专利名称：新型组织型纤溶酶原激活物突变体及其生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域和蛋白质大规模纯化工艺领域。更具体地，本发明提供了一种新的组织型纤溶酶原激活物突变体(Reteplase Mutant，r-PAM)，和该新型r-PAM的生产方法，以及有关的工程细胞的构建、新型r-PAM的表达和纯化工艺。
背景技术：
组织型纤溶酶原激活蛋白(tissue-type plasminogcn activator，t-PA)是一种高效特异性的生理性溶血栓药物，属丝氨酸蛋白水解酶，为第二代溶栓剂。t-PA分子有5个功能区F、E、K1、K2、P，分别有不同的功能。它能选择性地将血栓上的纤维蛋白溶酶原变成纤维蛋白溶酶，从而使血栓溶解。但临床应用发现它存在几个明显的不足，如血管再栓塞、颅内出血及价格昂贵等。近年来通过对t-PA进行结构改造，已成功开发出了一些新型t-PA突变体，它们在延长体内半衰期、增强对血纤维蛋白的选择性和溶栓效力等方面均有较大改进。
组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(r-PA)是经基因工程改造的缺失突变体，它只有t-PA的K2区及P区，即只包含了天然t-PA的第1-3和176-527位氨基酸，共355个氨基酸，含有9对二硫键，而F区、E区和K1区缺失。K2区的存在使r-PA保存了t-PA的纤维蛋白特异性；缺失F区是使其血浆半衰期大大超过t-PA的关键。临床上主要用于脑栓塞、心肌梗塞等血栓病的治疗，其主要优点是减少了血浆清除率，延长了体内半衰期，降低了出血性等副作用，被认为是第三代安全、有效的溶栓药物。
国外上市产品都是大肠杆菌表达系统获得，大肠杆菌表达的r-PA为不溶性的包涵体，无活性。需通过体外变复性，获得有活性的单链多肽。由于r-PA分子内含有许多二硫键，很容易错配，因此给复性和纯化带来许多困难，导致最终得率小于1％。
我们对r-PA研究后作了点突变处理，得到了一种r-PA突变体(r-PAM)，并以毕赤酵母表达系统对此r-PAM进行表达研究。表达蛋白属于胞外分泌型，发酵上清可直接进行纯化，纯化后，得到的高活性的r-PAM纯品。因此纯化方便，得率高，工艺简单，生产成本低。这一点是大肠杆菌表达的r-PA无法相比的。
本发明提供了一种新型组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase Mutant(r-PAM)及其生产方法，采用新型毕赤酵母表达体系分泌表达该新型组织型纤溶酶原激活剂突变体，通过优化发酵与纯化工艺，整个过程稳定、快速、简便，获得活性高的新型组织型纤溶酶原激活剂。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新型组织型纤溶酶原激活物突变体。
本发明的另一目的就是提供该新型组织型纤溶酶原激活物突变体的生产方法，包括用于该方法的表达载体及工程细胞。
在本发明的第一方面，就是提供了一种新型组织型纤溶酶原激活物突变体(r-PAM)的氨基酸序列，其特征在于，其序列为A-B-C-D-E，其中A为组织型纤溶酶原激活物突变体(r-PA)的第1-76位氨基酸，B为r-PA第77和78位氨基酸中至少一个突变为非碱性氨基酸，C为r-PA第79-125位氨基酸，D为r-PA第126和127位氨基酸中至少一个突变为非碱性氨基酸，E为r-PA第128-355位氨基酸。
在另一优选例中，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一优选例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有上文所述的r-PAM编码序列。
在另一优选例中，所述的表达载体是pPICZαA/r-PAM-1。
在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求3所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的工程细胞是毕赤酵母。
在本发明的第四方面，提供了一种生产重组新型组织型纤溶酶原激活物突变体的方法，该方法包括步骤c)在适合的表达条件下，培养如权利要求5所述的宿主细胞，从而分泌表达出新型组织型纤溶酶原激活物突变体；d)分离纯化新型组织型纤溶酶原激活物突变体。
图1是重组质粒pPICZαA/r-PAM-1构建示意图。
图2r-PAM-1纯化样品非还原SDS-PAGE电泳图谱。1.非还原样品；M.蛋白分子量标准(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)。
图3重组r-PAM-1的Western-blot分析。A.SDS-PAGE考马氏兰染胶；B.Western-blot印迹膜；1.r-PA标准品(大肠杆菌表达)；2.r-PAM-1样品还原电泳；3.阴性对照；4.r-PAM-1样品非还原电泳。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过PCR随机突变r-PA cDNA，通过表达稳定性研究，获得了能在毕赤酵母细胞和其它酵母表达体系中稳定高效分泌表达的新型组织型纤溶酶原激活物突变体编码序列。在此基础上完成了本发明。
