专利名称：用于控制干细胞分化的方法
关于联邦赞助研究的声明
本发明部分由来自国立卫生研究院(National Institutes of Health)的拨款号RO1 GM58839支助。政府在本发明中可能具有一定的权利。
背景技术：
本发明的特征在于用于开发和维持哺乳动物干细胞及其衍生物的改进。
干细胞是独特的细胞群体，其具有分裂(自我更新)无限时间段的能力，和在正确条件或信号下分化成构成生物的许多不同细胞类型的能力。来源于胚泡内细胞团的干细胞被称为胚胎干(ES)细胞。来源于原生殖细胞且通常发育为成熟配子(卵和精子)的干细胞被称为胚胎生殖干(EG)细胞。因为其分化成所有3种胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)衍生物的独特能力，所以这两种类型的干细胞被称为多潜能细胞。
多潜能干细胞可以进一步特化为通常来源于成体组织的另一种类型的多能干细胞。多能干细胞也能够经历自我更新和分化，但与胚胎干细胞不同，定向于产生具有特定功能的细胞。成体干细胞的例子包括造血干细胞(HSC)、骨髓衍生干细胞(BMSC)和神经干细胞(NSC)，所述HSC可以增殖和分化以产生淋巴样和髓样细胞类型；所述BMSC可以分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肝细胞、心肌细胞和神经元；且所述NSC可以分化成星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。多能干细胞也已来源于上皮和脂肪组织和脐带血(UCB)。
通过与干细胞分离和繁殖有关的近期工作在再生医学和基因疗法领域中已产生相当大的兴趣。干细胞在培养中无限繁殖的能力结合其产生多种组织类型的能力使得来自这些细胞的治疗潜能几乎是无限的。
用于治疗目的的干细胞开发中的主要限制之一涉及足够时间的从自我更新转变成分化的调节，以允许临床医生或研究人员处理细胞用于治疗或研究目的。用于维持未分化状态中的干细胞的当前方法包括在小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上培养细胞，在牛血清中培养，在从小鼠肿瘤提取的细胞的平板涂布基质中培养，和添加试剂，例如白血病抑制因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、Map激酶激酶抑制剂PD98059和Oct-4(也被称为Oct-3/4)。所有这些方法在其潜能方面有限，因为其不能阻断分化，且因为可能有动物产品、病原体、饲养细胞的污染，或在人干细胞的情况下，有非人细胞的污染。
需要用于培养和处理未分化干细胞的改进方法以帮助实现这些细胞的全部治疗潜能。
发明概述 本发明基于下述发现X染色体失活(XCI)使得干细胞能够分化，且抑制或阻断XCI可以导致阻断分化，从而提供了用于控制干细胞分化的机制。此类方法包括靶向和灭活在X失活中心基因座内的任何内源基因，或引入可以阻止细胞经历X染色体失活的转基因。控制干细胞分化的这些方法的使用促进和增强干细胞的治疗和临床潜能。
XCI是其中一个X染色体在雌性细胞(XX)中关闭的过程，以补偿与雄性(XY)细胞比较具有额外的X染色体。这意味着每个胚胎必须配备计数X染色体(XX对XY)的机制，且随后在雌性的2条X染色体之间随机选择以开始失活过程，同时在所有后期分裂中维持相同X染色体的失活。所述步骤分别被称为“计数”、“选择”和“沉默”。此外，染色体间配对也包括在XCI过程中。
这些步骤受到称为X失活中心(Xic)的主调节区的控制，所述主调节区包含许多罕见的非编码基因，所述非编码基因一起发挥作用以确保XCI只在XX雌性中、只在1条染色体上、且以发育特异性方式发生。在Xic上的3种非编码基因Xist、Tsix和Xite与这个过程有关，且每种产生RNA而不是蛋白质。Xist只由将来失活的X产生，且产生“包被”失活X的20kb RNA，从而开始基因沉默过程。Tsix是Xist的反义调节物，且通过阻止Xist RNA沿着X染色体伸展来发挥作用。因此，Tsix指定未来的活性X。Xite连同Tsix一起发挥作用以确保X的活性状态。Xite产生一系列基因间RNAs且呈现具体的染色质构象。它的作用增强了反义Tsix的表达，从而与Tsix协同指定未来的活性X。Tsix和Xite一起控制“选择”步骤，而Xist控制“沉默”步骤。Tsix和Xite还通过X-X配对调节计数和互斥的选择。
