专利名称：利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法
技术领域：
本发明属于植物品种改良及育种技术领域，涉及利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法。
背景技术：
目前，植物基因克隆技术有以下几种1)序列克隆，即根据已知基因的序列克隆植物基因的方法，利用此方法已经克隆了豌豆外源凝集素基因，酵母超氧化物歧化酶基因、水稻富硫10KD醇溶蛋白基因；2)表达产物克隆，即根据植物基因表达的产物RNA和蛋白质克隆基因，许多种于贮藏蛋白基因、激素或环境胁迫诱导表达基因；3)表型差异克隆，即根据植物表型差异或组织器官特异表达产生的差异克隆植物基因，包括转座于标签和T-DNA标签技术以及“鸟枪”克隆。“鸟枪”克隆法是随机切割供体基因组DNA，再转化到受体基因组中，根据对转化子的表型鉴定，找出所需克隆的基因，“鸟枪”克隆战略已成功地应用干分离细茵的无毒基因。但由于高等植物基因组很大，应用此方法克隆基因十分困难。如，将此方法应用于番茄的抗病基因筛选时，需要以双元载体构建抗病品种的基因文库，然后通过农秆菌等将它们导入感病品种之中，由此鉴定的一个单拷贝基因，需要筛选大量转基因植株，需要建立高效转化和再生植株技术平台，耗材费时；4)定位克隆，即根据连锁图谱定位克隆植物基因，如番茄对丁香假单胞菌抗性基因pto基因、拟南芥的抗细菌病基因RSPZ基因、水稻抗白叶枯病基因Xa21基因的成功克隆；5)测序克隆，即通过测定DNA的序列克隆基因，如目前广泛应用转座子标签和T-DNA标签技术构建突变体库的克隆技术以及定位克隆技术等。
常规基因克隆技术不适合于野生稻有利基因的发掘和利用。我国纬度跨度大，生态环境多样，拥有丰富的生物基因资源，包括野生稻资源。野生稻由于长期处于野生状况，经受各种灾害和不良环境的选择，具有对各种病虫害的抗性和各种逆境的适应性，如抗病、抗虫、耐寒、耐旱、耐盐碱、耐淹、耐荫以及高产、优质、雄性不育、磷钾高效利用等。30年代，中国农科院首任院长丁颖教授利用野生稻培育出了“中山一号”水稻品种，其优势种质被利用了整整半个世纪。70年代，杂交水稻之父袁隆平利用野生稻“野败”不育株开创了三系杂交水稻先例，使水稻产量大幅度提高。因此，利用现有的野生植物资源挖掘优异基因，创造新型种质，培育综合性状良好和/或具有特殊整合性状如超高产、特殊用途的品种，已成为新世纪农业生物工程科技创新的首要目标。然而，野生稻基因组基础研究还处于起步阶段，由于其遗传杂合性及多为多倍体等原因，尚未获得遗传图谱、物理图谱、序列图谱和表达图谱。因此，应用常规技术对野生稻进行基因克隆和功能研究受到限制，技术上存在诸多局限与缺点1.野生稻遗传背景薄弱，大多没有建立高密度的遗传图谱，因此，利用图位克隆技术分离基因很困难。
2.标签技术依赖于转座子系统、高效转基因技术体系的建立以及转基因突变体的筛选等，而野生稻的组织培养再生体系大多不完善，较栽培稻难度大，并且由于野生稻是天然的杂合体，后代存在分离，也影响着突变体的筛选，因此，标签技术尚未应用于野生稻的基因克隆。
3.由于表达产物、序列分析等克隆策略都不适合野生稻功能基因的发掘、利用，因此，对野生稻进行大规模的功能基因组研究至今尚未启动。
综上所述，目前，野生稻有利基因资源的挖掘、利用还仅限于对AA基因组野生稻采用杂交转育的方式，故发掘、利用野生稻等植物基因宝库迫切期待新的技术与方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法，以克服现有技术存在的缺陷，从而大规模克隆植物有利基因，提供性状得到改良的转基因突变体植株并用于育种及品种改良。
为实现上述的目的，本发明方法包括如下步骤a.建立供体植物可转化大片断基因组文库；b.通过转基因技术将可转化大片断基因组文库导入受体植物，获得全基因组突变体库；c.通过对突变体库的筛选、鉴定和遗传分析，以及对大片段克隆的亚克隆、序列分析，克隆并获得控制突变性状的基因；d.对克隆的控制突变性状的基因进行测序和功能补偿分析。