对组织型纤溶酶原激活物突变体基因(r-PA)的cDNA序列进行PCR随机点突变，获得r-PA突变体cDNA库。将cDNA库克隆到pPICZαA并转染毕赤酵母，或其它酵母宿主细胞，诱导后用纤维蛋白溶圈法，筛选到具有溶纤维蛋白活性的克隆。然后对筛选出的克隆施加不同浓度Zeocin，筛选抗Zeocin抗性最强克隆，进行诱导筛选，得到高表达菌株。进一步对高活性表达菌株进行r-PA突变体cDNA序列分析，发现其整合的序列编码的氨基酸序列其第77，78位及126，127位氨基酸残基部分或全部突变成非碱性氨基酸。为了尽可能减少氨基酸突变的数量，我们把第78、127位精氨酸突变成丙氨酸，再次转染酵母，获得一株高稳定表达的工程细胞，该工程细胞的表达量比上述细胞株的高1倍以上。
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。在本发明中，工程细胞表达的新型组织型纤溶酶原激活物突变体发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成(i)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等铵盐，浓度0-1.5％。
(ii)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg2+盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg2+盐0-5mM。
(iii)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。
(iv)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组甘油浓度为0.1-3％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-1.5％。
为大规模获得新型组织型纤溶酶原激活物突变体，需要在发酵罐中进行优化培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平可达到500mg/L。
在发酵表达新型组织型纤溶酶原激活物突变体后，对表达的r-PAM进行分离纯化。
通常，发酵样品先以离心、过滤等方式获得发酵液上清，去除菌体。发酵液上清可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
适用于本发明的层析技术包括疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
经过2-3步纯化，可得到r-PAM纯品，纯化得率30％以上，纯度95％以上，纯品得率约150mg/L发酵上清液。
纯化后r-PAM经活性测定，其比活约为5×105IU/mg。
在本发明的一个实例中，提供了组织型纤溶酶原激活物突变体基因点突变及表达质粒的构建。
在本发明的另一个实例中，通过筛选获得了稳定高效表达新型组织型纤溶酶原激活物突变体的菌株。
在本发明的另一个实例中，经过纯化工艺优化，可得到纯品150mg/L。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵上清液可获得新型组织型纤溶酶原激活物突变体纯品150mg。适合产业化生产。
本发明的优点在于(1)具有高稳定表达的特点。对组织型纤溶酶原激活物突变体基因序列进行了突变，并导入酵母表达载体pPICZαA，筛选得到高稳定性表达的新型组织型纤溶酶原激活物突变体基因。
(2)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平进一步提高。
(3)纯化工艺简便，回收率高。由于是分泌蛋白，因此简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模生产新型组织型纤溶酶原激活物突变体成为可能。
(4)采用毕赤酵母为工程细胞，很好地保持了组织型纤溶酶原激活物突变体的活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的“分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)”中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因突变及表达质粒的构建对组织型纤溶酶原激活物突变体基因(r-PA)的cDNA序列进行PCR随机点突变，获得r-PA突变体cDNA库。将cDNA库克隆到pPICZαA并转染毕赤酵母，或其它酵母宿主细胞，诱导后用纤维蛋白溶圈法，筛选到具有溶纤维蛋白活性的克隆。然后对筛选出的克隆施加不同浓度Zeocin，筛选抗Zeocin抗性最强克隆，进行诱导筛选，得到高表达菌株。
进一步对高活性表达菌株进行r-PA突变体cDNA序列分析，发现其整合的序列编码的氨基酸序列其第77，78位及126，127位氨基酸残基部分或全部突变成非碱性氨基酸。为了尽可能减少氨基酸突变的数量，我们把第78、127位精氨酸突变成丙氨酸，得到一个cDNA序列。这个序列以及所表达的相应蛋白，我们定名为rPAM-1。rPAM-1cDNA克隆到pPICZαA，再次转染酵母，获得一株高稳定表达的工程细胞。该工程细胞的表达量比上述细胞株的高1倍以上。
重组质粒构建线路如图1所示，将获得的点突变过的组织型纤溶酶原激活物突变体rPAM-1cDNA用XhoI+NotI双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳回收约1kb片段；同时将质粒pPICZαA进行同样的双酶切处理，回收大片段。将两个片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5α。小量制备质粒，通过酶切鉴定的方法筛选出含rPAM-1cDNA的阳性克隆。