本发明基于下述发现通过过量的Xic、Tsix和Xite或Xic、Tsix和Xite的缺失中断XCI过程可以阻断分化。在本方法中，XCI过程的中断通过使用来源于Xic、Tsix或Xite序列或其片段的转基因或小RNAs来完成，将所述转基因或小RNAs引入干细胞内且阻止干细胞经历X染色体失活和在培养中分化。转基因的去除逆转对分化的阻断且可以根据需要诱导干细胞分化。在不存在细胞或动物产品污染的情况下，这些方法允许临床医生或研究人员有足够的时间根据需要处理干细胞，以增强其治疗潜能。小RNA分子的使用避免了去除转基因的需要，因为小RNA分子具有有限的半衰期且将自然降解。本发明的方法还减少或消除了使用饲养细胞的需要，由于被饲养细胞污染的可能性减少这还导致细胞更适合于治疗目的。因此，这些方法和由这些方法产生的细胞克服了干细胞研究的2个主要限制。
因此，在第一个方面，本发明的特征在于用于延迟干细胞分化的方法，所述方法包括将至少一种转基因引入干细胞内，所述转基因选自Xic转基因、Tsix转基因、Xite转基因、Tsix/Xite转基因及其任何片段。
在另一个方面，本发明的特征在于控制干细胞分化的方法，所述方法包括步骤(a)将至少一种转基因引入干细胞内，所述转基因选自Xic转基因、Tsix转基因、Xite转基因、Tsix/Xite转基因及其片段，从而延迟干细胞分化；和(b)需要时，灭活转基因，从而允许干细胞分化。在这种方法中，转基因可以进一步包括选择标记。转基因还可以由重组酶识别序列侧接，所述识别序列包括但不限于LoxP或FRT序列。在该方法的步骤(b)中，灭活转基因可以包括从干细胞中去除转基因，例如通过通过在干细胞中表达重组酶(例如，Cre重组酶或翻转酶(FLP)重组酶)，以从基因组DNA中去除转基因或去除包含转基因的附加体(例如，通过删除复制起点)。在优选实施方案中，重组酶的表达是瞬时的。该方法还可以包括在灭活步骤之前将第2种转基因引入干细胞内。如果需要，可以在灭活步骤之前将超过一种的另外转基因引入干细胞内。
在另一个方面，本发明的特征在于用于延迟干细胞分化的方法，所述方法包括将小RNA引入干细胞内，所述小RNA基本上与转基因的至少15个核苷酸相同或互补，所述转基因选自Xic转基因、Tsix转基因、Xite转基因、Tsix/Xite转基因、Xist转基因及其任何片段。小RNA分子可以是双链RNA或siRNA分子。小RNA长度为至少15个核苷酸，优选地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸，且长度甚至最高达50或100个核苷酸(包括在中间的所有整数)。理想地，小RNA分子长度为15-32个核苷酸。
对于任何上述方面，优选的Xic转基因包括基本上等同于SEQ IDNOs1、2、3、39或其任何片段的任何核酸序列。优选的Tsix转基因包含基本上等同于SEQ ID NOs5、6、9、10、12、13、14、21、22、23、28、29、30、31、32、36、40或其任何片段的任何核酸序列。特别优选的Tsix转基因包括SEQ ID NOs9、10、12、21、22和28-32中所示的核酸序列。另外优选的Tsix转基因包括SEQ ID NOs13、14、28-32或40中任何一个的至少一个拷贝、至少2个拷贝、至少3个拷贝、至少4个拷贝和至少5个拷贝。优选的Xite转基因包括基本上等同于SEQID NOs15、16、17、24、25、26、27、38或其任何片段的任何核酸序列。优选的Tsix/Xite转基因包括基本上等同于SEQ ID NOs4、11、19、37或其任何片段的任何核酸序列。关于任何上述区域的优选转基因可以抑制内源X-X配对，例如，如使用本文所述方法测定的，通过诱导X和转基因之间的从新配对。
任何转基因都可以与任何另外的转基因组合使用。在一个例子中，SEQ ID NO23可以与任何另外的转基因组合使用，以增强对分化的阻断。此外，转基因可以作为单个拷贝或作为多聚体(例如，多个拷贝或串联系列的序列)使用。例如，SEQ ID NOs13、14、28-32和40作为多聚体是特别有用的。
在上述方面的优选实施方案中，干细胞是胚胎干细胞，理想地雌性胚胎干细胞。哺乳动物胚胎干细胞或来自任何农业动物的胚胎干细胞在本发明的方法中是特别有用的。在优选实施方案中，干细胞是人或小鼠胚胎干细胞。干细胞可以是任何时期的胚胎干细胞，优选地胚泡期干细胞、胚胎生殖干细胞、或来自滋养核(somatic nuclei)的克隆干细胞。
在另一个方面，本发明的特征在于干细胞，所述干细胞包括的Xic转基因基本上等同于SEQ ID NOs1、2、3、39或其任何片段中所示的核酸序列。
在另外一个方面，本发明的特征在于干细胞，所述干细胞包括的Tsix转基因基本上等同于SEQ ID NOs5、6、9、10、12、13、14、21、22、23、28-32、36、40或其任何片段中所示的核酸序列。
在另外一个方面，本发明的特征在于干细胞，所述干细胞包括的Xite转基因基本上等同于SEQ ID NOs15、16、17、24、25、26、27、38或其任何片段中所示的核酸序列。
