专利名称：一种腹膜转基因方法
技术领域：
本发明涉及一种腹膜转基因方法。
背景技术：
对于转基因方法，很多学者也做了大量的工作，目前的基因导入方法包括物理/化学方法，如DNA直接注射的基因枪，电穿孔技术，脂质体转染等，这些方法可以使目地基因整合到细胞染色体上，但这种整合稳定性不好，而且效率不高。另一基因导入方法为病毒载体系统，包括逆转录病毒载体，腺病毒载体等，就特异性而言，病毒载体当推首位，但病毒制备比较困难，装载外源DNA大小受限制，诱导宿主免疫反应，潜在的致瘤性等，虽然转基因方法研究很多，但由于存在以上问题，大大限制了转基因技术在研究腹膜相关疾病的病发机理上的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种腹膜转基因方法。
本发明的目的是这样实现的上述腹膜转基因方法包括利用发泡剂六氟化硫微泡与目的基因混合，将基因包裹形成微泡，注射入腹腔，在体外利用可控制的适当强度的超声，微泡破裂的同时使腹膜间皮细胞形成小空隙，将目的基因转入细胞内。
与现有技术相比较，本发明具有以下优点1.具有非常高的转染效率；2.整个转基因过程不需复杂的分子生物学技术及其他昂贵设备，因此简单，易于操作，可重复性好，稳定性高，易于标准化。
具体实施例方式
本发明的腹膜转基因方法包括利用发泡剂六氟化硫微泡与目的基因混合，将基因包裹形成微泡，注射入腹腔，在体外利用可控制的适当强度的超声，微泡破裂的同时使腹膜间皮细胞形成小空隙，将目的基因转入细胞内。
本发明属于超声微泡技术，其利用对人体无明显毒副作用的超声技术及发泡剂进行基因转染，克服了病毒转染等技术方法的缺陷，而且具有非常高的转染效率。超声微泡技术转基因的可能原理是将发泡剂与目的基因充分混合后，发泡剂形成直径较小的微泡将目的基因包裹，当有超声作用时微泡破裂，释放内容物，使之与胞膜之间的接触更加紧密，超声的作用将细胞的胞膜形成小且可以恢复的空隙，使目的基因易于通过细胞膜进入细胞与细胞的基因溶为一体，通过以上两种作用，提高转染效率。超声作用在胞膜形成的小且可以恢复的孔道具有一定的时间限制，超过一定时间，孔道就会关闭，转染将不能继续进行，如果输入带有气体的且不溶于水的微泡，不但可使胞膜形成空隙效应的阈值降低，而且将会增大孔道开放程度及延长开放时间，微泡包裹基因，微泡与靶细胞直接接触使转染基因与细胞之间的接触更加紧密，提高了转染效率。理想的转染率需要以下两个方面的条件1足够量的DNA；2大量且与DNA匹配的微泡；3适当强度的超声作用。其优越性在于首先极大程度的提高了转染效率，此外未发现明显负作用。
我们利用以下两个实验来验证其转染效率。
实验一用FITC标记的Smad7寡核苷酸通过荧光直接观察转染效率TGF-β/Smads信号通路参与了多种组织的致纤维化作用，已证实其在腹膜纤维化形成中也起了重要作用。Smad7是TGF-β/Smads信号通路的抑制蛋白，作为TGF-β/Smads信号通路中的负反馈调节因子成为很有希望的腹膜纤维化的治疗靶点。因此我们以转Smad7基因来研究超声微泡技术的转染效率。
腹腔内液体注射量对转染效率的影响质粒DNA与发泡剂的合适匹配是影响转染效率的重要因素，参考已有文献，在超声诊断，转染肾脏组织的应用中，质粒与发泡剂体积1∶1混合时，匹配较合适，本实验不再探讨质粒与发泡剂的比例问题。总的超声能量也可能会影响转染效率，总的超声能量与超声方式、输出功率、超声时间、输出频率有关，预实验中我们固定其中三个变量，通过改变输出频率这一个参数来观察总的超声能量对转染效率的影响，实验发现，当选择3MHZ超声，超声输出功率为2.8W/cm2，连续输出及20％输出时，大鼠皮肤温度过高，因此实验中我们选用10％输出功率。脏层腹膜的特殊性在于不象其他实质性脏器，腹膜面积大，且不规则地分布于腹腔，注射液体量直接关系到转染效率和是否能均匀转染。因此在实验设计上我们主要利用荧光标记的质粒探讨转染效率以及达到最高转染效率的最适注射液体量。
(一)实验所需物品1.FITC标记的Smad7寡核苷酸(目的基因)，由上海博亚生物公司合成，序列为，上游5’-TTGCCGTACCTGACTTAGCC-3’，下游3’-AACGGCATGGACTGAATCGG-5’。
