专利名称：一种ldr技术的egfr突变检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及PCR技术和高温连接酶(LDR)技术检测试剂盒，特别涉及到特异性引物的多种PCR和多重LDR技术检测表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor, EGFR)常规突变检测的试剂盒。
背景技术：
肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤，男性肺癌占恶性肿瘤发病率的首位，女性肺癌仅次于乳腺癌据第二位。全球每年大约有1180000人死于肺癌。而在我国，肺癌的发病率也逐年上升,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung caner,NSCLC)占肺癌的80%,确诊时多为晚期。虽然手术、化疗、放疗技术在不断提高，但NSCLC患者的预后仍然很差，总体5年生存率仍然小于20%。近年来一些针对肿瘤特定分子靶点的抗肿瘤靶向药物显示了一些疗效，其中以表皮 生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)为革巴点的 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinasesin-hibitor, EGFR-TKI)吉非替尼(Gefitinib)在NSCLC的治疗中显示了一定的疗效。吉非替尼是一种低分子量的苯胺喹钠唑啉化合物，IDEALl和IDEAL2的II期试验结果显示其治疗晚期NSCLC有效，且副反应易于耐受。临床回顾性研究显示吉非替尼对不吸烟者、亚裔、女性、支气管肺泡癌或腺癌伴支气管肺泡癌分化患者有效。近年来研究发现EGFR基因突变等分子生物学因素与吉非替尼的疗效相关。综合文献中大量数据显示，Gefitinib在携带EGFR基因突变的NSCLC中的有效率是76.7%，有的文献提到的有效率甚至达到90%以上，而在野生型EGFR患者中只有
12.2%。因此EGFR突变是靶向药物治疗的一个必要前提条件。肺癌EGFR基因突变主要发生在外显子18-21区，最常见的突变包括19区缺失突变，20区片段插入和21区点突变，这三类突变占EGFR突变90%以上。外显子19区的碱基缺失主要是在第746-752位密码子的缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失，从而改变了细胞对TKLs的敏感性；20外显子碱基替换突变是引起耐药的主要原因；外显子21区的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。EGFR基因突变的检测方法通常是直接测序，但该方法步骤繁琐，试验周期长，对操作人员技术水平要求高，因此难以在临床大面积推广。更为重要的是测序技术本身灵敏度不高，只能检测15%以上的突变。而肿瘤组织是一个异质性的组织，EGFR突变又是一种杂合性突变，即EGFR基因DNA双链中有一条发生突变，而这种突变在检测样本中的比例小于15%，测序方法根本就无法检出。高温连接酶(LDR)技术是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。我们基于测序分型技术的LDR试剂盒是针对临床应用设计，填补了国内外基因分型及DNA多态性检测在临床分子诊测应用上的空白。与传统的直接测序法相比，LDR测序分型试剂盒有如下显著优势:
I)降低成本:测序反应的所有相关试剂完全由ABI或Beckman这样的大型国外企业掌握，试剂成本非常昂贵，而LDR技术则由于操作简单，试剂要求也非常简单，可大幅度降低成本。2)简化操作:直接测序法一般要经过PCR反应条件优化、PCR产物纯化、测序引物设计、测序反应化学类型选择等步骤，单是PCR产物纯化就是一个操作难点，而应用LDR测序分型试剂盒可以免去纯化这一繁琐的步骤，使得检测操作变得简单方便，同时也提高了检测结果的可靠性和准确性；方便了临床的开展3)提高数据量:DNA序列的测定只是针对某一区段进行的，而这一选定区段内医生和患者关心的一般只是其中的一个位点，而基于LDR技术的检测系统可以同时进行多位点的SNP分型，这一高通量的特点不仅提高了临床检测的效率，也是很大程度上为病人节省了本需要多次检测的相应费用。4)操作简单流程短:从DNA制备开始，仅需要5.5个小时，而测序往往要超过8个小时。其中DNA制备0.5小时，PCR需2 3小时，LDR需0.5 I小时，测序时间需I小时，方便临床的开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多重PCR和LDR技术的EGFR突变检测试剂盒，可用于临床EGFR常见突变检测。本发明的技术路线为:I，针对EGFR基因19外显子，20外显子和21外显子突变位点设计能够与野生型和突变型模板上游或下游互补的寡基核 苷酸引物，以及分别与19外显子，20外显子和21外显子突变位点结合的寡基核苷酸探针。2，配制适宜于PCR和LDR的反应体系。PCR反应体系包括Taq酶，UNG酶和Dntp，PCR缓冲液，引物等；LDR反应体系包括连接酶，UNG酶，dNTP，探针和缓冲溶液等。3，从待测样本中提取DNA，加到PCR反应体系中，进行多重PCR反应.