在另外一个方面，本发明的特征在于干细胞，所述干细胞包括的Tsix/Xite转基因基本上等同于SEQ ID NOs4、11、19、37或其任何片段中所示的核酸序列。
在上述方面的优选实施方案中，转基因在干细胞中表达。理想地，干细胞是胚胎干细胞，所述胚胎干细胞可以是雄性或雌性的，优选雌性胚胎干细胞。哺乳动物胚胎干细胞或来自任何农业动物的胚胎干细胞在本发明的方法是特别有用的。在优选实施方案中，干细胞是人或小鼠胚胎干细胞。干细胞可以是任何时期的胚胎干细胞，优选胚泡期干细胞、胚胎生殖干细胞、或来自滋养核的克隆干细胞。
对于本发明的任何干细胞，细胞转基因可以进一步包括选择标记或由LoxP或FRT序列侧接。本发明的干细胞还可以包括重组酶(例如，Cre或FLP重组酶)，优选瞬时表达的重组酶。本发明的任何干细胞还可以进一步包括第2种转基因，或如果需要另外的转基因。
在另一个方面，本发明的特征在于分离的小RNA分子，所述小RNA分子包含的核酸序列基本上与转基因的至少15个核苷酸相同或互补，所述转基因选自Xic转基因、Tsix转基因、Xite转基因、Tsix/Xite转基因、Xist转基因或其任何片段。小RNA分子可以是双链RNA或siRNA分子，且长度为至少15个核苷酸，优选地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸，且长度甚至最高达50或100个核苷酸(包括在中间的所有整数)。在一个实施方案中，小RNA分子是长度为15-32个核苷酸的siRNA。
在一个相关方面，本发明的特征在于配制用于促进小RNA进入细胞内的、包括上文所述的小RNA分子的组合物。在另一个方面，上文所述的分离的小RNA分子在药物组合物中。药物组合物可以进一步包括药学可接受的载体。本发明的特征还在于包括小RNA分子的载体，其中所述小RNA分子与一种或多种转录调节序列可操作地连接。
对于与小RNAs有关的任一上述方面，RNA分子基本上与优选的Xic转基因相同或互补，所述优选的Xic转基因包括基本上等同于SEQ IDNOs1、2、3、39或其任何片段的任何核酸序列。优选的Tsix转基因包含基本上等同于SEQ ID NOs5、6、9、10、12、13、14、21、22、23、28、29、30、31、32、36、40或其任何片段的任何核酸序列。特别优选的Tsix转基因包括SEQ ID NOs9、10、12、21、22和28-32中所示的核酸序列。优选的Xite转基因包括基本上等同于SEQ ID NOs15、16、17、24、25、26、27、38或其任何片段的任何核酸序列。优选的Tsix/Xite转基因包括基本上等同于SEQ ID NOs4、11、19、37或其任何片段的任何核酸序列。优选的Xist转基因包括基本上与SEQ ID NOs7、8、20和35相同或互补的任何核酸序列。
“干细胞”意指具有自我更新和在合适条件下分化成专门的祖细胞(progenitor cell)或特定细胞或组织潜能的任何细胞。干细胞可以是多潜能或多能的。干细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞、来自滋养核的克隆干细胞、成体干细胞和脐带血细胞。
“成体干细胞”或“体细胞干细胞”意指在分化组织中发现的未分化细胞，所述未分化细胞可以自我更新和(具有一定限制)分化，以产生其所来源的组织的所有特化细胞类型。成体干细胞是多能的。成体干细胞的非限制性例子包括造血干细胞、骨髓衍生干细胞、和神经干细胞(NSC)、以及来源于上皮和脂肪组织和脐带血(UCB)的多能干细胞。
“胚胎干细胞”意指来源于胚泡期胚胎，或在细胞基本上分化成3个胚层之前的细胞，所述细胞可以自我更新且显示未分化细胞的形态学特征，从而使它们与胚胎或成体来源的分化细胞区分开。示例性形态学特征包括高核/质比和在显微镜下显著的核仁。在技术人员已知的合适条件下，胚胎干细胞可以分化成细胞或组织，所述细胞或组织是3个胚层中每一个的衍生物内胚层、中胚层和外胚层。用于鉴定胚胎干细胞的测定包括在合适的宿主中形成畸胎瘤、或对于未分化细胞的标记例如Oct-4染色的能力。
“分化”意指由此非特化的早期胚胎细胞获得特化细胞特征的过程，所述特化细胞例如心脏、肝、骨、神经或肌细胞。分化还可以指细胞自我更新潜能的限制，且一般与细胞功能能力中的变化有关。术语“未分化的”、或“延迟”或“阻断”分化在本发明背景中广泛使用，且不仅包括分化的阻止而且包括细胞分化过程的改变或减缓。技术人员将理解未分化细胞的集落通常可以由分化的邻近细胞环绕；然而，当群体在合适条件下进行培养或传代时，未分化的集落将持续，且个别的未分化细胞将构成相当大部分(例如至少5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更多)的细胞群体。干细胞分化可以通过本领域众所周知的方法来测定，且这些包括分析与确定分化状态的细胞相关的细胞标记或形态学特征。