获得持续的转基因表达的方法

专利名称：获得持续的转基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及非炎性载体组合物和治疗患有具炎性组分的疾病的病人的方法。
一种可替代的间接体内法包括将经基因修饰的细胞移植于肺远端，以获得与肺部疾病治疗相关的蛋白质血清分泌物。已有几项研究报道利用移植到肝或腹膜的带有编码α1抗胰蛋白酶转基因的细胞，其缺陷是可引起家族性肺气肿。Kay等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8989-93(1992)；Garver等，科学(Science)237762-64(1987)。所观察到的是低水平的瞬时表达。但是α1-抗胰蛋白酶在血清中的浓度必须达到高于1mg/ml，以通过扩散入肺部而具有治疗效果。而这一表达水平已经超出了目前可获得的最好的载体所能达到的程度。
另外，间接体内法需要使用同系细胞以避免移植引起的免疫排斥。因此，这种方法是高度个体化的，而且每个病人需要大量的组织培养物。上述间接体内法既是人力消耗性的又是技术依赖性的。
相反，可以直接施用于病人的针对肺部的直接体内基因治疗产物更易于溶合入现代医学和药学基础结构中。例如，在研发中的大多数囊性纤维化基因治疗产物被设计为通过基于气溶胶的系统递送，即类似于目前临床上许多常规的肺部药物的施用方式。Martin，等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)987-114(1998)。这样为成功引入间接体内基因治疗而必须研发的许多技术上的、医学上的、商业上的基础对直接体内基因治疗已经是适用的。历史上，直接体内系统依赖于病毒递送系统，但由于病毒载体存在缺陷，因此人们有相当的兴趣并致力于对合成的载体组合物的研究。
乍一看，腺病毒是作为肺递送系统的良好选择。它们对呼吸上皮是营养性的并具有相对大的编码容量。1992年，MH重组DNA顾问委员会(RAC)批准了最早的三种囊性纤维化临床基因治疗方法，其全部是基于腺病毒的。最终在人们认识到宿主的应答极大地限制了这一载体系统的使用后，起初对于腺病毒载体的热情平息了。特别是，立即的炎性应答限制了起始转导效率，肺泡巨噬细胞迅速地排除腺病毒载体，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答限制了表达的持续，以及抗体应答阻止了重复施用该载体的能力。
另一种常用的载体是腺伴随病毒(AAV)，一种小的单链DNA细小病毒，其需要与腺病毒或疱疹病毒共同感染才能繁殖。Berns，病毒学(VIROLOGY)(Fields，B.N.等编辑)，1743-63页(1990)。该病毒能整合到人细胞基因组19号染色体上的独特位点上，但由AAV衍生的载体的位点和范围尚存在疑问。已在兔中检测到AAV-介导的基因转移后6个月人CFTR的表达(Flotte等，美国国家科学院院报90，10613-17(1993))，而且已批准了使用这一载体进行人临床试验。Flotte等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)71145-1159(1996)。已经发表了在具有轻度肺病的成年CF病人中的腺伴随病毒-CFTR基因载体的I期研究(Wagner等，人类基因治疗9889-909(1998))，以及最初的临床试验报告。Wagner等，柳叶刀(Lancet)351，1702-03(1998)；Wagner等，见上)。然而如同腺病毒载体一样，预先存在的抗体可限制这一载体的使用，并且抗体应答的诱导也可以阻止重复施用AAV载体。见Zeitlin在肺病的基因治疗(GENETHERAPY FOR DISEASES OF THE LUNG)(Brigham编辑)，53-81页(1997)中的描述。而且病毒的编码序列通常由辅助质粒以反式形式提供，并将所述质粒共转染入腺病毒感染细胞以产生大量的AAV载体。这些过程烦琐，且易于污染腺病毒。
慢病毒是正链RNA病毒，其利用反转录酶将基因组转化为双链DNA前病毒，再插入到受其感染的细胞的基因组中。Narayan等，病毒学(Fields等编辑)，1679-1721页(1990)。与传统的逆病毒载体不同，(Miller等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)104239-42(1990))，慢病毒载体可以感染非分裂细胞，(Naldini，等，科学272，263-67(1996)；Miyake等，人类基因治疗9467-75(1998))，从而使这些载体有直接体内应用的可能。已报道了用基于HIV的载体表达CFTR基因的最初临床前研究。Goldman等，人类基因治疗82261-68(1997)。正如通常使用逆病毒载体一样，对整合的慢病毒载体的安全性考虑是根本的担心。Temin，人类基因治疗1111-23(1990)。
合成载体使用的是核酸与分子的复合体，其中所述核酸通常为质粒形式，所述分子促进核酸递送至靶细胞。作为病毒载体的替代物，合成载体应当具有较低的毒性和较低的免疫原性。合成载体具有以下几方面的潜在优势它们无可包装DNA大小的上限、为非感染性的、易于大量生产和进行质量控制、并且由可充分定义的组分构成。因此，从事合成载体系统的基本理由是为了避免病毒系统所存在的问题。已证实有两类主要的合成载体对直接体内递送基因是有用的，其中DNA分别与阳离子脂质或阳离子多聚体相络合。
络合了阳离子脂质的质粒DNA已通过静脉内施用和气管施用的方式，成功地用于直接体内转染肺细胞。阳离子多聚体同样地通过静电相互作用与DNA相互作用。将多聚赖氨酸连接到配体上，其中配体使得复合物通过受体介导递送到特定的靶细胞。聚乙烯亚胺(PEI)是一种最近的有希望的阳离子多聚体。已发现这一阳离子多聚体是小鼠肺通过口-气管或静脉内途径直接体内转导的有效载体。Ferrari等，基因治疗(Gene Ther.)4，1100-1106(1997)；Goula等，基因治疗5，1291-1295(1998)。