2.发泡剂Sonovue，注射用六氟化硫。商品名声诺维。产地意大利Milano公司。
进口药品注册证号H20030239。
临床上静脉注射用于辅助超声诊断增强血液与周围组织的对比度。并已经进行急性毒理研究、长期毒性研究、生殖毒性、遗传毒性、致癌性等多方面的实验，均未发现有相应毒副作用。
3.超声仪产地，比利时，型号为FYSIOMED Sonic15C。
4.清洁级SD雄性大鼠体重170g左右，中山大学北校区实验动物中心提供。
5.DAPISigma公司产品。
(二)实验方法步骤1.将FITC标记的Smad7寡核苷酸两条互补链用生理盐水稀释为50ug/ml，每支发泡剂(含59mg六氟化硫)按说明用5ml生理盐水稀释，二者以体积比1∶1充分混匀。
2.动物分组将24只SD大鼠随机分为6组，每组6只，A组，正常对照组，不做任何处理。B、C、D、组腹腔注射Smad7混合物，体积分别为2ml、4ml、6ml，超声输出频率为均为10％，注射后充分腹部按摩使液体在腹腔尽可能均匀分布。
3.超声方法转染脏层腹膜大鼠麻醉后取仰卧位，腹部剪毛，涂螯合胶，首先选择3MHZ超声，超声输出功率为2.8W/cm2，输出频率为10％，超声时间为10分钟，过程中不断变换位置。
转染壁层腹膜完成以上操作后，将大鼠腹部朝下，使液体聚集于壁层腹膜处，首先选择3MHZ超声，输出功率为2.8W/cm2，输出频率10％，超声时间5分钟。再选择1MHZ超声，输出功率为和输出频率不变，超声时间为5分钟。
4.取材从腹腔中部沿腹白线剪开皮肤，心脏穿刺抽血留取血清检测LDH，在腹壁上、中、下、侧等多部位取带肌肉的壁层腹膜，同时取心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织，做冰冻切片，厚度7um，脏层腹膜也多部位取材采用肠系膜铺片观察脏层腹膜转染效率。用4％多聚甲醛固定5分钟，PBS洗5分钟，DAPI染核后，共聚焦显微镜下观察。
(三)实验结果(1)脏层腹膜转染效率(见
图1)红色为细胞核(DAPI染色)，绿色为Smad7寡核苷酸所带FITC的荧光，红核周围的绿色荧光表示转入细胞浆，黄色为红色胞核与绿色信号重叠的效应，表明已转入细胞核。从图中可见，正常对照组无阳性信号。2ml组有阳性信号但转染效率低，且各部位阳性率不均匀，4ml、6ml组转染效率明显高于其他组，各部位阳性率相对均匀。约70％-80％的细胞周围都可见绿色荧光或表现为黄色荧光。
(2)层腹膜转染效率同样发现正常对照组无阳性信号。2ml组有阳性信号但转染效率低，且各部位阳性率不均匀，4ml、6ml组各部位阳性率相对均匀，转染效率明显高于其他组(见图2)。
(3)对其他脏器影响心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织基本未发现有绿色或黄色阳性信号(其中肝脏、脾脏的荧光表现为规则均一的条状为自发荧光)，表明此种转染方法特异性较高(见图3)。
5.小结当Smad7寡核苷酸终浓度为50ug/ml，超声功率为2.8W/cm2，输出频率10％，超声时间固定为20分钟时，腹腔注射体积为4ml转染效率可达最高且能在脏层腹膜均匀转染。
实验二带m2标记的Smad7质粒转染大鼠腹膜(实际应用)(一)实验所需物品1.受四环素调控的m2标记的Smad7质粒及四环素开关质粒(美国Baylor医学院蓝辉耀教授馈赠)。
2.质粒提取试剂盒Qiagen plasmid mega kit。
3.发泡剂Sonovue。
4.超声仪产地，比利时，型号为FYSIOMED Sonic15C。
5.小鼠抗大鼠m2多克隆抗体、兔抗大鼠Smad7多克隆抗体、羊抗小鼠FITC荧光抗体，购于santa cruz公司，羊血清封闭液购于Boster公司。LDH试剂盒购于上海申能-德赛诊断技术有限公司。
6.激光共聚焦显微镜Zeiss，LSM-510，德国。
7.清洁级SD雄性大鼠体重170g左右，中山大学动物中心提供。
(二)实验方法步骤1.按试剂盒说明书提取Smad7质粒及pEFpurop-Tet-on质粒。