此类标记和特征的例子包括测量糖蛋白、碱性磷酸酶和癌胚抗原表达，其中这些蛋白质中任何一种的增加是分化的指示。另外的例子在本文中得到描述。在优选实施方案中，如果在培养确定天数(例如2、3、4、5、6或7天或更多)后，群体中少于10％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞表达分化的标记或形态学特征，那么细胞是未分化的。分化还可以通过测定X染色体失活来确定。此类测定的例子在本文中得到描述，且包括通过荧光原位杂交(FISH)或RT-PCR测量Xist表达，或通过FISH(X-X配对)测量染色体间的距离。在一个例子中，如果培养确定天数(例如2、3、4、5、6或7天或更多)后，群体中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞如通过FISH或RT-PCR测量的显示Xist表达增加，或如通过FISH测量的显示X-X配对，那么细胞是未分化的。
“片段”意指核酸分子的部分，其包含参考核酸分子全长的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在本发明中，片段包括X失活中心(Xic)的任何片段，所述片段包括至少10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、68、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、3700、4000、5000、10,000、15,000、19,500、20,000个，或更多核苷酸，直至Xic的全长(约100KB)。优选片段在本文中得到描述，且显示于表1和2以及
图1、2、3A、3B和30B中。一个优选片段是小RNA核酸序列，通常称为siRNA，它可以充当RNA干扰(RNAi)途径中的特异性决定子。
“RNAi”在本领域中也称为“基因沉默”和/或“靶沉默”，例如“靶mRNA沉默”)，指RNA的选择性细胞内降解。RNAi在细胞中天然发生以去除外来RNAs(例如，病毒RNAs)。天然RNAi经由从游离dsRNA切割的片段来进行，所述片段将降解机制指向其他类似RNA序列。可替代地，RNAi可以通过人为处理开始，例如，以沉默靶基因的表达。RNA沉默现象的统一特征是长度为至少15nt，优选15-32nt，最优选长度为17-26nt的小RNAs的产生，所述小RNAs充当用于下调基因表达的特异性决定子，和Argonaute蛋白质家族(或PPD蛋白质，因为其特征性PAZ和Piwi结构域而命名)的一个或多个成员的需要。近来已注意到较大的siRNA分子，例如25nt、30nt、50nt、或甚至100nt或更多，也可以用于起始RNAi。(参见例如，Girard等人，Nature 2006年6月4日，印刷前的电子出版物，Aravin等人，Nature 2006年6月4日，印刷前的电子出版物，Grivna等人，Genes Dev.2006年6月9日，印刷前的电子出版物，和Lau等人，Science 2006年6月15日，印刷前的电子出版物。) 术语“小RNA”在本申请自始至终使用且指任何RNA分子，单链或双链”，长度为至少15个核苷酸，优选地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸，且长度甚至最高达50或100个核苷酸(包括在中间的所有整数)。优选地，小RNA能够介导RNAi。如本文使用的，短语“介导RNAi”指(指示)区分将通过RNAi机器或过程降解哪种RNAs的能力。包括在术语小RNA内的是“小干扰RNAs”和“微小RNA”。一般而言，微小RNAs(miRNAs)是通过切酶(Dicer)由约70个核苷酸的发夹前体RNAs加工的小型(例如，17-26个核苷酸)、单链非编码RNAs。小干扰RNAs(siRNAs)具有类似尺寸且也是非编码的，然而siRNAs由长dsRNAs加工且通常是双链的(例如，内源siRNAs)。siRNAs还可以包括短发夹RNAs，其中siRNA双链体的2条链包括在单个RNA分子内。小RNAs可以用于描述2种类型的RNA。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(部分纯化的RNA，基本纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA)，以及改变的RNA，所述改变的RNA通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变而不同于天然存在的RNA。此类改变可以包括，例如向小RNA的一个或多个末端或内部(在RNA的一个或多个核苷酸处)添加非核苷酸材料。本发明RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。本发明的小RNAs只需要足够类似于天然RNA，从而其具有介导RNAi的能力。