大部分用合成载体进行的直接体内动物研究依赖于与阳离子组分相络合的质粒DNA，以递送转基因。参见例如Felgner等，美国国家科学院院报847413-17(1987)；Gao在肺病的基因治疗(Brigham编辑)，99-112页(1997)中的描述。与病毒载体比较，用质粒进行的研究在实验动物中表现出一致的低水平转基因表达。另一方面，应用病毒载体受到宿主应答的限制，而这个问题对合成载体制剂则是极小的。因此目前这两个系统还没有哪个系统表现出明显的优势，且它们都有相当的问题。因此，本发明的目的在于克服现有技术中的上述困难，并提供诱导持续、有效量的肺和关节内转基因表达的方法和组合物。
图2表明载有分泌蛋白质之cDNA的质粒口-气管滴入后分泌蛋白在体内的分布。
发明详述本发明涉及获得治疗性基因产物持续表达的方法和组合物。该治疗性基因产物一般为蛋白质，但也可以是核酸如反义核酸或核酶。令人惊讶的是，发明人发现此处所述的组合物和方法不引起限制性的炎症或免疫应答，这一特性使得可以反复施用核酸而不显著降低表达水平。更具体地，本发明提供递送核酸到动物的肺或关节的新的改良方法。在一实施方案中，所述核酸编码一种基因，该基因的表达受控于包含上述核酸的同一载体上的其它元件。这些新的改良方法和组合物对于治疗和实验研究都是有用的。
本发明的方法和组合物对任一希望转基因持续表达的疾病(包括临床疾病)都是有用的。它们特别适合于需要在肺部和关节处持续表达的疾病。例如，它们可应用于人基因治疗。但应理解它们也可用于兽医领域(非人动物)尤其是用于哺乳动物。它们同样适用于产生转基因实验动物模型。
1.用于本发明的组合物本发明提供了适于递送转基因的组合物。一般说来，这样的组合物包括核酸，如编码至少一个目标基因(“转基因”)的DNA。一些优选的组合物中还包括增强剂(如表面活性剂)和/或类固醇。重要的是，所述组合物的载体部分不会明显加重肺部或关节的炎性疾病。换句话说，所述的载体不诱导实质上的免疫应答，其中所述实质上的免疫应答抵销了对炎性疾病的治疗。下面描述了炎性应答的特性。所述组合物的一个优选的形式为其包含的核酸缺乏可活化或促进淋巴样细胞活化的CpG岛。这些组合物可用于如治疗呼吸疾病，尤其是哮喘和慢性梗阻性肺病(COPD)或治疗关节病，如类风湿性关节炎和骨关节炎。
用于本发明组合物中的DNA可以是基于质粒的。这样的载体可方便地在细菌如大肠杆菌(E.coli)中繁殖。但当利用细菌增殖时优选用可使内毒素有效去除的纯化方法，因为内毒素可能通过促进炎性应答而干扰转基因的持续表达。虽然载体优选地是超螺旋的，但为使转基因最大限度表达其也可以是松弛的或者甚至是线性的。产生并增殖此类载体的方法对本领域的技术人员来说是已知的。
一般说来，用于本发明的载体具有属于质粒载体特性的特征。这包括，例如适合于在宿主中增殖的复制起点。一般性实例为ColE1起点，其可以相对低的拷贝数存在于pBR322中或以相对高的拷贝数存在于pUC载体系列或其它常规载体中。所述的载体还通常包含选择标记以保证经转化的宿主中保留有所述载体。通用的实例为带有氨苄青霉素抗性、嘌呤霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性、利福平抗性或壮观霉素抗性。本领域技术人员了解其它的选择标记，包括将来研究出的标记均可应用于本发明。也有利地包括多克隆位点。
所述的载体包含所有利于有效转录和翻译编码转基因的顺式元件。这些元件有效地连接到所述转基因上以利于转基因的表达。这样的元件如启动子为本领域技术人员公知。一般的启动子可为强组成型启动子，也可以是组织特异性的、可诱导型的或具有其它已知的所需特性。
这里所用到的“游离核酸”定义为核酸水溶液，其中核酸一般为DNA、RNA或合成的类似物。核酸一般通过构建体的生物繁殖来制备，所述的构建体是由质粒或病毒源经分离、纯化，以及在有些情况下是经修饰合成的。常规的病毒载体，如重组的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒均不包括在此定义的范围之内。重要的是，游离核酸不诱导表达限制性免疫应答；且不加重肺部或关节内的炎性病变。游离的核酸可以是RNA，但由于DNA分子的稳定性更强因此是优选的。
本发明的具体实施方案提供了使用通过表达反义或核酶构建体而产生治疗活性的核酸分子形式的方法。在本发明的又一实施方案中，用于产生治疗活性的核酸分子形式无需在肺部或关节的细胞中表达。例如在为反义的或催化性的核酸分子时，核酸自身可为直接活化的。
该组合物可以包含在肺部和关节的组织中增强所述核酸组合物药理学特性(例如分布和持久性)的“增强剂”，从而提高所述核酸的治疗活性。一种优选的增强剂是天然的或生物的表面活性剂。表面活性剂是表面活性的两亲组合物，其具有降低表面张力的特性。用于本发明的表面活性剂对肺病的治疗而言是安全的。此类人工和天然的表面活性剂是本领域所公知的，且有几种是可商购的。此类实例包括Survanta(Beractant，由Ross实验室获得)、Exosurf(棕榈胆磷，由Glaxo Wellcome获得)、Infasurf(calfactant，由Forest实验室获得)和其它降低表面张力的表面活性剂，从而促进所述载体的分散。天然存在的表面活性剂是磷脂、中性脂类、脂肪酸和蛋白质组成的复杂混合物。表面活性剂在性质上是两亲性的，具有极性和非极性组分，并因此使其能和含水和脂类的液体相互作用。
Survanta，一种优选的表面活性剂，是由母牛肺部衍生的半合成表面活性剂。它包含天然存在的脂类、脂肪酸以及与表面活性剂相关的蛋白质SP-B和SP-C。向这一混合物中添加额外的脂肪酸以制成标准制剂。Survanta已批准在临床上用于治疗胎儿呼吸窘迫综合征(RDS)。一般的剂量为气管内施用4cc/kg，总共4剂，间隔6-12小时。类似的使用剂量也适合应用于本发明，确定可选择的使用剂量属于本领域技术人员的常识范围。
一些增强剂是合成的或半合成的表面活性剂。此类增强剂可以是两亲性的合成或半合成的多聚体、脂类和碳氟化合物。一类适宜的合成多聚体表面活性剂是PluronicTM表面活性剂。一种合成的脂类表面活性剂为阴离子脂质体制剂(Bangham等，Chem-Phys-Lipids.64275-85(1993)，Bangham等，肺(Lung.)16517-25，(1987))。其它的脂类表面活性剂是表面活性剂多聚体-脂类偶联物。此类适宜的偶联物包括ThesitTM、Brij 58TM、Brij 78TM、Tween 80TM和Chol-PEG 900。本领域的技术人员可以认识到在不背离本发明宗旨的前提下，也可以应用其它合成或半合成的表面活性剂。