4，从上述PCR产物中加一定量到LDR反应体系中，进行多重LDR反应。5，将得到的LDR产物进行测序检测，根据测序图谱判断样本是否存在突变，以及是哪种突变。本发明提供的EGFR突变检测试剂盒包括以下组分:PCR缓冲液，酶1，酶2，LDR反应液，阴性质控品，野生型质控品，19外显子质控品，20外显子质控品，21外显子L858R质控品，21外显子L861Q质控品。其中酶I包括Taq酶，UNG酶和dNTP ;酶2包括连接酶，UNG酶，dNTP等。本发明EGFR突变检测试剂盒，其特征在于19外显子，20外显子和21外显子的引物序列分别是:19 外显子上游引物:HEX-CCCCAGCAATATCAGCCTTA19 外显子下游引物:CCACACAGCAAAGCAGAAAC20 外显子上游引物:FAM-CATTCATGCGTCTTCACCTG20 外显子下游引物:TTATCTCCCCTCCCCGTATC21 外显子上游引物:CCTCACAGCAGGGTCTTCTC21 外显子下游引物:CCTGGTGTCAGGAAAATGCT。
本发明EGFR突变检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含21外显子L858R的探针序列为:L858R_modify P-GCCCAAAATCTGTGATCTTGACATGTTTTTTTTTTT-FAML858R_T TTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCAL858R_G TTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCC。本发明EGFR突变检测试剂盒，其特征在于其特征在于LDR反应液中包含21外显子L861Q的探针序列为:L861Q_modify P-GTTTGGCCAGCCCAAAATCTGTGATTTTTTTTTTTTTTTTT-FAML861Q_T TTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAL861Q_A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCT。根据本发明的实施方案，阴性质控品是生理盐水；野生型质控品，19外显子质控品，20外显子质控品，21外显子L858R质控品和21外显子L861Q质控品分别为测序结果检测分别为野生和突变的质粒DNA。根据本发明的实施方案，其中试剂盒的待检样品为多种途径获取的带有相关肿瘤DNA的临床样品，包括手术切除组织，石蜡包埋组织切片，穿刺组织，胸水，全血、血浆和血清
坐寸ο 根据本发明的实施方案，19外显子突变是指EGFR络氨酸激酶区19外显子出现缺失突变；20外显子突变是指EGFR络氨酸激酶区20外显子的基因替换突变；21外显子突变是指EGFR络氨酸激酶区21外显子的L858R和L861Q突变。根据本发明的实施方案，试剂盒用于判定检测有效性的标准是:每次都检测阴性质控品，野生型质控品和突变型质控品，检测结果阴性质控品和野生型质控品均为阴性且突变型质控品为阳性时，实验才有效。本发明所述的EGFR突变检测试剂盒，目前针对临床EGFR突变检测方案主要有两种:Taqman探针法和Sanger测序法。Taqman探针法操作简单快速,实验灵敏度高，但无法同时检测多个突变位点。Sanger测序法操作繁琐，检测需10小时以上，检测灵敏度低，无法检测低滴度样本(突变比率小于15% )。基于PCR-LDR的EGFR突变位点检测方案能够突破传统核酸突变检测技术的局限:对多个突变位点进行检测；检测灵敏度达到1% ;操作方便，基本实现操作自动化，产品的检测时间缩短为4个小时。
具体实施例方式实施例1:EGFR突变检测试剂盒及其使用。I试剂盒组成:PCR缓冲液，酶1，酶2，LDR反应液，阴性质控品，野生型质控品，19外显子质控品，20外显子质控品，21外显子L858R质控品，21外显子L861Q质控品和分隔并集中包装这些管的试剂盒子。，2核酸提取:取10到30毫克新鲜组织或200微升抗凝血，使用Qiagen或其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取样本DNA。3多重PCR扩增。扩增管中，加入18ul PCR缓冲液、Iul酶I和Iul样本DNA，扩增条件为:95°C 15min，35 个循环包括 94°C 30 秒；59°C Imin ；72°C 30 秒，最后 72 °C 5min。4多重LDR2反应。反应管中，加入8ul LDR缓冲液、Iul酶2和Iul上述PCR产物，反应条件为:94°C 2min, 15个循环包括94°C 30秒；60°C 2min。5测序仪结果检测，将得到的LDR产物进行测序检测，检测结果用GeneMappeM.0软件进行分析。6结果判定:检测阴性质控品和野生型质控品均为阴性且突变型质控品为阳性时，实验结果有效。根据设计的探针长度判断结果是属于那种突变，野生型和突变型探针长度在软件分析前设置，从结果显示的峰图位置判定样本是属于野生型、单一突变型或复合突变型。L858R和L861Q野生型参见附
