQ ID NO: 3，按Lipofectamin 2000说明书进行转染继发性顺钼和奥沙利钼耐药细胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，或者原发性顺钼和奥沙利钼耐药肺癌细胞95D ;同时以转染干扰序列的相应的肿瘤细胞作为对照(Control);具体步骤如下于转染前24小时接种细胞于六孔板，待细胞融合至60 80%时进行转染。将IOOpM siRNA溶于250 μ I无血清细胞培养基中混匀，5. O μ I Lipofectamin2000溶于另外250 μ I无血清细胞培养基中混匀，室温放置5min后将以上两者混合，总体积为500 μ 1，室温放置20min后将其加入待转染孔中，再加入1. 5ml无血清细胞培养基，置于37°C细胞培养箱中培养，5H后更换成含血清细胞培养基，于细胞培养箱中继续培养。培养24H后，分析肿瘤细胞耐药性的改变。结果降低TCRPl在继发性耐药细胞A549/DDP、Cocl/ DDP、Tca8113/PYM，或者原发性耐药肺癌细胞95D的表达,可增强其 对顺钼和奥沙利钼的敏感性,逆转其对顺钼和奥沙利钼的耐药性。显示TCRPl的siRNA干扰序列可作为一个钼类药物耐药逆转剂(如图4、7所示)。发明所涉及的序列
权利要求
1.TCRPl基因在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用，所述的TCRPl基因的序列如SEQ ID NO:1 所示。
2.TCRPl多肽在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用，所述的TCRPl多肽的序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.TCRPl基因抑制剂在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用。
4.TCRPl基因的干扰siRNAs在制备肿瘤细胞钼类耐药逆转剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的干扰siRNAs的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
6.如权利要求1-4任意权利要求所述的应用，其特征在于所述的逆转剂为继发性肿瘤细胞钼类耐药逆转剂或原发性肿瘤细胞钼类耐药逆转剂。
7.如权利要求6任意权利要求所述的应用，其特征在于的肿瘤细胞为实体瘤细胞。
8.如权利要求6任意权利要求所述的应用，其特征在于的肿瘤细胞为肺癌细胞、卵巢癌细胞、和/或舌鳞癌细胞。
9.如权利要求6任意权利要求所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为继发性钼类耐药细胞肺癌A549/DDP、卵巢癌Cocl/DDP和/或舌鳞癌Tca8113/PYM ;或原发性钼类肺癌耐药细胞95D。
10.如权利要求1-4任意权利要求所述的应用，其特征在于所述的钼类药物为顺钼(cDDP)和奥沙利钼(L-OHP)。
全文摘要
本发明公开了一个自主克隆的新的人类肿瘤耐药相关基因——TCRP1,此基因与肿瘤化疗铂类药物的耐药产生有密切的关系。TCRP1不仅在铂类继发性耐药肿瘤细胞株Tca8113/PYM、A549/DDP、Coc1/DDP表达升高，也在原发性铂类耐药细胞株，如肺癌95D细胞中表达明显高于肺癌其他敏感细胞株。降低TCRP1基因的表达可增强细胞株对铂类药物的敏感性。该基因定位于人染色体11q13.4，序列全长1834bp，开放读码框708bp，编码235个氨基酸。本发明不仅为肿瘤耐药机制提供新的资料，而且为抗肿瘤耐药药物的设计提供了新的靶点。
文档编号C12N15/113GK103055326SQ20121055651
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者贺智敏, 谷依学, 郑国沛, 张志杰 申请人:广州医学院附属肿瘤医院