其它的增强剂对将核酸递送到关节特别有用。以与上述表面活性剂类似的方式，某些化合物可用于提高关节中本发明载体的分布特性和其它在治疗上有用的特性。这些化合物一般为由线性重复二糖单位组成的多糖。以透明质酸为例，其由通过1，4-连接的β-D-葡萄糖醛酸和1，3-连接的2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖的二糖单位组成。
Hyalgan，一种透明质酸的优选形式，为纯化的天然透明质酸钠大分子量级分在缓冲生理盐水中的粘性溶液。其已批准在临床上治疗膝骨关节炎疼痛。一般剂量为每周以关节内注射的方式施用20mg，共注射5次。类似的使用剂量也适用于本发明，确定其它使用剂量属于本领域技术人员的常识范围。
另外一些增强剂可以使所述核酸到达所述组织后，提高其与呼吸道深处和结构区域内或全部关节囊内的靶细胞接触。这种增强剂可以是电中性的、两亲性的多聚体。一种合适的电中性、两亲性的多聚体是多聚噁唑啉。
再另外一些增强剂使核酸于细胞外持续存在于呼吸道深处、关节囊内和结构区域内，由此加强治疗活性的持续性。这些增强剂降低了核酸从肺或关节组织的代谢过程和清除。
其它优选的组合物包括抗炎剂，如类固醇，其可有效地抑制或缓解炎症反应的一个或多个方面，包括单核细胞侵润、水肿、趋化因子和其它促炎介质的释放。在这方面尤其优选将类固醇吸入肺部或类固醇的关节内注射。实例包括倍氯米松(如VANCERIL，BECLOVENT-常规剂量约为42-84mcg/Inh)、氟羟脱氢皮质醇(如AZMACORT-常规剂量约100mcg/Inh)、氟尼缩松(如AEROBID-M，NASALIDE，BRONALIDE，RHINALAR-常规剂量42-250mcg/Inh)、氟地卡松(如FLOVENT，常规剂量50-250mcg/Inh)、布地奈德(如RHINOCORT-常规剂量100-200mcg/Inh)、地塞米松和氢化可的松。在本发明的另一实施方案中，所述的抗炎剂可以全身施用，例如通过口服施用或静脉内施用。这方面的实例包括地塞米松和氢化可的松。
抗炎化合物也可以是非类固醇类的抗炎剂(NSAID)。合适的NSAID的实例包括COX2抑制剂(如CELEBREX，常规剂量200mg/天)和Tilade(奈多罗米纳)。根据本领域使用的常规剂量来确定用量。施用频率也可借鉴本领域的常规情况，但一般由核酸载体的施用频率指导施用。
可知，如果适合，此处所描述的任一化合物可以是游离酸、游离碱、酯及其可药用盐。除非特别说明，提及了一种形式即预示着所有形式均适用。
2、本发明的方法一种典型的方法需要对病人施用有效量的与增强剂和/或抗炎化合物相结合的包含游离核酸载体(如质粒DNA)的组合物。该载体编码所需的转基因，且该方法导致转基因能够有效地表达。在治疗方法中表达有效量是指具有治疗意义的量，意思是对疾病本身、症状和/或一些基本的病理标记存在一些可检测的效果。这种效果可以是定性的也可以是定量的，临床医师熟悉与所治疗的不同疾病相关的每一种标记。例如在COPD病人支气管肺泡液中的IL8或嗜中性白细胞的下降即是一种治疗效果的指征。
在本发明方法中适用的表面活性剂和其它增强剂是可商购的。合适的表面活性剂包括但不限于Survanta(Beractant，可由Ross实验室获得)、PluronicTM、TweenTM和BrijTM。如上所述，本发明方法的一种重要的特征是不诱导产生限制表达的炎症应答，其使得所述的核酸具活性或使转基因持续表达。Survanta显示出对促细胞分裂原诱导的淋巴细胞增殖的抑制(Kremlev等，美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)267L357-64(1994))，因此可能用于这一方法。其它的表面活性剂可能具有类似的有益特性。
所述的含核酸的组合物可以通过例如作为干粉或悬浮液以任一导致进入肺部的适宜的方法递送。例如所述的组合物可以吸入(如作为气溶胶)、肺部滴注和/或通过气管施用。本领域技术人员可知，根据具体情况这些施用方法可以单独使用也可以结合使用。另外，也可以使用其他的肺部施用方法，包括在将来研究出的方法。
类似地，所述的含转基因的组合物可以通过任一导致进入关节内的适宜的方法，以悬浮液或其他生理上可接受的形式递送。例如，所述的组合物可以直接注射到关节内或通过静脉注射并靶向发炎的关节。本领域技术人员可以认识到根据具体情况这些施用方法可以单独使用也可以结合使用。另外，也可以使用其他的关节施用方法，包括在将来研究出的方法。
本发明方法的一个重要的特点在于所述核酸活性的持续表达，如持续的转基因表达。在此之前，基因治疗方法受免疫和炎症应答的限制，后者(1)降低整体核酸活性，这种情况下为降低转基因表达和(2)阻止重复施用作为一种加强表达的方法使用。这样，虽然在开始可使转基因以合理的水平表达，但表达不能持续。作为一次剂量施用或多次施用的结果，表达基本上不随着时间的延长而降低，这称为表达“持续”。通常，由此表达保持在一种有效的水平上。优选地，在两次施用之间表达水平不会下降到低于最高值的25％，更优选不低于最高值的50％，但在有些情况下低于这些阈值是有益的，这样通过反复施用形成剂量“脉冲”。
一种优选的方法包括两次或多次施用游离核酸载体组合物。以这种方式，核酸的活性得以加强或恢复到近似于首次施用后所获得的水平，由此保持核酸活性的有效水平。因为本发明的方法不引发限制性的免疫或炎症应答，本发明的组合物可以根据需要多次施用以保持活性的有效水平。在一些方法中是每隔几天施用，但更一般的是每周施用，有时也可以两周或每月施用。用这样的方法，依所治疗疾病的不同，可以观察到在两次施用之间活性的下降。但这些方法仍被认为是诱导“持续”活性，因为与现有技术中的方法不同，本发明的组合物可以反复地重复施用，而转基因表达相对于前次施用基本上不降低。一般的方法需要反复施用至少约一个月，但可能需要更长期地治疗。
在另一实施方案中，本发明的方法进一步需要施用抗炎化合物，如类固醇或NSAID，其可减轻受试者的炎症应答。一般在施用所述载体/增强剂组合物之前施用抗炎化合物是有用的，但它们也可以同时施用。适合的抗炎化合物如上所述。所述的抗炎试剂一般通过静脉或口服途径施用，其可包含在核酸组合物中，也可以作为单独的药物。