“遗传修饰”或“遗传改变”过程意指将外源基因或外来基因引入哺乳动物细胞内。该术语包括但不限于转导(宿主DNA从宿主或供体到受体的病毒介导的转移，体内或体外)、转染、脂质体介导的转移、电穿孔、磷酸钙转染或共沉淀。转导方法包括直接共培养细胞与生产细胞，或培养细胞与单独的病毒上清液，含或不含合适的生长因子和聚阳离子。
术语“同一性”在本文中用于描述特定核酸分子序列与参考核酸分子序列的关系。例如，如果和它与之比对的参考分子相比较，核酸分子在给定位置上具有相同的核苷酸残基，那么可以说成在那个位置上具有“同一性”。核酸分子与参考核酸分子的序列同一性水平一般使用序列分析软件来测量，用其中指定的缺省参数，例如引入缺口以达到最佳比对(例如，Genetics Computer Group的Sequence Analysis SoftwarePackage，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 UniversityAvenue，Madison，Wis.53705，BLAST或PILEUP/PRETTYBOX程序)。这些软件程序通过将同一性程度分配给各种置换、缺失或其他修饰来匹配相同或相似序列。
如果核酸分子在其全长上显示与参考分子序列至少51％，优选至少55％、60％或65％，且最优选75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的同一性，那么它可以说成“基本上等同于”参考分子。对于核酸分子，比较序列的长度为至少10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、68、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、3700、4000、5000、10,000、15,000、19,500、20,000，或更多核苷酸，直至且包括Xic的全长(对于小鼠Xic为约100kB)。
应当指出尽管同源的蛋白质编码基因一般共有显著的同源性水平(一般大于70％)，但关于非编码基因和顺式调节元件，例如本发明中包括的区域的总体同源性水平，一般小于60％。例如，来自不同小鼠品系的相同Xic具有约1个核苷酸变化/100个核苷酸的序列变异。在另一个例子中，对于DxPas 34重复，重复长度从品系到品系不同，从15-40个核苷酸不等。在另外一个例子中，特别是在Xite内，品系之间的序列变异可以包括碱基对插入、缺失、和单核苷酸多态性。此外，关于非编码基因和顺式调节元件的同源性通常限于较小的结构域(例如，长度为30-100nt)。因此，更灵敏的方法例如PipMaker分析和Bayesian块分析(block analysis)可以用于测量特定非编码基因区域或顺式调节元件的同源性或同一性(Schwartz等人，Genome Research 10577-586(2000))。
“灭活转基因”意指减少或消除转基因阻断分化或XCI的能力。在一个例子中，转基因的灭活可以通过去除转基因(例如，使用位点特异性重组酶和转基因侧翼的DNA识别序列)来完成。在另一个例子中，如果使用病毒载体将转基因引入细胞内，那么去除复制起点(例如，使用位点特异性重组酶和复制起点侧翼的DNA识别序列)可以导致在繁殖后病毒序列包括转基因丢失。转基因的灭活可以使用如本文所述关于分化、XCI、或染色体间配对的成核现象的测定进行测量。
“分离的”意指当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学试剂。
“核酸分子”意指核苷酸或核酸模拟物的任何链。包括在这个定义中的是天然和非天然，修饰和未修饰的寡核苷酸。
“药学可接受的载体”意指对于被治疗的哺乳动物是生理学可接受的，同时保留它与之一起施用的化合物的治疗特性的载体。一种示例性药学可接受的载体物质是生理盐水。其他生理学可接受的载体及其配制是本领域技术人员已知的，且在例如Remington’s PharmaceuticalSciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams &Wilkins，Philadelphia，PA中描述。
“增殖”意指通过单个细胞连续分裂成2个相同子细胞的细胞群体增殖。
