专利名称：多枝柽柳脱水诱导蛋白rd22基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种柽柳的脱水诱导蛋白基因。
背景技术：
目前，应用转基因技术改良植物的抗性已经成为共识，同时已经有各种基因获得专利的报道。柽柳抗旱、耐盐能力极强，说明其体内有一系列抗逆能力强的基因。因此，是进行抗性基因的良好材料。
进行基因的克隆技术是要确定所要克隆的目的基因，然后通过构建cDNA文库及EST分析、RT-PCR、酵母双杂交等技术获得所需基因的片段或全长，对基因片段，则应用RACE方法或cDNA文库筛选方法获得全长基因。
目前，基因工程技术中，抗旱植物的基因种类及数量非常有限，缺乏从高抗旱木本植物中克隆的基因；由于多数抗旱基因都是从非抗逆植物中克隆获得，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)等植物中获得，非抗旱植物的抗盐相关基因显然不可能具有强的抗盐性；而且，绝大多数抗旱相关基因是来自于草本植物、微生物等，由于它们与木本植物间的遗传差异，这些基因在木本植物中未必能十分有效。
发明内容
本发明的目的是克隆出一种抗盐能力极强的木本植物柽柳的一种盐、旱胁迫应答基因-多枝柽柳(Tamarix ramosissima)脱水诱导蛋白RD22基因，这种抗逆相关基因可以用于科研与生产中，用于其详细的抗性机理等方面的研究，并通过转基因技术来培育抗逆植物新品种。本发明的多枝柽柳脱水诱导蛋白RD22基因具有如序列表所表示的编码区核酸及氨基酸序列。柽柳广泛分布于我国西北地区的干旱、盐渍化荒漠中，是荒漠地区盐渍化沙地上良好的固沙造林树种，具有强的抗盐、旱胁迫，耐高温等特性(张道远.张娟.谭敦炎.潘伯荣.国产柽柳科3属6种植物营养枝的解剖观察，西北植物学报，2003，23(3)382～388)，有强的泌盐能力(张道远.尹林克.潘伯荣.柽柳泌盐腺结构、功能及分泌机制研究进展西北植物学报2003，23(1)190-194)，因此，它是一种进行植物抗盐研究的理想材料。本发明通过克隆出抗盐能力极强的木本植物柽柳的一种盐、旱胁迫应答基因—脱水诱导蛋白RD22基因，然后，通过Northern检测和基因芯片技术检测其在旱或盐胁迫下表达情况，分析它是否与抗旱或抗盐相关。本发明的基因编码区长1170bp，编码389个氨基酸。经序列同源性BlastX分析表明，该基因与其它物种的脱水诱导蛋白基因在序列上有明显差异，与金华中棉(Gossypium arboreum)脱水诱导蛋白序列同源性最高，为46％，这说明该基因在序列上与其他物种的脱水诱导蛋白基因有明显差异。应用Northern和基因芯片技术研究脱水诱导蛋白RD22基因在旱胁迫后的表达，结果发现，旱胁迫下该基因表达量增加3倍以上，为抗旱相关基因。该基因具有明显的抵抗干旱的能力，对植物起到脱水保护作用。构建植物表达载体ProkII中，转化到烟草中，发现转基因烟草与对照相比具有明显的抗旱效果，转基因烟草可以在-45Kp左右的水势下能够正常生长6天以上，而非转基因烟草则出现枯萎现象，说明它有明显的抗旱能力。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式是这样实现的(一)提取柽柳的总RNAa、向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(w/v)CTAB，NaCl 1.4mol/L，四硼酸钠0.025mol/L，pH＝9)和10％(V/V)β-巯基乙醇得到提取液，65℃水浴锅中预热5分钟；b、将柽柳材料用液氮冷却研磨，加入到提取液中，混匀，65℃水浴10分钟；c、加入等体积的Tris酚/氯仿混合液，12000g离心5分钟，取上清液，重复酚/氯仿抽提一次；d、向上清液中加入等体积氯仿，12000g离心5分钟，取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴放置3小时；e、15000g，4℃离心15分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用；f、用Promega公司的mRNA分离试剂盒(PolyATtract mRNA IsolationSystem III)分离mRNA取mRNA 5ug用于构建柽柳cDNA文库，cDNA文库构建试剂盒为ZAP-cDNA Synthesis Kit and ZAP-cDNA GigapackIII GoldCloning Kit(Stratagene公司生产，其产品号为200450)，所建立的柽柳cDNA文库滴度为7.2×105pfu，重组率为98％；g、用PCR法检测文库克隆插入片段长度在1kb左右；(二)对文库克隆进行测序
然后对文库克隆进行测序，测序引物为T3引物，cDNA文库克隆的测序仪为Amersham Pharmacia公司的MegaBACETM1000 DNA序列分析仪。