图1A，L858R突变L861Q野生型参见附图1B。实施例1:临床样本检测 根据上述实施方式，取非小细胞肺癌患者全血样本300例检测EGFR基因，结果如下:19外显子突变21例；20外显子突变35例；21外显子L858R突变78例；21外显子L861Q变异59例。本发明检测方法简单，样本通量大，灵敏度更高，非常适合临床大规模应用。在肿瘤个体化诊断日益被关注的今天，本发明可对EGFR基因特定突变位点进行检测，可以用于分子靶向抗肿瘤药物疗效的预测和肿瘤患者临床个体化用药方案的指导。
权利要求
1.一种采用特异性引物探针的高温连接酶技术(LDR技术)检测EGFR基因突变的试剂盒，该试剂盒包括=PCR缓冲液，酶1，酶2，LDR反应液，阴性质控品，野生型质控品，19外显子质控品，20外显子质控品，21外显子L858R质控品，21外显子L861Q质控品和分隔并集中包装这些管的试剂盒子。其中19外显子，20外显子和21外显子的引物序列分别是: 19 外显子上游引物:HEX-CCCCAGCAATATCAGCCTTA 19外显子下游引物:CCACACAGCAAAGCAGAAAC 20外显子上游引物:FAM-CATTCATGCGTCTTCACCTG 20外显子下游引物:TTATCTCCCCTCCCCGTATC 21外显子上游引物:CCTCACAGCAGGGTCTTCTC 21 外显子下游引物:CCTGGTGTCAGGAAAATGCT。
2.根据权利要求1的EGFR突变检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含21外显子L858R的探针序列为:L858R_modify P-GCCCAAAATCTGTGATCTTGACATGTTTTTTTTTTT-FAML858R_T TTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCAL858R_G TTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCC。
3.根据权利要求1的EGFR突变检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含21外显子L861Q的探针序列为: L861Q_modify P-GTTTGGCCAGCCCAAAATCTGTGATTTTTTTTTTTTTTTTT-FAML86IQ_T TTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAL861Q_A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCT。
4.根据权利要求1的EGFR突变检测试剂盒，其特征在于酶I中还包括Taq酶，UNG酶和 dNTP。
5.根据权利要求1的EGFR突变检测试剂盒，其特征在于酶2中还包括连接酶，UNG酶和 dNTP。
6.根据权利要求1的EGFR突变检测试剂盒，其特征在于阴性质控品是生理盐水；野生型质控品，19外显子质控品，20外显子质控品，21外显子L858R质控品和21外显子L861Q质控品分别为测序结果检测分别为野生和突变的质粒DNA。
全文摘要
本发明提供一种特异性PCR技术和LDR技术检测EGFR基因突变的试剂盒，特别涉及肿瘤患者组织以及患者血液中EGFR基因突变的诊断。本试剂盒针对分子靶向抗癌药物疗效相关的特定突变位点，设计特定的引物序列和探针序列，在进行多重PCR后，通过野生型探针和突变型探针与目的片段连接后在测序仪上进行片段分析，根据结果的峰图判读结果。本发明可对EGFR基因特定突变位点进行检测，可以用于分子靶向抗肿瘤药物疗效的预测和肿瘤患者临床个体化用药方案的指导。
文档编号C12Q1/68GK103184274SQ20111044862
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者江培学, 杨志军, 王微, 詹伟, 陈伟华, 吴大治, 夏懿 申请人:上海复星医学科技发展有限公司, 上海复星医药(集团)股份有限公司