“纯化的”意指与天然伴随其的其他组分分开。一般地，当它至少50重量％不含它与之天然结合的蛋白质、抗体和天然存在的有机分子时，化合物(例如，核酸)是基本上纯的。优选地，化合物是至少75重量％，更优选地至少90重量％，且最优选地至少99重量％纯的。基本上纯的化合物可以通过下述方法来获得化学合成、使因子与天然来源分开、或在不天然生产化合物的重组宿主细胞中生产化合物。核酸分子可以通过本领域技术人员使用标准技术来纯化，所述标准技术例如由Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，2000)描述的那些。如使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、光密度、HPLC分析、或蛋白质印迹分析测量的，与原材料比较核酸分子优选是至少2、5或10倍纯的。
“重组酶”意指一组酶的任何成员，所述酶可以促进限定位点之间的位点特异性重组，其中所述位点在单个DNA分子上物理地分开，或其中所述位点位于分开的DNA分子上。限定重组位点的DNA序列不必是相同的。存在几个亚家族，包括“整合酶”(包括，例如Cre和λ整合酶)和“解离酶/转化酶”(包括，例如ψC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶)。2种优选的重组酶及其DNA识别序列是Cre(重组酶)-lox(识别序列)或翻转酶(FLP)(重组酶)-Frt(识别序列)。(参见Fukushige等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897905-7909(1992)；O′Gorman，等人，Science 2511351-1335(1991)；Sauer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855166-70(1988)；Sauer等人，Nuc.Acids Res.17147-161(1989)；Sauer等人，New Biol.2441-49(1990)；和Sauer，Curr.Opin.Biotechnol.5521-7(1994))。理想地，在细胞中的重组酶表达是“瞬时的”。“瞬时表达”意指在相对短暂的时间间隔内减少的表达。瞬时表达可以通过例如使用脂质体、包被颗粒或显微注射，引入作为纯化多肽的重组酶来完成。瞬时表达还可以通过引入编码重组酶的核酸序列来完成，所述核酸序列与表达载体中的启动子可操作地连接，所述表达载体随后引入细胞内。重组酶的表达还可以以其他方式进行调节，例如，通过将重组酶的表达置于可调节的启动子(即，其表达可以被选择性诱导或阻抑的启动子)的控制下。重组酶只存在从细胞去除转基因序列所必需的时间一般是优选的。
“重组酶识别序列”指由特异性重组酶蛋白质识别的任何DNA序列。例子包括loxP位点和由FLP重组酶识别的34-bp FRT位点，所述loxP位点由8-bp非回文核心区侧翼的2个13-bp反转重复组成，且由Cre重组酶识别。野生型识别序列的变体包括在本文中。如下文所述，变体可以通过其被合适的重组酶识别的能力进行鉴定。
“同线的”意指在不同物种的染色体上以相同顺序存在的相应基因或染色体区域。同线基因或染色体区域不必是高度同源的，特别是当保守元件是非编码的时。例如，小鼠X失活中心的同线部分在人Xq13上发现。
“畸胎瘤”意指由来自3种胚胎胚层的组织组成的肿瘤，通常在卵巢和睾丸中发现。畸胎瘤一般通过注射多潜能干细胞在动物中实验地产生，且用于测定干细胞分化成各种类型的组织的能力。
“Tsix转基因”意指通过人工手段引入细胞内的、基本上等同于哺乳动物Tsix序列或其任何片段的核酸片段。转基因可以整合或不整合到细胞染色体内，且可以表达或不表达。转基因可以是附加型的或不是附加型的。优选的Tsix转基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同于全长小鼠Tsix基因(图5，SEQ ID NO6)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同于下述小鼠Tsix基因片段的核酸例如pCC3(SEQ IDNO9)、p3.7(SEQ ID NO10)、DxPas34(SEQ ID NO12)、DxPas34的34bp重复(SEQ ID NO13)、DxPas34的68bp重复(SEQID NO14)、ns25(SEQ ID NO21)、ns41(SEQ ID NO22)、ns82(SEQ ID NO23)、小鼠重复A1(SEQ ID NO28)、小鼠重复A2(SEQ ID NO29)、小鼠重复B(SEQ ID NO30)、大鼠重复A(SEQ ID NO31)、和大鼠重复B(SEQ ID NO32)。另一种优选的Tsix转基因序列包括34bp或68bp DxPas34重复(分别为SEQ ID NOs13或14)的至少2个拷贝，以及至少3个拷贝、至少4个拷贝、和至少5个拷贝或更多。