专利名称：N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定方法
技术领域：
本发明涉及一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.30；NAG；N-Acetyl-β-glucosaminidase)诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.30；NAG；N-Acetyl-β-glucosaminidase)活性的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是细胞内溶酶体的一种酸性水解酶。研究结果表明，人体液(血液、尿液)中NAG活力的大小可用作多种疾病的有效辅助诊断指标，检测体液中NAG活力具有重要的临床价值。NAG可作为肾损伤一个极为灵敏的指标，由休克引起急性肾功能衰竭患者尿中极度增高，最高可达正常人的1200倍。急性肾小球肾炎、肾病综合征，毒物或药物引起的肾毒性反应均可使NAG增加。肾移植后，酶测定可用来判断有无排斥反应。病理性增高见于各种肾实质性病变，肾移植排异反应，肾毒性药物使用过多。某些肾小球肾炎、肾病综合征也有部分升高。
NAG活力的测定主要有荧光分光光度法和可见分光光度法。前者因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜用作一般医院的常规检验；后者已见报道的方法在各种实验条件的选定上虽各有千秋，但有的操作麻烦费时，有的所选定的条件或试剂稳定性欠佳，难以满足临床检验要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，连续监测通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在505nm波长处吸光度的上升，得以测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定方法原理如下
这种方法应用N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶偶联过氧化物酶酶促反应连续监测法。N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶酶解苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷反应产生石碳酸，再通过(偶)联合过氧化物酶的作用，最终将无色的还原型色原氧化成红色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在505nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料——吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量505nm处吸光度上升的速度，得出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒较为理想 缓冲液 50mmol/L 稳定剂 50mmol/L 过氧化物酶 10000U/L 过氧化氢 2mmol/L 苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷 3mmol/L 还原型色原 5mmol/L 所述还原型色原(Chromogen)可以是下列二个中的任一个 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 4-氨基抗砒 本发明的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、过氧化物酶、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)、过氧化氢。
试剂2 缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化物酶。
苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、过氧化氢、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)。
试剂2 缓冲液、稳定剂、过氧化物酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷。
苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式 下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一 本实施例的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂为单试剂，包括 咪唑/盐酸缓冲液 50mmol/L 稳定剂 50mmol/L 过氧化物酶 10000U/L 过氧化氢 2mmol/L 苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷 3mmol/L 4-氨基抗砒 5mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2167。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
实施例二 本实施例的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂为双试剂，包括 试剂1 咪唑/盐酸缓冲液50mmol/L 稳定剂 50mmol/L 过氧化氢 2mmol/L 4-氨基抗砒 1mmol/L 试剂2 咪唑/盐酸缓冲液50mmol/L 稳定剂 50mmol/L 过氧化物酶 10000U/L 苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷 3mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值1750。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
实施例三 本实施例的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液50mmol/L 稳定剂 50mmol/L 过氧化氢 2mmol/L 试剂2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 50mmol/L 稳定剂 50mmol/L 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L 试剂3 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 50mmol/L 稳定剂 50mmol/L 过氧化物酶 10000U/L 苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷3mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长660nm，被测N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2583。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
权利要求
1.一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定方法，其方法原理如下
苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷 乙酰氨基葡萄糖苷酶石碳酸+
乙酰氨基葡萄糖苷
石碳酸+过氧化氢+还原型色原 过氧化物酶 吲嗒胺色原
或醌亚胺色原+水
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测505nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，得出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性大小测定结果。
还原型色原可以是3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒之一。
2.一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，主要成分包括
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-50mmol/L
过氧化物酶 500-500000U/L
过氧化氢 1-50mmol/L
苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷 0.2-10mmol/L
还原型色原 0.1-20mmol/L
其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液体试剂，直接使用。过氧化氢底物可以是化合物商品，也可以由葡萄糖氧化酶反应方法生成。生成方法为
葡萄糖+水 葡萄糖氧化酶 葡糖酸+过氧化氢
3.根据权利要求2所述N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于
由缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、过氧化物酶、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于
由缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、过氧化物酶、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、过氧化氢组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)、过氧化物酶组成。苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于
由缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、过氧化物酶、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、过氧化氢组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化物酶组成。苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、还原型色原(3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒)在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、苯基-β-乙酰氨基葡萄糖苷、过氧化氢、过氧化物酶、还原型色原、稳定剂及抗干扰剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在505nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的大小。
文档编号G01N21/78GK101173902SQ20061009733
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司