专利名称：促进胚胎干细胞向造血干细胞定向分化的程序诱导方法
专利说明促进胚胎干细胞向造血干细胞定向分化的程序诱导方法 本发明涉及一种诱导胚胎干细胞(ES细胞)定向分化方法，该方法能提高ES细胞向造血干细胞定向分化的效率，并促进ES来源造血干细胞的功能发育。造血干细胞移植目前已成为治疗白血病、重型再生障碍性贫血及某些恶性肿瘤等难治性疾病的最有效手段。由于异体造血干细胞移植需进行严格的组织配型，HLA相合供体来源极为有限，限制了造血干细胞移植在临床上的广泛应用。具有发育全能性的ES细胞可在体外分化为造血干细胞，但ES细胞存在着分化效率低及造血功能发育不全等问题，目前迫切需要发明一种安全有效的方法来诱导培养ES细胞向造血干细胞定向分化，并促进其有效扩增和功能发育完善，为造血干细胞移植治疗提供理想的细胞来源。为了提高ES细胞向造血干细胞分化的效率并促进ES来源造血干细胞的功能发育，本发明建立了一种程序诱导方法，该方法不仅能提高ES细胞向造血干细胞定向分化的效率，而且也能促进ES来源造血干细胞的功能发育。通过该方法诱导产生的造血干细胞具有在成年受体重建造血的功能。
本发明所采用的技术方案包括组织取材、基质细胞培养、无血清条件培养液收集、程序诱导ES细胞向造血干细胞分化、分选造血干细胞等步骤。取传代培养的ES细胞采用半固体悬浮培养法形成胚胎体(embryoid body，EB)；从卵黄囊(胚龄小鼠8-11天/人4-6周)、胎肝(胚龄小鼠10-14天/人8-12周)和成年骨髓组织中分离培养处于造血发育不同阶段的造血基质细胞，形成亚融合状态的细胞层，也可在卵黄囊、胎肝和成年骨髓组织中仅选择其中的两种进行分离培养，例如卵黄囊和胎肝组织，或者卵黄囊和成年骨髓组织，或者胎肝和成年骨髓组织；收集无血清基质细胞条件培养液；联合应用不同阶段的基质细胞层、基质细胞条件培养液及相应造血生长因子建立程序诱导培养体系，动态模拟胚胎造血发育微环境，程序诱导ES细胞向造血干细胞定向分化并促进其造血功能发育完善。通过该方法诱导产生的造血细胞表达造血干细胞的表面标志，体外具有形成原始造血细胞集落的功能，将其输入受致死照射后的成年小鼠，具有造血重建的功能。
本发明的有益效果是，应用程序诱导方法不仅能提高ES细胞向造血干细胞定向分化的效率并使其有效扩增，而且还能促进ES来源造血干细胞的功能发育。通过该方法可诱导产生的大量功能发育完善的造血干细胞，有望拓展造血干细胞移植的供体细胞来源，开创造血干细胞移植的全新研究领域，从而突破造血干细胞移植供体来源极为受限的临床应用瓶颈，使众多白血病、重型再生障碍性贫血、恶性肿瘤等难治性疾病得到及时有效的治疗，挽救患者生命，提高患者生存质量，减轻社会医疗负担，具有重大的社会效益，其潜在的经济效益亦十分巨大。
图1是本发明的技术路线图。
图中A为模拟的卵黄囊造血微环境，B为模拟的胎肝造血微环境，C为模拟的骨髓造血微环境。下面结合附图对本发明作进一步说明。
从小鼠的胚胎或人的流产胚胎中分离卵黄囊(胚龄小鼠8～11天/人4～6周)和胎肝(胚龄小鼠10～14天/人8～12周)组织，取成年小鼠双侧股骨或抽取成人骨髓组织，采用酶消化法或物理分离方法制备卵黄囊、胎肝和骨髓单细胞悬液，采用密度梯度离心分离方法分离单个核细胞用含15％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下进行基质细胞培养，3-5天换液一次，培养至亚融合状态，取生长状态良好的基质细胞用于制备滋养层和无血清条件培养液，同时对基质细胞的类型及构成比例进行鉴定。
培养至亚融合状态的卵黄囊、胎肝和骨髓基质细胞层经γ射线照射(15Gy)灭活，用作支持ES来源造血细胞增殖和功能发育的滋养层，使用1周后需更换新制备的滋养层。