实施例2高稳定表达新型组织型纤溶酶原激活物突变体的菌株的筛选将构建好的重组质粒pPICZαA/rPAM-1大量制备，线性化，电穿孔转化宿主细胞P.pastoris GS115，涂布含有不同浓度抗生素Zeocin的YPDS平板筛选高抗的阳性克隆，并进行小摇表达实验，筛选得到高稳定表达的工程酵母菌株，分析获得的高稳定表达的工程细胞，工程酵母菌株含有SEQ ID NO1序列，其编码SEQ ID NO2序列。
实施例3纯化工艺优化对发酵液进行超滤浓缩，将发酵液的缓冲体系替换为磷酸盐溶液(PB)。使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为10KD，超滤时留取浓缩液，加入PB，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平与pH和PB缓冲液相同。
层析1离子交换层析层析介质SP-Sepharose FF方法将超滤后的含r-PAM发酵液过柱。上样后用磷酸盐缓冲液洗涤层析柱，至OD280＜0.05。用0-1M NaCl梯度将目的蛋白洗脱。
层析2分子筛层析层析介质Sephacryl S200缓冲液磷酸盐缓冲液离子交换得到的rPAM-1样品峰上样后，用PB溶液恒速过层析柱，收集含活性的蛋白峰。
样品经过此三步纯化，即超滤，阴离子交换层析、凝胶过滤层析以后，纯度提高至95％以上，可得纯品150mg/L。
rPAM-1纯化后样品非还原SDS-PAGE电泳图谱见图2。
采用大肠杆菌表达的r-PA做对照。用鼠抗重组人纤溶酶原激活剂一突变体抗体对产品进行Western-Blot免疫印迹试验，见图3。结果表明r-PA对照品和rPAM-1都能被鼠抗重组人纤溶酶原激活剂一突变体抗体识别。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120>新型组织型纤溶酶原激活物突变体及其生产方法<160>2<210>1<211>1068<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(1068)<223>新型组织型纤溶酶原激活物突变体序列<400>1tcttaccaag gaaacagtga ctgctacttt gggaatgggt cagcctaccg tggcacgcac 60agcctcaccg agtcgggtgc ctcctgcctc ccgtggaatt ccatgatcct gataggcaag 120gtttacacag cacagaaccc cagtgcccag gcactgggcc taggcaaaca taattactgc 180cggaatcctg atggggatgc caagccctgg tgccacgtgc tgaagaaccg cgccctgacg 240tgggagtact gtgatgtgcc ctcctgctcc acctgcggcc tgagacagta cagccagcct 300cagtttcgca tcaaaggagg gctcttcgcc gacatcgcct cccacccctg gcaggctgcc 360atctttgcca agcacagggc ttcgcccgga gagcggttcc tgtgcggggg catactcatc 420agctcctgct ggattctctc tgccgcccac tgcttccagg agaggtttcc gccccaccac 480ctgacggtga tcttgggcag aacataccgg gtggtccctg gcgaggagga gcagaaattt 540gaagtcgaaa aatacattgt ccataaggaa ttcgatgatg acacttacga caatgacatt 600gcgctgctgc agctgaaatc ggattcgtcc cgctgtgccc aggagagcag cgtggtccgc 660actgtgtgcc ttcccccggc ggacctgcag ctgccggact ggacggagtg tgagctctcc 720ggctacggca agcatgaggc cttgtctcct ttctattcgg agcggctgaa ggaggctcat 780gtcagactgt acccatccag ccgctgcaca tcacaacatt tacttaacag aacagtcacc 840gacaacatgc tgtgtgctgg agacactcgg agcggcgggc cccaggcaaa cttgcacgac 900gcctgccagg gcgattcggg aggccccctg gtgtgtctga acgatggccg catgactttg 960gtgggcatca tcagctgggg cctgggctgt ggacagaagg atgtcccggg tgtgtacacc 1020aaggttacca actacctaga ctggattcgt gacaacatgc gaccgtga 1068<210>2<211>355<212>PRT<213>智人