上述步骤a中，利用双元细菌人工染色体载体(BIBAC)或可转化人工染色体载体(TAC)构建可转化大片段基因组文库。步骤b中的突变体库，可以直接利用步骤a中的基因组文库，或者利用步骤c中筛选的大片断克隆建库；步骤c中，主要根据某些已克隆基因的保守序列如抗性基因的NBS-LRR保守结构和分子标记，对步骤a中的基因组文库进行筛选，确定候选大片断克隆。涉及的转基因技术为农杆菌介导、基因枪、花粉管通道、穗颈注射中的任何一种，将全基因组克隆和/或候选克隆导入栽培稻品种，待转化水稻材料为纯度好的常规稻和杂交稻亲本，构建全基因组基因敲入突变体库。步骤c中，首先采用抗生素筛选、PCR分析、报道基因GUS分析等方法鉴定阳性转基因植株，再按常规水稻田间管理方法规范种植阳性转基因植株和对照品种，以便于考察农艺性状，筛选变异植株和突变性状。步骤d中，对步骤c中筛选的变异植株所携带的大片断克隆进行测序分析，利用生物信息学技术，预测控制突变性状的基因。根据测序结果，将各编码区段亚克隆，对预测控制突变性状的基因进行补偿性测定实验，克隆控制突变性状的基因。
本发明的优点1.本发明利用可转化大片段基因组文库和全基因组基因敲入技术克隆近缘植物有利基因，不需要先具备该基因的表达产物、遗传图谱等，操作简便易行，特别适用于与栽培稻不能交配的野生稻有利基因的利用和分离克隆。
2.采用大片段基因文库，完成全基因组基因敲入所需的转基因植株数量少，容易建立突变体库；3.不需要对野生稻遗传背景有太高要求，如高密度遗传图谱等；4.在进行野生稻基因克隆的同时就获得了具有优良性状的育种材料，直接用于品种改良。
5.所克隆的基因来自栽培稻近缘种野生稻，对人体和环境无害，容易通过转基因安全性审定。
6.已克隆的基因或携带该基因的大片段克隆可以用于其它水稻品种和植物，迅速进行遗传改良。
图1为PCR扩增RSD130的结果。1，RSD130；2，阳性对照(Xa21基因)；M，1Kb Marker。
图2为载体PCR扩增结果。1载体BIBAC2；2RSD130；3阳性对照(Xa21基因)。
图3回收产物的电泳结果。MMarker；1，2，3，4分别从小到大4条回收产物。
图4回收产物再次PCR扩增结果。MMarker；1阳性对照；2，3，4，5分别从大到小4条回收产物再次PCR结果。
图5PCR回收克隆产物酶切鉴定结果结果。1单酶切；2为双酶切；3为酶切的质粒；M1Kb Marker。
图6转基因水稻的抗虫性鉴定。A对照品种；B转基因水稻。
具体实施例方式
实施例1利用抗性基因的保守序列筛选药用野生稻BIBAC可转化大片段基因组文库，对筛选出的候选大片段克隆进行测序和生物信息学分析，并通过遗传转化进一步进行功能补偿测定。
(1)野生稻BIBAC可转化大片段文库的筛选。
a.引物设计根据NBS-LRR类及STK类抗病基因保守区域设计并合成引物两对引物序列为RNL1F 5′-GGN GGN NTN GGN AAR ACN AC-3′，RNL1R 5′-AN NSH NARNGG NAR NCC-3′，RS1F 5′-TTY GGN RDN GTN TAY MRN GG-3′，RS1R 5′-AYNCC RWA NGA RTA NAY RTC-3′(混合碱基代码R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，H＝A/T/C，N＝A/T/G/C.)。
b.PCR筛选及阳性克隆分析反应混合物为10×PCR buffer，2.5μl；2.5mmol/L4种dNTP混合液，1.0μl；12.5μmol/L上、下游引物，各1.0μl；25mmol/L MgCl2，1.5μl；TaqDNA聚合酶，1.5单位；模板DNA，30ng；加ddH2O至25μl。PCR反应条件94℃预变性3分钟；94℃变性40″；45℃退火40″；72℃分钟，共进行40个循环；最后72℃延伸7分钟.