3、治疗适应症本方法的治疗应用涉及肺部疾病和非肺部疾病，包括类风湿性关节炎和骨关节炎。如上所述，由于肺部具有大的表面积并相对易于到达，因此是核酸递送有吸引力的靶子。因此当本方法获得治疗水平的转基因表达时，则本方法适合于基于基因治疗的对任何(肺部或非肺部)疾病的治疗。本领域的技术人员熟悉这方面的应用。例如Brigham等，自然(Nature)362250-55(1993)，施用编码人生长激素cDNA的质粒后人生长激素的表达，以及Cannizzo等，自然生物技术(Nature Biotech.)15570-73(1997)，在实验动物的肺部滴注表达血栓形成素的腺病毒载体后血液血小板数量得以提高。
鉴于本发明方法对基因治疗的适用性，它们特别适于治疗肺部疾病和在肺部具有病理表现的疾病。具体说来，该方法适于治疗具有炎症性病理和病因的疾病。如下述详细讨论的，可举出的疾病例子包括但并不限于肺气肿、COPD、囊性纤维化(CF)、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)和哮喘。
适合于应用本发明的治疗方法的具有肺部表征的遗传性疾病的例子包括CF和家族性肺气肿。CF是由囊性纤维化跨膜调节蛋白(一种cAMP-活化的氯离子通道)缺乏引起的。这种疾病以粘性呼吸道分泌物、慢性呼吸感染、支气管扩张，、胰腺纤维化和肠机能障碍为特征。呼吸表现为主要的，且由于进行性呼吸衰竭导致死亡的占95％以上。
对于CF基因治疗已经进行了许多临床实验，已有使用腺病毒和合成载体的报道。参见例如(Crystal等，自然遗传学(Nature Genet.)842-51(1994)和Caplen等，自然医学(Nature Med.)139-46(1995)。虽然上述报道中没有能够证明病人由此获益，但其提供了基因已递送到呼吸道上皮的证明。Middleton等，胸(Thorax)53197-199(1998)；Alton等，基因治疗(Gene Ther.)5291-92(1998)。对受治疗病人进行活组织检查表明，虽然基因转移和表达水平和电生理学矫正程度(若进行测定的话)均较低，但转基因的mRNA和蛋白质产物均已达到可检测的水平。治疗CF仅需要表达极低水平的CFTR，低水平的组成型启动子可足以达到治疗所需的表达水平。对治疗CF更重要的是需对所有肺上皮进行非常一致的转导。因为它们适于广泛性递送到肺部，对于这一方面本发明的方法显得尤为适宜。
α1-抗胰蛋白酶的遗传缺陷是产生家族性肺气肿的成因。这种蛋白质在肝脏内产生通过从血清扩散达到肺部，其正常情况下对肺部提供相当的抗蛋白酶保护。因此当抗蛋白酶防御不存在或被击溃时，本方法中用这一基因将提供有效地治疗家族性肺气肿和其它肺部炎性疾病。
在肺气肿病人中肺部的炎症过程可能会发展。据此，用于直接转导肺部上皮的载体必须避免加重该疾病。另外，适宜的载体可以是可雾化的而非可注射的，所述的启动子不需要如内源的天然存在于肝的启动子那样强，但优选地为组织特异性和组成型表达。
此前大多数基因治疗集中于遗传基础清楚的疾病，而本发明的方法对肺部的获得性疾病和具有复杂病因的疾病，如哮喘均可进行治疗。在吸烟者的肺部对抗蛋白酶的选择性氧化对COPD的发展起作用，从而导致肺部蛋白酶-抗蛋白酶平衡的改变。Laurell等，Sc.J.Clin.Lab.Invest.15132-140，(1963)。这一平衡可通过本发明的方法施用抗蛋白酶得以恢复。而且，当肺部存在分泌性白细胞蛋白酶灭活剂(SLPI)(一种主要的抗蛋白酶)时，已知通过用亮氨酸替代成熟蛋白中第73位的甲硫氨酸的突变可使该蛋白抗氧化。Stolk等，Pulm.Pharm.633-39，(1993)。因此打算用抗蛋白酶如SLPI，特别是抗氧化的抗蛋白酶治疗COPD病人。
合适的SLPI蛋白质包括SEQ ID No.1(天然成熟形式)SGKSFKAGVC PPKKSAQCLRYKKPECQSDW QCPGKKRCCP DTCGIKCLDP VDTPNPTRRKPGKCPVTYGQ CLMLNPPNFC EMDGQCKRDL KCCMGMCGKSCVSPVKASEQ ID No.2(天然非成熟形式)MKSSGLFPFL VLLALGTLAPWAVEGSGKSF KAGVCPPKKS AQCLRYKKPE CQSDWQCPGKKRCCPDTCGI KCLDPVDTPN PTRRKPGKCP VTYGQCLMLNPPNFCEMDGQ CKRDLKCCMG MCGKSCVSPV KASEQ ID No.3(抗氧化成熟形式)SGKSFKAGVC PPKKSAQCLRYKKPECQSDW QCPGKKRCCP DTCGIKCLDP VDTPNPTRRKPGKCPVTYGQ CLLLNPPNFC EMDGQCKRDL KCCMGMCGKSCVSPVKASEQ ID No.4(抗氧化非成熟形式)MKSSGLFPFIVLLALGTLAPWAVEGSGKSF KAGVCPPKKS AQCLRYKKPE CQSDWQCPGKKRCCPDTCGI KCLDPVDTPN PTRRKPGKCP VTYGQCLLLNPPNFCEMDGQ CKRDLKCCMG MCGKSCVSPVKA因此，尤其有用的一类核酸是包含编码蛋白酶抑制剂的转基因的核酸。示范性的蛋白酶抑制剂可抑制下述蛋白酶活性如嗜中性弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、胶原酶、蛋白酶3和纤溶酶原激活剂。关于这一点本领域的技术人员可以认识到对其他蛋白酶包括目前尚未鉴定的蛋白酶的抑制也是有益的。特定类别的蛋白酶抑制剂抑制例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。对本发明方法和组合物有用的蛋白酶抑制剂包括α1-抗胰蛋白酶、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、α1-抗凝乳蛋白酶、组织金属蛋白酶抑制剂(“TIMPs”，如TIMP-1、-2和-3)、弹力素(elafin)和β2-巨球蛋白。
一些上述的蛋白酶抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶和SLPI)是通过氧化机制灭活的。具体地说，它们具有含巯基的氨基酸(如半胱氨酸)，其必须呈还原形式以达到最高活性。如上述对SLPI的详细介绍，可以制备无此类残基的抗氧化类似物。可以预期这样的抗氧化(并因此抗灭活)的蛋白酶抑制剂可提高药物动力学性能，如延长半衰期。