<400>2Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg1 510 15Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser20 25 30Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala35 40 45 50Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys55 60 65Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Ala Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp70 75 80 85Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe90 95 100Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala105 110 115Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Ala Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly120 125 130 135Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln140 145 150Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg155 160 165 170Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val175 180 185His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln190 195 200Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr205 210 215220Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu225 230 235
Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg240 245 250 255Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln260 265 270His Leu Leu Asn Arg Thr Vsl Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr275 280 285Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser290 295 300 305Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile310 315 320Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr325 330 335 340Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro345 350 35权利要求
1.一种编码新型组织型纤溶酶原激活物突变体(r-PAM)的核苷酸序列，其特征在于，其编码的氨基酸序列为A-B-C-D-E，其中，A为组织型纤溶酶原激活物突变体(r-PA)的第1-76位氨基酸；B为r-PA第77和78位氨基酸中至少一个突变为非碱性氨基酸；C为r-PA第79-126位氨基酸；D为r-PA第126和127位氨基酸中至少一个突变为非碱性氨基酸；E为r-PA第128-355位氨基酸。
2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，它是一种酵母表达载体。
4.一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的工程细胞，其特征在于，它是毕赤酵母。
6.一种新型组织型纤溶酶原激活物突变体的生产方法，其特征在于，该方法包括步骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求5所述的工程细胞，从而分泌表达出新型组织型纤溶酶原激活物突变体；b)分离纯化出表达的新型组织型纤溶酶原激活物突变体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)所示的表达条件为诱导时间为12-120小时，较佳的为24-100小时；诱导pH为3-9，较佳的为5-7。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)所示的表达条件为(1).发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液；(2).通过简单的离子交换层析、分子筛层析等简单步骤，即可获得纯度在95％以上的纯品。
全文摘要
本发明提供了一种新型组织型纤溶酶原激活物突变体，及稳定生产该新型组织型纤溶酶原激活物突变体的方法，以及有关的表达载体与工程细胞构建、表达和纯化的工艺。突变后的组织型纤溶酶原激活物突变体基因在毕赤酵母中分泌表达非常稳定，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高了表达量和纯化得率，具有稳定性好、表达水平高、活性高、生产工艺简便的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得新型组织型纤溶酶原激活物突变体纯品。
文档编号C12N15/63GK1958798SQ200510030960
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月2日 优先权日2005年11月2日
发明者孙九如, 任军, 黄阳滨, 张翊, 顾小伟, 黄智华, 蒋剑, 杜碧金 申请人:上海新生源医药研究有限公司