从野生稻可转化大片段基因组文库接种菌株到液体LB培养基中振荡培养12-16小时后提取质粒，利用设计的兼并引物进行PCR筛选。筛选到大片段克隆RSD130，能扩增出4条带(见图1)，最大片断约700bp。同时发现使用空载体作模板进行PCR扩增能得到除最大片断外的另3条带(见图2)。因此，可以推导有一个引物结合在载体上。将4条带回收(见图3)，并再次进行PCR扩增，发现每一条带均能扩增出包括自身在内的所有小带(见图4)。由此推导，最大的片断包含另外3条片断的序列，只需对最大片断作进一步分析。
c.PCR产物的克隆PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上用TAE电泳缓冲液电泳分离，片断回收用DNA Gel Extraction Kit(V-Gene公司)试剂盒，回收的PCR产物用pMD18-T Vector试剂盒(TaKaRa公司)连接。Cacl2法转化DH5a感受态细胞。涂布于含IPTG、X-Gal和Amp(60mg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取白色的菌落，并转接于LB培养液中振荡培养12-16小时后用碱裂解法抽提质粒DNA，用HindIII和Bam H酶切检测插入片断(图5)。
(2)候选大片段克隆的测序和生物信息学分析。
a.对克隆产物进行测序分析(测序公司为上海博亚公司)，1、采用测序，原始序列为GTAACGGCAACAATGGCCAAAAAGATTGCAAGCGTAAGCCCGAGGATCTGGTCGCCGCAATGTCAAACTACCAGCAGCAACGTCCACGTGTCAGCGCCTATGACAAGATCATGAACGCTCAATGCACATCTCATCCGAATCATAAACATGCAGCCAAGGACTGTTTCATCTACAAGCAATTCGCCGAGCACTACACGGCGCAACTTCAGAAACCGACTGACAGAGTCGGGACTTCAGGAACCAAGAAGGATGATGGAAATGACCACAGGACCGAGTTGAACCATATCTTCGGAGGACCACTCACCTACGTGTCGAAGCGAAAGCAGAAGTTGGCCGACAGAGAAATCAACGCAGTTCAGCCTGAAGTTCCACGTTACCTACGATGGTCGGAGGTGGCTATCACGTTTAACCGCTCGGATCACCCTGACCGAGTGGTTCACCCGGGGCGGTATTCCCTGGTATTAGACCCGGTTGTCCGTAATGTCAAGCTCAAGCATGTTCTCATTGATGGTGGCAGCGCTCTCAATATCCTCTTTGCCAAGATACTGGACGAGATGCAGATCCCAAGGTCTGAGTTAAAACCAAGTTTAGCCCCTTTTCATGGAGTTATTCCAGGGTAGTCTTCCCAACACCCCCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGTCGTCGCTGCGGCGAGCGGTTTCAGCTCACTCAAAGCGTATACCGTTATCCCAGATCAGGATACGCCAGAGA ACCTGTGACAAGGCCAGCAAGCCAGACCGTTAAAGGCCGGTGCTGGGCTTTCATGGTCCGCCCCTTGGCGACACAC去除载体(pMD 18-T Vector)后的序列结果为GGGGGTCTCGGGAAAACAACGGCAACGGTAACGGCAACAATGGCCAAAAAGATTGCAAGCGTAAGCCCGAGGATCTGGTCGCCGCAATGTCAAACTACCAGCAGCAACGTCCACGTGTCAGCGCCTATGACAAGATCATGAACGCTCAATGCACATCTCATCCGAATCATAAACATGCAGCCAAGGACTGTTTCATCTACAAGCAATTCGCCGAGCACTACACGGCGCAACTTCAGAAACCGACTGACAGAGTCGGGACTTCAGGAACCAAGAAGGATGATGGAAATGACCACAGGACCGAGTTGAACCATATCTTCGGAGGACCACTCACCTACGTGTCGAAGCGAAAGCAGAAGTTGGCCGACAGAGAAATCAACGCAGTTCAGCCTGAAGTTCCACGTTACCTACGATGGTCGGAGGTGGCTATCACGTTTAACCGCTCGGATCACCCTGACCGAGTGGTTCACCCGGGGCGGTATTCCCTGGTATTAGACCCGGTTGTCCGTAATGTCAAGCTCAAGCATGTTCTCATTGATGGTGGCAGCGCTCTCAATATCCTCTTTGCCAAGATACTGGACGAGATGCAGATCCCAAGGTCTGAGTTAAAACCAAGTTTAGCCCCTTTTCATGGAGTTATTCCAGGGTAGTCTTCCCAACACCCCC