2.将已提取的m2标记的Smad7质粒及pEFpurop-Tet-on质粒相同质量用生理盐水稀释，每支发泡剂(含59mg六氟化硫)按说明书用5ml生理盐水溶解，二者以体积比1∶1充分混匀，Smad7终浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。
3.30只大鼠随机分为4组，1组，正常对照组，2组，Smad7 25ug/ml组，3组，Smad7 50ug/ml组，4组，Smad7 100ug/ml组，根据前一个实验(FITC标记的Smad7寡核苷酸)结果，我们选择每只大鼠腹腔注射体积为4ml，并充分腹部按摩使液体在腹腔尽可能均匀分布。
4.超声方法同前。
5.超声结束后立即腹腔注射1ml浓度为200ug/ml的强力霉素，随后给予大鼠200ug/ml的强力霉素作为饮用水以诱导Smad7的表达，直至72小时处死。
6.于72小时后处死大鼠，从腹腔中部沿腹白线剪开皮肤，心脏穿刺抽血留取血清检测LDH，在腹壁上、中、下、侧等多部位取壁层腹膜，脏层腹膜也多部位取材，PLP固定8小时，常规脱水、石蜡包埋。
7.将7um组织切片常规脱腊至水后，中火修复10min，加羊血清封闭液，37℃孵育30分钟，滴加小鼠抗大鼠m2-flag多克隆抗体(20ug/ml)，4℃过夜，PBS洗3次×5min，滴加羊抗小鼠FITC荧光抗体(1∶100)，37℃孵育45min，PBS液洗3次×5min，滴加DAPI染核，室温放置3min，PBS液洗3次×5min，激光共聚焦显微镜下观察m2表达。
8.Western-blot定量检测Smad7蛋白表达取200mg腹膜组织，碾碎后加入1ml的细胞裂解液超声粉碎，4℃，15000r/min离心15min，取上清测蛋白质浓度。取相同质量的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，含脱脂奶粉的TBS室温封闭1小时，加入兔抗大鼠Smad7多克隆抗体(1∶200)，4℃过夜，HRP标记的抗兔IgG杂交，洗膜后显色，凝胶成像分析系统扫描分析。
9.用2um脏层、壁层腹膜组织切片行常规HE染色并用酶法测血清中LDH含量。
(三)实验结果1.脏层腹膜正常大鼠腹膜不表达标记蛋白m2。在25ug/ml、50ug/ml组m2都有阳性信号但转染效率低，100ug/ml组转染效率明显高于其他组，各部位阳性率相对均匀，约90％的有核细胞周围都可见绿色荧光或表现为黄色荧光，说明已成功转染(见图4)。Smad7表达(western-blot)同m2相一致，进一步表明质粒成功转染并诱导出目的蛋白的表达(见图5)。
2.超声及发泡剂对脏层、壁层腹膜的影响 HE染色发现当腹腔注射质粒及发泡剂，并体外超声72小时后，HE染色仅发现有少许炎症细胞浸润，其余未发现明显改变(见图6)，血中LDH的含量无明显升高(见图7)。
(四)小结1.当超声功率为2.8W/cm2，超声时间固定为20分钟，超声频率为10％，腹腔注射体积为4ml时，质粒浓度为100ug/ml转染效率较高，且能在腹膜组织上均匀转染。
2.超声和发泡剂对组织影响小，72小时后无显著毒副作用。
我们首次在腹膜转基因实验上证明超声微泡技术——这项新的转基因技术具有转染效率高且基本未发现明显毒负作用等优点。
权利要求
1.一种腹膜转基因方法，其包括利用发泡剂六氟化硫微泡与目的基因混合，将基因包裹形成微泡，注射入腹腔，在体外利用可控制的适当强度的超声，微泡破裂的同时使腹膜间皮细胞形成小空隙，将目的基因转入细胞内。
全文摘要
本发明提供一种腹膜转基因方法。该方法包括利用发泡剂六氟化硫微泡与目的基因混合，将基因包裹形成微泡，注射入腹腔，在体外利用可控制的适当强度的超声，微泡破裂的同时使腹膜间皮细胞形成小空隙，将目的基因转入细胞内。与现有技术相比较，本发明具有以下优点1.具有非常高的转染效率；2.整个转基因过程不需复杂的分子生物学技术及其他昂贵设备，因此简单，易于操作，可重复性好，稳定性高，易于标准化。
文档编号C12N15/87GK1718734SQ20051003395
公开日2006年1月11日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者余学清, 贾占军, 窦献蕊, 王欣, 郝文科, 陈文芳, 李晓艳, 彭文兴, 骆宁 申请人:中山大学附属第一医院