在又一实施方案中，可改变待表达的转基因序列，以产生具有改变序列或具有新肽序列的蛋白质，其中所述改变的序列或新肽序列对该蛋白酶抑制剂具有有益的药理效果。在该实施方案的一个方面，改变蛋白酶抑制剂的转基因，以产生带有全部或部分天然或设计的免疫球蛋白序列的嵌合蛋白。免疫球蛋白部分的结合活性使得对靶组织区域的结合及驻留于这些组织区域均得以加强。也可以用其它允许滞留于组织中或防御组织中的代谢过程的肽序列替代免疫球蛋白序列。
另外，更广泛地说，治疗肺部氧化损伤(包括抗蛋白酶氧化)的方法为通过本发明的方法递送抗氧化剂。肺部疾病的抗氧化治疗使用如过氧化物歧化酶或过氧化氢酶。这些抗氧化治疗通常也用于治疗炎性疾病，因为炎症可导致氧化过程(如髓过氧化物酶)的活化，所述的抗氧化剂可以中和所产生的反应性氧类。
通过使用抑制疾病过程的核酸也可以治疗肺部的损伤。在一实施方案中，所述的核酸抑制天然蛋白酶的产生。这可以通过表达反义或核酶构建体而进行或通过直接抑制细胞产生蛋白酶而进行。
对于此处所讨论的每一种治疗性的基因，本领域的技术人员可知在基本上不损害根本的蛋白质功能的前提下，一级氨基酸和蛋白质序列中允许出现一定程度的变异，这是最为重要的特性。因此本发明包括衍生物或变异体形式的变异，这些术语在此处可以相互替换，特别是包括蛋白酶抑制剂的抗氧化形式。一般来说，包含在本发明范围内的DNA和蛋白质分子的衍生物均可以参照“序列同一性”来定义。“序列同一性”是指用例如本领域已知的标准Smith-Waterman算法在两分子间进行的比较。
一些衍生物具有至少约50％、55％或60％的同一性。优选的分子是具有至少约65％序列同一性的分子，更优选地具有至少65％或70％的序列同一性。其它优选的分子至少约80％，更优选地至少80％或85％的序列同一性。特别优选的分子具有至少约90％的序列同一性，更优选地至少90％的序列同一性。最优选的分子具有至少约95％，更优选地至少95％的序列同一性。此处如果当两核酸分子或蛋白质所包含的区域85％以上的序列(氨基酸或核酸)具有序列同一性则称其为“具有显著的序列同一性”。
此处定义的“序列同一性”是参考BLAST2算法使用缺省参数进行的。参见Altschul等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215403-410(1990)；Gish，自然遗传学(Nature Genet.)3266-272(1993)；Madden，酶学方法(Meth.Enzymol.)266131-141(1996)；Altschul等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)253389-3402(1997)；以及Zhang等，基因组研究(Genome Res.)7649-656(1997)。所述的BLAST2算法也可由NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)获得。
由于本发明的方法不使炎性病情恶化，因此其一般可用于治疗炎性疾病，包括肺部的疾病。与已知的方法相比，此处所述的方法给所治疗的疾病造成极小的威胁。在本发明的方法中转基因表达或核酸活性的治疗有效量是基本上抑制不利炎症应答的量。
治疗炎性疾病的方法的其它实施方案包括治疗关节炎。在这一实施方式中一种方法是表达转基因以保护软骨不被关节中不希望的炎症所产生的蛋白酶侵害。类似的，该方法可以用于核酸构建体的递送，所述的核酸构建体可发挥作用来消除关节中不希望的炎症的一个或多个步骤。该方法的其它实施方案用于治疗其他组织和病变中不希望的或过度的炎症。
可用本发明的方法治疗的肺部炎性疾病的实例是哮喘。哮喘包括复杂的级联炎症介质，其中任何一种均是本发明方法的靶。哮喘的主要特征是存在产生IL-4和IL-5，但不产生IL-2或IFN-γ的TH2-样T-细胞。C-C趋化因子，其包括RANTES、MCP-3、MCP-4、Eotaxin和Eotaxin-2。另外，某些细胞因子包括IL-12、IFN-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β公知可抵消TH2-驱动的炎症应答。因此，治疗肺部炎性疾病的靶的范围包括但不限于IL-4、IL-5、RANTES、MCP-3、MCP-4、Eotaxin、Eotaxin-2、IL-12、IFN-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β。
IL-10被认为是一种非特异性免疫抑制剂，其可抑制由TH2细胞产生的IFN-γ和IL-2以及多种其它的免疫应答。虽然IL-10是一种多少有些非特异性的免疫介质，IL-5则较具特异性。具体说来，IL-5是主要的且可能是唯一的参与嗜曙红细胞增多的细胞因子，这使其成为在嗜酸性疾病如变态反应和哮喘的治疗中引人注目的一点。因此，优选的治疗靶也包括IL-10(参见，如对于IL-10，Gen Bank登录号为U91746、U16720和X78437，对于IL-10受体Gen Bank登录号为4504632和U00672)和IL-5(参见，如对于IL-5，Gen Bank登录号为J03478和M33949，及对于IL-5受体Gen Bank登录号为26251和A26249)。
上述的炎症介质可被由基因治疗载体编码的多种试剂所抑制。例如可将编码特定抗体的基因，且特别是抗体片段的基因克隆到上述载体中。当涉及到这些介质的受体且这些受体已知时，上述受体的可溶形式可由所述的载体编码。例如，IL-5受体(“IL-5R”)有两个天然存在的形式一种为膜结合的，另一种为可溶的。可溶形式抑制IL-5与膜形式结合，因此拮抗IL-5的生物活性。故可溶性IL-5R是优选的抗炎药物。也可以应用其他的抑制剂，如反义核酸和核酶。所用术语“治疗”有多种语法形式，而在本发明中是指防止、治愈、逆转、轻减、缓和、最小化、抑制或阻止疾病病状、疾病进行、疾病成因介质或其他非正常情况的的损害作用。
上述讨论和下述的实施例并不作为对本发明的限制。具体地说，本领域的技术人员可以预见到此处未列出的但可包含在本发明范围内的其他实施方式。实施例1游离核酸的最适剂量这一实施例描述了用游离核酸进行基因表达的最适条件。下述的结果表明使用所有的剂量均可观察到基因表达。但在这次实验中使用剂量为80μg时，可观察到基因表达的最适水平。
实验是用100μl磷酸盐缓冲的盐水(PBS)稀释不同剂量的裸DNA进行的。如表1所示，所用的剂量为25、50、80和120μg DNA。STD是标准偏差。
(1)表1