b.将上述去载体(pMD 18-T Vector)后的序列提交到NCBI，使用BLAST程序对GenBanK基因库进行同源序列搜索，结果显示靶序列来源于水稻。与靶序列相似的基因序列号如下38344628；37534952；50931185；54287609；37532102；37533012；39546270；5902444；34913644；52353363；54291739；50920793；40882693；38346966；53982138；38347562；9988424；50932123；38344380；38346888；21741410；52353374；37532100；37532196；37531820；51451363；38346188；32480044；38347303；38344596；38344319；50300537；50931111；50900820；32488767；37536646；38344177；37531824；34896656；34906286；37532308；50932119；46485805；38346695；51038246；38567795；4680183；32488246；38344494；32488502；37537100；20303586；50931925；34896928；37530834；54291738；50582731；29788855；38345918；34015095；50932399；34896494；37532648；22725926；50582686；50878388；50900958；38347153；50932291；37532038；37535232；37533636；34902892；37532552；38346443；32492099；38567701；37533230；50900996；37991853；38345222；38347264；38344528；37530352；38345568；50399972；52353739；38346855；37533528；37534244；32482939；54287583；37532398；34015138；38346685；50920633；34015355；50511475；50920201；38346605c.接着使用BLASTx程序(因为目标是要找保守序列，而从蛋白质序列上更容易反映这一点，所以使用了BLASTx，以便将DNA序列翻译成氨基酸序列)，找出得分最高的100个相似序列，然后进行多序列比对，最后只取了家族关系最近的72条。并用Clustlw软件对这72条序列进行多序列比对以找到他们的共有序列。然后拿靶序列与共有序列进行比对，结果如下queryKDCKRKPEDLVAAMSNYQQQRPRVSAYDKIMNAQCTSHPNHKHAAKDCFIYKQFAEHYTAQLQKPTDRVGTSGTKKDconsKDRKRKPeELVATashsSRQRSrvNTfDKIMNsQCPHHPNSNHvAKdCFvYKQFaeQYTkttrKnsdeeqstsrkkdqueryDGN-------DHRTELNHIFGGPLTYVSKRKQKLADREINAVQPEVPRYLRWSEVAITFNRSDHPDRVVHPGRYSLVcons D-gDtpagFqDhRkELNHIFGGpIAYeSKRKqKLteREinaVQPdtPqyLrWSEialkFdrsDHPDrvVhPGrYPLVqueryLDPVVRNVKLKHVLIDGGSALNILFAKILDEMQIPRSELKPSLAPFHGVIPGSScons IdpvVrNvKLrRtLIDGGSaLNILFAkTLDdMQIPRsELkPSnaPFHGviPGIS说明query为靶序列(已经翻译成蛋白质)cons为同家族的共有序列下划线“——”标出了保守性的位点d.根据资料表明NBS-LRR类植物抗性基因序列有特有的结构(1)亮氨酸富集重复序列域(LRR)这一结构因亮氨酸在其中呈规律性重复而得名。LRR都具有“XLXXLXLXX”的结构。(2)核苷酸结合位点(NBS)NBS由三个区域组成，第一个区域为磷酸结合环(P-loop)，又称为激酶(kinase)la，作用是结合ATP或GTP的磷酸，其共有序列为GM(G/P)GXGK(a/T)(X为任意氨基酸，a为疏水氨基酸)。第二个区域为激酶2，共有特点是4个疏水氨基酸残基后紧跟一个不变的带负电的天冬氨酸，但在植物中，这一区域的两边还具有高度保守的氨基酸，共有序列为K(K/R)XaaaaDDV(W/D)。第三个区域为激酶3a，与DNA的嘌呤或核糖结合有关，通常含有一个精氨酸残基，其保守区为SraaaT(T/S)R.我们根据编码氨基酸位置的不同(考虑阅读框ORF的不同，分别从+1、+2和+3碱基开始阅读)在靶序列中寻找到这些特征结构，结果如下按照+1阅读框，RSD130的蛋白质序列为GGLGKTTATVTATMAKKIASVSPRIWSPQCQTTSSNVHVSAPMTRS*TLNAHLIRIINMQPRTVS STSNSPSTTRRNFRNRLTESGLQEPRRMMEMTTGPS*TISSEDHSPTCRSESRSWPTEKSTQFSLKFHVTYDGRRWLSRLTARITLTEWFTRGGIPWY*TRLSVMSSSSMFSLMVAALSISSLPRYWTRCRSQGLS*NQV*PLFMELFQGSLPNTP。