这些优选片段在图1、2和3A中图示，且序列在图3B、4、5和30B中提供。优选的Tsix转基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同于全长人Tsix基因(SEQ ID NO35)、人重复A(SEQ ID NO40)或其任何片段的核酸序列，和基本上等同于小鼠Tsix序列(SEQ IDNO6)或其片段的任何哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体的核酸序列。物种变异包括发生在小鼠品系之间的Xite和Tsix中的多态性，所述小鼠品系包括但不限于C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。如上文关于SEQ ID NOs13和14所述，应当指出对于任何片段，特别是较小的片段例如SEQ ID NOs28、29、30、31、32和40，转基因可以包括序列的多个拷贝，例如以串联系列(例如，至少2个拷贝、至少3个拷贝、至少4个拷贝、和至少5个拷贝或更多)。
“Xite转基因”意指通过人工手段引入细胞内的、基本上等同于哺乳动物Xite序列或其任何片段的核酸片段。转基因可以整合或不整合到细胞染色体内，且可以表达或不表达。转基因可以是附加型的或不是附加型的。优选的Xite转基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同于全长小鼠Xite基因(图7，SEQ ID NO15)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同于下述小鼠Xite基因片段的核酸例如pXite(SEQ IDNO16)、Xite增强子(SEQ ID NO17)、ns130(SEQ ID NO24)、ns135(SEQ ID NO25)、ns 155(SEQ ID NO26)、ns132(SEQ IDNO27)。这些优选片段在图1、2和3A中图示，且序列在图3B、4和7中提供。优选的Xite转基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同于人Xite基因(SEQ ID NO38)或其片段的核酸序列，和基本上等同于小鼠Xite序列(SEQ ID NO15)或其片段的任何哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体的核酸序列。物种变异包括发生在小鼠品系之间的Xite和Tsix中的多态性，所述小鼠品系包括但不限于C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。
“Tsix/Xite转基因”意指通过人工手段引入细胞内的、基本上等同于哺乳动物Tsix、Xite、或组合或间插的Tsix/Xite序列、或其任何片段的核酸。转基因可以整合或不整合到细胞染色体内，且可以表达或不表达。转基因可以是附加型的或不是附加型的。包括跨越2种基因全部或部分的区域或2种基因之间的间插区域的序列被称为Tsix/Xite转基因，且也可以在本发明方法中使用。优选的Tsix/Xite转基因的非限制性例子包括基本上等同于跨越小鼠中的2种基因的关键区域，例如pSxn(SEQ IDNO4)、pCC4(SEQ ID NO11)、和二分增强子(bipartite enhancer)(SEQ ID NO19)的核酸序列。这些优选片段在图1和3A中图示，且序列在图3B和4中提供。优选的Tsix/Xite转基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同于跨越人染色体中的2种基因的关键区域，例如pSxn人(SEQ ID NO37)，或其片段的核酸序列，和基本上等同于小鼠中跨越Tsix和Xite基因的关键区域或其片段的任何哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体的核酸序列。物种变异包括发生在小鼠品系之间的Xite和Tsix中的多态性，所述小鼠品系包括但不限于C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。