实验所用的质粒为pCIluc，其包含在巨细胞病毒启动子控制下的萤火虫萤光素酶基因。雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)是从Harlan SpragueDawley(Indianapolis，IN)获得的。将小鼠置于装有5％异氟烷的铃型广口瓶中麻醉。所述DNA用弯角加料针由口气管滴注施于小鼠肺部。施用24小时后，将动物处死，将肺脏取出置于干冰上。
用购自Promega(Madison，WI)的试剂盒和Berthold Systems，Inc.(Pittsburgh，PA)的发光计测定虫萤光素酶活性。简要地说，将上述的肺脏置于500μl裂解缓冲液(Promega试剂盒)中用组织匀浆器(BrinkmanPolytron)匀浆20秒。所得样品在4℃下用微离心机以14000g离心30分钟。用Bradford试剂(BioRad，NY)测定蛋白质浓度。将每份含100μg来自上清部分的蛋白质的样品，用于虫萤光素酶分析。每份样品中的虫萤光素酶活性标准化成每毫克抽提蛋白质的相对光单位。实施例2最佳化组合物这一实施例表明最优化的基因表达受稀释游离核酸的溶液的影响。下述结果表明在5％葡萄糖溶液中的游离核酸获得最高水平的基因表达。而且，与100μl体积相比，以175μl体积递送的游离核酸获得了更高水平的基因表达。令人惊讶的发现在于等量的核酸使用较大的稀释物体积可获得较高水平的转基因表达，由这一发现进而促进了实施例3到10的发现。
所述的实验是对每只BALB/c小鼠使用50μg裸DNA进行的。质粒DNA与H2O、PBS或5％葡萄糖在两个不同的体积(100和175μl)下混合。将混合物通过口气管滴注于小鼠体内。进行蛋白质浓度和虫萤光素酶测定。结果如表2所示。
(2)表2
实验基本上用如实施例1所述的操作处理样品。实施例3表面活性剂提高游离核酸的递送这一实施例表明与游离核酸相比表面活性剂-介导的载体递送导致基因表达水平提高。
将含50μg质粒DNA和不同量表面活性剂的组合物以口气管方式施用。代表性的表面活性剂Survanta以10、12、14和16mg/ml施用于BALB/c小鼠。在第24小时收集肺脏，检测蛋白质浓度和虫萤光素酶活性。如表3所示，与对照相比，在存在Survanta时可达到较高水平的基因表达。
(3)表3
实验基本上如实施例1所述处理样品。DNA样品用5％的葡萄糖稀释至终体积为150μl(实施例1)或175μl(实施例2)，然后施用于每只小鼠。实施例4对不同时间点的基因表达进行比较这一实施例表明包含游离核酸和表面活性剂Survanta的组合物随着时间的推移，而呈现不同的基因表达水平。结果如表4所示，与不添加表面活性剂的DNA相比，添加了表面活性剂后24、48和72小时基因表达水平提高。
该实验是通过将50μg质粒DNA与14mg/ml Survanta混合至终浓度为100μl。将混合物通过口气管滴注BALB/c小鼠。进行蛋白质浓度和虫萤光素酶测定。N DNA表示仅有DNA，DNA/Su表示添加有表面活性剂的DNA。
(4)表4
实验基本上如实施例1所述处理样品。实施例5施用体积的优化该实验说明如何优化施用体积。总的说来，载体和表面活性剂的量保持不变，但组合物的体积变化。
实验1是用含50μg质粒DNA、14mg/ml表面活性剂，剩余体积为5％葡萄糖的组合物进行的。混合物的终体积为75、100、120、150和175μl。实验2是用不添加表面活性剂的溶于PBS的50μg DNA，终体积为100、125、150、175和200μl进行的。进行蛋白质和虫萤光素酶测定。结果如表5所示。
(5)表5
实验基本上如实施例1所述处理样品。实施例6一次口气管施用游离核酸后基因表达的持续时间这一实施例表明一段时间后基因表达达到峰值，其后基因表达水平下降直到最终达到基线水平。下述结果表明基因表达在6个小时后开始。基因表达24小时后开始出现明显的下降，第6天时达到基线水平。
所述实验是用在100μl PBS中的80μg裸DNA进行的。参见表7，在第6，12，24、48和72小时以及6、10、14、21和28天收获BALB/c小鼠。
(6)表6
实验基本上如实施例1所述处理样品。实施例7反复递送游离核酸令人惊讶地导致表达水平可以反复达到，且不产生限制性的炎症或免疫应答这一实施例表明，本发明的方法可以反复进行，因此可反复获得递送的转基因的表达。下述结果表明28天内每7天重复施用50μg质粒DNA，基因表达水平可保持在最初施用质粒DNA后所达到的水平。
这一实验是通过在第0、7、14、21和28天反复施用在150μl 5％葡萄糖中的50μg裸DNA进行的。每次施用DNA后24小时对所收获的肺匀浆物进行蛋白质浓度和虫萤光素酶测定。在所有之前的剂量次数施用后(post)的指定时间测定或在除了未施用24小时前的那次剂量而施用了其它之前的剂量次数(pre)的指定时间测定。结果如表7所示。因此，在这一实施例中，每一DNA剂量施用后很短的时间表达水平即达到峰值，然后逐渐下降，遵循类似于实施例6中观察到的单一DNA剂量的动力学。
(7)表7
实验基本上如实施例1所述处理样品。实施例8每48小时施用时，重复递送游离核酸不引起小鼠中的持续表达。
尽管在一周的周期内重复递送核酸可以形成重复基因表达，但这一实施例表明在约至少一周的时间内每48小时重复施用核酸并不能使基因持续表达。在首次施用48小时后再次使用可引起基因表达可观的增长，但接下来的施用则不再引起进一步的基因表达。
实验是用在5％葡萄糖溶液中的80μg质粒DNA在终体积为175μl的条件下进行的。所述的混合物在第3、5、7、9、11、13和15天施用。进行蛋白质浓度和虫萤光素酶测定。结果如表8所示。
(8)表8
实验除5只小鼠每48处理一次外，基本上如实施例1所述处理样品。实施例9辅助抗炎方法的应用这一实施例表明将抗炎化合物与上述的方法联合施用使载体可以更频繁地施用，这可导致更全面地保持转基因的持续表达。
实验这一实验是用在5％葡萄糖溶液中终体积为160μl的80μgpCIluc质粒进行的。所述的混合物在第0、4、8、12、16、20和24天以口气管途径递送。在第-1、0和1天对小鼠以腹膜内方式施用10mg/kg地塞米松。另外在第0、4、8、12、16、20和24天，于质粒递送前的30分钟，给小鼠施用10mg/kg地塞米松(ip)。在施用质粒后4天处死所述动物然后进行蛋白质浓缩物和虫萤光素酶分析。结果如下述