通过对文库克隆的Blast X分析获得脱水诱导蛋白RD22基因的片段，该片段长度为691bp，具有完整的3’端，但5’端不完整，序列如下＞脱水诱导蛋白RD22部分序列5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTTATTTAAGTAAACGAAAGTATCTTTTTATTCGCAAATGAAACGTACAGTAATATTATGCATCAGGCGAGTGTATATGACACGCGTATATGTCTGCCGTAGCGAAGCAAACGATACAAGCATCTTCATGTAGCAGTATAGTATAGTAGCTAGAGTACCGCTGCATACATTAATTCCACACAAGAAGTGTGGAGAGAAATTCAAAATACTAGTAGCTAGTGCATCAATCAAACAGCACCAAAATCAAGTGAACGCATGCATGGTGGAGAAATCCAACTCTGTAACTAGTAATGCGGCACCCACACAACATGATCTTGAGGAAGGAAGTGACACACGGGAACCGTCCCAGGTTCCACCTTAAGCACTTGAAAAGCCAAGTGCTTAGGATTCCACTCGGACGTATCCTTATGGCAGACGGCCTCAGCATTCACTTTCTTCCCATCCTTCTCACCTACCATCTCAACCTCGTACGAAGCCGTATTCCTCGTCTCGTGGCAGTAAAACACGGCATATGCATAATTCTGCTTGTGGCACACCACCGCATGATCGTCCTTGTTGTTGTTCTTTCTCACTCTCTTCATGGTATACTTTTGTGCCTCGCTTCCTTTCCCGGTGGTTACCTCAG 3’。
根据上面获得的已知的基因序列设计5’RACE引物5’TACGAAGCCGTATTCCTCGTCTCGTGGC 3’，然后通过5’RACE技术获得完整的基因。
用RACE试剂盒(RACE克隆试剂盒为SmartTMRACE cDNAAmplificationKit(BD Biosciences公司))进行克隆全长cDNA序列，用1μg总RNA进行反转录，具体所用的试剂及操作步骤均严格参照按试剂盒说明书，反转录后将反转录溶液用TE缓冲液(试剂盒提供)稀释到100μL，PCR反应体系严格参照试剂盒说明书，PCR反应使用改动的降落PCR(touchdown PCR)程序，具体PCR程序为94℃预变性1min，94℃ 6sec，72℃ 3min 6个循环，94℃6sec，70℃ 12sec 72℃ 3min 5个循环，94℃ 6sec，68℃ 12sec 72℃ 3min 30个循环，72℃保温7min。扩增后的片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌Jm109，将插入片段与目的片段大小相符合的克隆进行测序。测序结果如下
5’GCTACTTTAGTACTACCATATACCACCACCAACTGTCAGCCACTAAAATTTCAGTGTTGTTCGATCTTATATCTTCAGAGCATAATTTTTCACCAATGGAGTTGCGTCTCCTACCAATCATCACCTTCTTCTCTGTGGTTCTTGTGGTTAGCCATGCGGCTGCATCACCTGAAGATTACTGGAAGAAAGTGCTGCCCAACACTCCTATGCCAGGAGCTGTCAGGGACTTTCTGCAACCTGCAGAATGGACCGAAGACAAGAGCACTTCTGTGGGAGTAGGCAAAGGCGGAGTTAATGTCGACACAGGCGGCGACAGACCCCAGGGCAAAGGCACCGACGTCAACGTTGGCCACGGCAACGTCGAGGTCCACACCAACAAACCTAACAAGGGCGGGGCAGACGTAAACGTAGGCCGAAAAGGCGGGGTGGGAGTGAATGCTGGAAAGGCCGGAAAAGGCGCCCAAGTCGGTGTTGGAAAGGGCGGAGTATCGGTCCACGCTGGACCGAAGAAAAAGCCCGTCGTTGTGGGAGTAAAGCCTACAAGTAACCCATTTATGTACAAATACGCAGCAACCGAGACCCAGCTTCATGACGACCCAAACGTTGCCTTGTTTTTCCGAGAGGAAGATCTTAAACCCGGTAAATCAATGAACCTCCACTTTATGAGGACCACCAACGAAGGGTCCACATTTCTAAGCCGCAAGGAGGCAGAATCGATCCCGTTCTCGACCCAAGAGATGCCAGAGATCCTAGCCCGGTATGACATCAGGCCCGAGTCCGAAGAGGCCCGAGTGATGAAGCACACGGTCGAGGACTGCGAAGACAAGGGAATCGAAGGAGAAGACAAGTACTGCGCCACTTCACTAGAAGGCATGGTAGACTACGCCGTATCAAAGCTAGGGAAACACGTCAAGGCTGGCTCTACTGAGGTAACCACCGGGAAAGGAAGCGAGGCACAAAAGTATACCATGAAGAGAGTGAGAAAGAACAACAACAAGGACGATCATGCGGTGGTGTGCCACAAGCAGAATTATGCATATGCCGTGTTTTACTGCCACGAGACGAGGAATACGGCTTCGTA 3’用NCBI的Align two sequences程序对原序列和RACE获得的序列进行拼接，将拼接后应用ORF FOUNDER寻找开放读码框，将开放读码区的推导氨基酸序列进行BLASTP相似性比较，该基因编码区长1170bp，编码389个氨基酸。经序列同源性BlastX分析表明，该基因与其它物种的脱水诱导蛋白基因在序列上有明显差异，与金华中棉(Gossypium arboreum)脱水诱导蛋白序列同源性最高，为46％，这说明该基因在序列上与其他物种的脱水诱导蛋白基因有明显差异。
应用Northern和基因芯片技术研究脱水诱导蛋白RD22基因在旱胁迫后的表达，结果发现，旱胁迫下该基因表达量增加3倍以上，为抗旱相关基因。