制备条件培养液前去除含血清的培养基，并用PBS洗涤细胞和培养瓶去除残留血清，将培养至亚融合状态的卵黄囊、胎肝和骨髓基质细胞层于置于无血清的培养基中在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养2天，收集上清液，离心、0.22μm滤膜过滤、制备无血清条件培养液。体外进行三种基质细胞无血清条件培养液的活性分析，确定用于程序诱导培养体系的最适浓度，一般为10～30％。
取传代培养的ES细胞采用悬浮培养法形成胚胎体(EB)，在胚胎体的培养体系中，顺序应用卵黄囊、胎肝和骨髓基质细胞滋养层(培养时间分别为3天、2天、2天)、联合最适浓度的三种基质细胞条件培养液及BMP-4、FL、TPO、SCF(20-100ng/ml)等造血生长因子建立程序诱导培养体系，动态模拟胚胎造血发育微环境，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下对ES细胞进行程序诱导培养，使ES细胞向造血干细胞定向分化并促进其造血功能发育完善，培养1周后，收集胚胎体经0.25％胰酶消化制备成单细胞悬液，应用流式细胞术或免疫磁珠分离技术分选Sca-1+、CD34+、CD38-造血干细胞。
组织取材、进行基质细胞培养时，也可在卵黄囊、胎肝和成年骨髓组织中仅选择其中的两种进行分离培养，例如卵黄囊和胎肝组织，或者卵黄囊和成年骨髓组织，或者胎肝和成年骨髓组织。
综上所述，应用程序诱导方法可以成功诱导ES细胞向造血干细胞定向分化，为造血干细胞移植提供充足的理想细胞来源，使众多白血病、重型再生障碍性贫血和恶性肿瘤等难治性疾病得到及时有效的治疗，具有广阔的临床应用前景。
权利要求
1.一种促进胚胎干细胞(ES细胞)向造血干细胞定向分化的程序诱导方法，包括组织取材、基质细胞培养、无血清条件培养液收集、程序诱导ES细胞向造血干细胞分化、分选造血干细胞等步骤，其特征在于取ES细胞培养形成胚胎体，从卵黄囊、胎肝和成年骨髓组织中分离培养处于造血发育不同阶段的造血基质细胞。
2.根据权利要求1所述的程序诱导方法，其特征在于基质细胞无血清条件培养液的浓度为10～30％。
3.根据权利要求1或2所述的程序诱导方法，其特征在于取ES细胞培养形成胚胎体，从卵黄囊和胎肝组织中分离培养处于造血发育不同阶段的造血基质细胞。
4.根据权利要求1或2所述的程序诱导方法，其特征在于取ES细胞培养形成胚胎体，从卵黄囊和成年骨髓组织中分离培养处于造血发育不同阶段的造血基质细胞。
5.根据权利要求1或2所述的程序诱导方法，其特征在于取ES细胞培养形成胚胎体，从胎肝和成年骨髓组织中分离培养处于造血发育不同阶段的造血基质细胞。
6.根据权利要求1或2所述的程序诱导方法，其特征在于卵黄囊胚龄小鼠8-11天或人4-6周，胎肝胚龄小鼠10-14天或人8-12周。
全文摘要
本发明涉及促进胚胎干细胞(ES细胞)向造血干细胞定向分化的程序诱导方法，它包括组织取材、基质细胞培养、无血清条件培养液收集、程序诱导ES细胞向造血干细胞分化、分选造血干细胞等步骤，其特征在于取ES细胞培养形成胚胎体，从卵黄囊、胎肝和成年骨髓组织中分离培养处于造血发育不同阶段的造血基质细胞，形成亚融合状态的细胞层。本发明可诱导产生大量功能发育完善的造血干细胞，从而拓展造血干细胞移植的供体细胞来源，突破临床应用瓶颈，使众多白血病、重型再生障碍性贫血、恶性肿瘤等患者受益，具有重大的社会效益和经济效益。
文档编号C12N5/08GK1673359SQ200510033710
公开日2005年9月28日 申请日期2005年3月24日 优先权日2005年3月24日
发明者那晓东, 李树浓, 赵自平 申请人:中山大学