图1所示并以平均值+/-标准偏差的方式报道。除了第24天用了4只动物外，每个数据点均代表5只动物。实施例10分泌的转基因产物的组织分布这一实施例表明在质粒口气管滴注后蛋白酶抑制剂转基因产物的分布，并与静脉内施用质粒和口气管施用纯化的蛋白质进行了比较。这些数据表明转基因可与直接递送蛋白质递送相似量的产物。由于转基因可以不断产生所述蛋白质，与施用蛋白质的情况一样在整个时间段内蛋白质的总体水平并没有下降，这清楚地表明了本发明的有益之处。数据是在口气管或静脉施用后12小时收集的。
实验这些实验是利用包含受CMV启动子控制的人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)的cDNA序列的载体pCIhSPLI进行的。Stetler等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)147883-7896(1986)。口气管滴注法(OT)是用在5％葡萄糖溶液中稀释到终体积为150μl的80μg pCIhSLPI进行的。另外，一组BALB/c小鼠通过OT途径滴注了溶于150μl 5％葡萄糖中的1μg重组hSLPI蛋白(hSLPI-蛋白)。
制备DOTAP(1，2-二油酰氧代-3-(三甲铵)丙烷)-胆固醇络合的pCIhSLPI以用于静脉内(IV)注射。45mg DOTAP和25mg胆固醇与环己烷混合以冷冻干燥至干。向结块的脂中添加双蒸水使阴离子脂的终浓度为10mg/ml(也就是说不包含胆固醇组分)并在70℃水合l小时。所述的DOTAP/胆固醇分散体挤压通过100nm孔径的碳酸盐膜(Avanti PolarLipids，Inc.)。所得的DOTAP-胆固醇分散体的大小为150-200nm。静脉内(IV)注射(200μl)是用与DOTAP-胆固醇以4∶1(正电荷与负电荷之比)电荷比络合的60μg pCIhSLPI进行的。所述的DNA-阳离子脂质复合体(lipoplexes)是在IV注射前将溶解于10％葡萄糖中的60μg质粒加入到ddH2O中的100μl 5.1mg/ml DOTAP-胆固醇分散体中现制备的。
施用后12小时，将动物处死，支气管肺泡灌洗是通过带有硅胶导管的环型导气管缓慢加入700μl PBS进行的。收集肺脏并与裂解缓冲液一起置于溶解基质管中(BIO 101，Vista，CA)。所述的肺脏在Fast Prep FPl20(BIO101)中以6.0的速度匀化20秒。所得匀浆物在4℃下于微离心机中14000g离心30分钟。此外，收集血液，使其凝固并分离血清。回收的液体以1500转/分钟离心10分钟。去除上清部分并依照所建议的方法用双抗体夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒(R&D系统，Minneapolis，MN)分析是否存在人SLPI。数据以平均值+/-标准偏差的方式报道(图2)。
序列表<110>诺瓦提斯公司<120>获得持续的转基因表达的方法<130>4-31295<150>US 09/473,018<151>1999-12-28<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>107<212>PRT<213>抗蛋白酶SLPI<400>1Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala15 10 15Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys20 25 30Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu35 40 45Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys50 55 60Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys65 70 75 80Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met85 90 95Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala100 105<210>2<211>132<212>PRT<213>天然非成熟形式的抗蛋白酶SLPI<400>2Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu Val Leu Leu Ala Leu Gly1 5 10 15Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala20 25 30Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys35 40 45Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys50 55 60Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn65 70 75 80Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys85 90 95Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys100 105 110Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser115 120 125Pro Val Lys Ala130<210>3<211>107<212>PRT<213>抗氧化的成熟形式的抗蛋白酶SLPI<400>3Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala15 10 15Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys20 25 30Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu35 40 45Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys50 