<110>东北林业大学<120>多枝柽柳脱水诱导蛋白RD22基因<160>1<210>1<211>1170<212>DNA<213>多枝柽柳脱水诱导蛋白RD22基因编码区cDNA序列<400>11 atggagttgcgtctcctaccaatcatcaccttcttctctgtggttM E L R L L P I I T F F S V V46 cttgtggttagccatgcggctgcatcacctgaagattactggaagL V V S H A A A S P E D Y W K91 aaagtgctgcccaacactcctatgccaggagctgtcagggactttK V L P N T P M P G A V R D F136 ctgcaacctgcagaatggaccgaagacaagagcacttctgtgggaL Q P A E W T E D K S T S V G181 gtaggcaaaggcggagttaatgtcgacacaggcggcgacagacccV G K G G V N V D T G G D R P226 cagggcaaaggcaccgacgtcaacgttggccacggcaacgtcgagQ G K G T D V N V G H G N V E271 gtccacaccaacaaacctaacaagggcggggcagacgtaaacgtaV H T N K P N K G G A D V N V316 ggccgaaaaggcggggtgggagtgaatgctggaaaggccggaaaaG R K G G V G V N A G K A G K361 ggcgcccaagtcggtgttggaaagggcggagtatcggtccacgctG A Q V G V G K G G V S V H A406 ggaccgaagaaaaagcccgtcgttgtgggagtaaagcctacaagtG P K K K P V V V G V K P T S
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权利要求
1.多枝柽柳脱水诱导蛋白RD22基因，其特征在于该基因的编码区cDNA序列为5’atggagttgcgtctcctaccaatcatcaccttcttctctgtggttcttgtggttagccatgcggctgcatcacctgaagattactggaagaaagtgctgcccaacactcctatgccaggagctgtcagggactttctgcaacctgcagaatggaccgaagacaagagcacttctgtgggagtaggcaaaggcggagttaatgtcgacacaggcggcgacagaccccagggcaaaggcaccgacgtcaacgttggccacggcaacgtcgaggtccacaccaacaaacctaacaagggcggggcagacgtaaacgtaggccgaaaaggcggggtgggagtgaatgctggaaaggccggaaaaggcgcccaagtcggtgttggaaagggcggagtatcggtccacgctggaccgaagaaaaagcccgtcgttgtgggagtaaagcctacaagtaacccatttatgtacaaatacgcagcaaccgagacccagcttcatgacgacccaaacgttgccttgtttttccgagaggaagatcttaaacccggtaaatcaatgaacctccactttatgaggaccaccaacgaagggtccacatttctaagccgcaaggaggcagaatcgatcccgttctcgacccaagagatgccagagatcctagcccggtatgacatcaggcccgagtccgaagaggcccgagtgatgaagcacacggtcgaggactgcgaagacaagggaatcgaaggagaagacaagtactgcgccacttcactagaaggcatggtagactacgccgtatcaaagctagggaaacacgtcaaggctggctctactgaggtaaccaccgggaaaggaagcgaggcacaaaagtataccatgaagagagtgagaaagaacaacaacaaggacgatcatgcggtggtgtgccacaagcagaattatgcatatgccgtgttttactgccacgagacgaggaatacggcttcgtacgaggttgagatggtaggtgagaaggatgggaagaaagtgaatgctgaggccgtctgccataaggatacgtccgagtggaatcctaagcacttggcttttcaagtgcttaaggtggaacctgggacggttcccgtgtgtcacttccttcctcaagatcatgttgtgtgggtgccgcattactag 3’。
全文摘要
多枝柽柳脱水诱导蛋白RD22基因，它属于基因工程技术领域。本发明通过克隆出抗盐能力极强的木本植物柽柳的一种盐、旱胁迫应答基因—脱水诱导蛋白RD22基因，然后，通过Northern检测和基因芯片技术检测其在旱或盐胁迫下表达情况，分析它是否与抗旱或抗盐相关。本发明的基因编码区长1170bp，编码389个氨基酸。经序列同源性BlastX分析表明，该基因与其它物种的脱水诱导蛋白基因在序列上有明显差异，与金华中棉脱水诱导蛋白序列同源性最高，为46％。应用Northern和基因芯片技术研究脱水诱导蛋白RD22基因在旱胁迫后的表达，结果发现，旱胁迫下该基因表达量增加3倍以上，为抗旱相关基因。
文档编号C12N15/29GK1624131SQ20041004403
公开日2005年6月8日 申请日期2004年11月10日 优先权日2004年11月10日
发明者杨传平, 刘桂丰, 王玉成, 姜静 申请人:东北林业大学