分析表明，具有NBS类型的Kinase I和Kinase II以及LRR的LXXL保守序列。
按照+2阅读框，RSD130的蛋白质序列为GVSGKQRQR*RQQWPKRLQA*ARGSGRRNVKLPAATSTCQRL*QDHERSMHISSES*TCSQGLFHLQAIRRALHGATSETD*QSRDFRNQEG*WK*PQDRVEPYLRRTTHLRVEAKAEVGRQRNQRSSA*SSTLPTMVGGGYHV*PLGSP*PSGSPGAVFPGIRPGCP*CQAQACSH*WWQRSQYPLCQDTGRDADPKV*VKTKFSPFSWSYSRVVFPTP。
分析表明，含有LRR的LXXL保守序列。
按照+3阅读框，RSD130的蛋白质序列为GSRENNGNGNGNNGQKDCKRKPEDLVAAMSNYQQQRPRVSAYDKIMNAQCTSHPNHKHAAKDCFIYKQFAEHYTAQLQKPTDRVGTSGTKKDDGNDHRTELNHIFGGPLTYVSKRKQKLADREINAVQPEVPRYLRWSEVAITFNRSDHPDRVVHPGRYSLVLDPVVRNVKLKHVLIDGGSALNILFAKILDEMQIPRSELKPSLAPFHGVIPG*SSQHP。
分析表明，含有NBS的KinaseIII型和LRR的LXXL及LXL保守序列。
e.与现有NBS-LRR序列比对，靶序列可能为一个新抗性基因。由于是根据NBS-LRR已公布的序列设计的简并引物，所以进一步分析了靶序列和NBS-LRR序列的同源性。首先从NCBI上检索到231条NBS-LRR序列，然后我们用Clustlw软件对这231条序列进行多序列比对及聚类分析，结果显示NBS-LRR的231条序列间存在差异，同源性很底，推断可能为新基因。
上述分析表明，用抗性基因保守序列的引物从RSD130扩增的序列具有抗病基因的NBS区域的激酶1(Ploop环)和激酶III型的保守序列，可能为一个新的抗病基因。
(3)候选大片段克隆的功能补偿鉴定。
上述候选RSD130可转化大片段克隆转化农杆菌LBA4404，采用农杆菌介导方法转化水稻品种台北309，获得转基因水稻植株(T0代)，并对T1代转基因水稻进行了人工饲喂稻褐飞虱试验(图6)。结果表明，转基因水稻表现出明显的抗性。
权利要求
1.一种利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法，其特征在于，包括如下步骤a.建立供体植物可转化大片断基因组文库；b.通过转基因技术将可转化大片断基因组文库导入受体植物，获得全基因组突变体库；c.通过对突变体库的筛选、鉴定和遗传分析，以及对大片段克隆的亚克隆、序列分析，克隆并获得控制突变性状的基因；d.对克隆的控制突变性状的基因进行测序和功能补偿分析。
2.根据权利要求1所述的利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法，其特征在于，供体植物可转化大片断基因组文库为双元细菌人工染色体库或可转化人工染色体库。
3.根据权利要求1所述的利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法，其特征在于，转基因技术选用农杆菌介导、基因枪、花粉管通道、穗颈注射中的任一种。
4.根据权利要求1所述的利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法，其特征在于，供体植物为野生稻，受体植物为栽培稻，也包括供体植物、受体植物为稻属以外的其它植物。
5.包括权利要求1所获得的全基因组突变体库。
6.包括权利要求1所克隆的控制突变性状的基因。
7.包括权利要求1所筛选的农艺性状得到改良的突变体在育种方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种利用全基因组基因敲入突变体库克隆近缘植物有利基因的方法，它包括构建自野生稻衍生的可转化大片断基因组文库，再通过农杆菌介导、基因枪、花粉管通道、穗颈注射等转基因技术，将大片段基因导入栽培稻中，建立栽培稻全基因组基因敲入突变体库，在构建突变体库前可根据保守序列、分子标记等对大片段克隆进行筛选，通过突变体抗虫、抗病等农艺性状的鉴定，筛选出控制突变性状的大片段克隆，大片段克隆再经亚克隆、功能补偿及序列分析后，最终鉴定、克隆出控制突变性状的基因。同时获得重要经济性状得到改良的转基因材料用于水稻品种改良。这一技术也适用于克隆其它植物有利基因。
文档编号C12N15/82GK1769443SQ20051003118
公开日2006年5月10日 申请日期2005年1月21日 优先权日2005年1月21日
发明者曹孟良, 辜显旺, 邢俊杰, 成志伟, 杨剑, 李亦群, 梁玲, 杨塞, 殷绪明, 张朝良, 袁隆平 申请人:湖南西城杂交水稻基因科技有限公司