55 60Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Leu Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys65 70 75 80Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met85 90 95Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala100 105<210>4<211>132<212>PRT<213>抗氧化的非成熟形式的抗蛋白酶SLPI<400>4Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu Val Leu Leu Ala Leu Gly1 5 10 15Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala20 25 30Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys35 40 45Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys50 55 60Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn65 70 75 80Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys85 90 95Leu Leu Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys100 105 110Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser115 120 125Pro Val Lys Ala130
权利要求
1.一种非炎性载体组合物，其包含(i)编码基因产物的含水游离核酸和(ii)抗炎化合物。
2.根据权利要求1的组合物，进一步包含(iii)增强剂。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述的增强剂是表面活性剂。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述的表面活性剂选自Survanta，Exosurf、Infasurf、Pluronic、阴离子脂质体制剂、Thesit、Brij 58、Brij 78、吐温80和Chol-PEG 900。
5.根据权利要求2的组合物，其中所述的增强剂是多糖。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述的多糖是线性重复的1，4-连接的β-D-葡萄糖醛酸和1，3-连接的2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖二糖单元。
7.根据权利要求1的组合物，其中所述的抗炎剂是类固醇。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述的类固醇选自倍氯米松、氟羟脱氢皮质醇、氟尼缩松、氟地卡松、布地奈德、地塞米松和氢化可的松。
9. 根据权利要求1的组合物，其中所述的基因产物是蛋白酶抑制剂。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述的蛋白酶抑制剂抑制下述蛋白酶的活性嗜中性弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、胶原酶、明胶酶、蛋白酶3和纤溶酶原激活剂。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述的蛋白酶抑制剂选自α1-抗胰蛋白酶、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、α1-抗胰凝乳蛋白酶、TIMP-1、弹力素(elafin)、β2-巨球蛋白及其衍生物。
12.根据权利要求11的组合物，其中所述的蛋白酶抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂或其抗氧化形式。
13.一种治疗具有炎症组分疾病病人的方法，该方法包括至少对病人施用两次有效量的非炎性载体组合物，该组合物包括(i)编码基因产物的含水游离核酸和(ii)增强剂。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的施用是通过气管或关节内的方式施用。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的施用是通过雾化或关节内注射方式进行。
16.根据权利要求13的方法，其中所述的施用是通过气管施用并进一步包含在施用所述组合物前通过静脉内或经口途径施用抗炎剂。
17.根据权利要求13的方法，其中所述的疾病伴随有肺部或关节内的炎症。
18.根据权利要求17的方法，其中所述的疾病选自肺气肿、慢性梗阻性肺部疾病(COPD)、囊性纤维化(CF)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和哮喘。
19.根据权利要求17的方法，其中所述的疾病选自类风湿性关节炎和骨关节炎。
20.一种治疗具有炎症组分疾病病人的方法，该方法包括至少对病人施用两次有效量的非炎性载体组合物，该组合物包括(i)编码基因产物的含水游离核酸和(ii)免疫抑制剂。
全文摘要
本发明提供了非炎性载体组合物，其适用于重复的转基因递送，并导致持续的转基因表达。该组合物是非炎性的，本发明的组合物适合于重复施用而不诱导产生表达限制性的免疫或炎症应答。因此这些组合物可应用于重复施用的方法中，以获得持续的转基因表达，且这些组合物特别适用于治疗遗传性、获得性的炎性相关疾病。
文档编号A61K47/12GK1433477SQ00818673
公开日2003年7月30日 申请日期2000年12月27日 优先权日1999年12月28日
发明者P·卢, D·L·恩尼斯特, M·米纳 申请人:诺瓦提斯公司