“Xic转基因”意指通过人工手段引入细胞内的、基本上等同于哺乳动物Xic区域的核酸分子。转基因可以整合或不整合到细胞染色体内，且可以表达或不表达。转基因可以是附加型的或不是附加型的。优选的Xic转基因包括全长小鼠Xic(SEQ ID NO1)，GenBank登记号AJ421479(SEQ ID NO33)的核苷酸80,000-180,000。本文所述的每种小鼠转基因在AJ421749的这个100kB片段内发现。例如，小鼠Xist在nt 106,296到nt 129,140中发现，小鼠Tsix/Xite序列在nt 157,186到nt 104,000内发现，且小鼠Tsx序列在nt 174,041到nt 163,932中发现。小鼠Xic内的另一种片段是Jpx/Enox，在AJ421479的nt 95,894到nt86,564中发现。优选的Xic片段包括πJL2(SEQ ID NO2)和πJL3(SEQID NO3)。优选的Xic转基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同于人Xic基因(SEQ ID NO39)或其片段的核酸序列，和基本上等同于小鼠Xic(SEQ ID NO1)或其片段的任何哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体的核酸序列。
“Xist转基因”意指通过人工手段引入细胞内的、基本上等同于哺乳动物哺乳动物Xist序列，或其任何片段的核酸。转基因可以整合或不整合到细胞染色体内，且可以表达或不表达。转基因可以是附加型的或不是附加型的。优选的Xist转基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同于全长小鼠Xist基因(图6，SEQ ID NO20)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同于下述小鼠Xist基因片段的核酸例如pXist 3’(SEQ ID NO7)和pXist 5’(SEQ ID NO8)。这些优选片段在图1中图示，且序列在图6中提供。优选的Xist转基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同于人Xist基因(SEQ ID NO35)或其片段的核酸序列，和基本上等同于小鼠Xist序列(SEQ ID NO20)或其片段的任何哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体的核酸序列。物种变异包括发生在小鼠品系之间的Xist中的多态性，所述小鼠品系包括但不限于C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。
干细胞分化是不可逆过程，且定向至分化途径阻止或极大地减少临床医生或研究人员以治疗有用的方式修饰干细胞的能力。干细胞的巨大治疗潜能依赖于控制干细胞分化的能力。因此，需要以可逆方式阻断或延迟干细胞分化的有效方法。本发明提供了用于控制干细胞分化的此类新型方法，且允许以受控方式抑制和诱导干细胞分化。本发明基于下述发现通过过量的Xic、Tsix和Xite或Xic、Tsix和Xite的缺失中断XCI过程可以阻断分化。在本方法中，XCI过程的中断通过使用来源于Xic、Tsix或Xite序列或其片段的转基因或小RNAs来完成，将所述转基因或小RNAs引入干细胞内且阻止干细胞经历X染色体失活和阻止培养中的分化。用于处理干细胞分化的这些新型方法允许临床医生或研究人员使干细胞维持于未分化状态，其时间足以根据需要修饰细胞(例如，通过引入治疗基因)以用于治疗或研究目的，而没有细胞或细胞产品污染的限制或分化的无效抑制。该方法还允许临床医生再次以有效方式且无污染问题地容易地去除对分化的阻断，从而使得细胞可以给受试者施用。本发明的特征还在于通过控制或延迟分化的方法产生的细胞，所述细胞在培养中可以无限地自我更新，且对于治疗目的例如再生医学和基因疗法有用。
由于下述详细描述、附图和权利要求，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
附图简述 图1是Xic区域的图示，显示了用于阻断干细胞分化的一组优选转基因。
图2是Xic区域亚型的图示，更详细地显示了Tsix/Xite接头。指出了另外的优选转基因。
图3A-3B是pSxN转基因的图示和相应核酸序列。图3A是pSxN6(也称为pSxN)转基因的图示，显示了用于阻断干细胞分化的一组优选转基因。这个区域包括Tsix和Xite的5’端，且包含对于X’s的计数(计数器)、细胞分化、印记、选择和互斥效应关键的元件。图3B是pSxN转基因(SEQ ID NO4)的注解序列图。序列图进行注解以显示图3A中鉴定的每种转基因的限制位点和特异性位置。
图4是注解的核酸序列，其显示了DxPas34转基因(SEQ ID NO12)的34和68个碱基对的重复(分别为SEQ ID NO13和14)。每行序列表示34个碱基对的重复。这些重复位于SEQ ID NO4的nt 5074-6630(图3B)。注意34和68bp重复不是精确的重复但从一个到下一个略微不同。
图5的核酸序列显示了小鼠Tsix RNA序列(未剪接形式；SEQ IDNO6)。
图6的核酸序列显示了全长小鼠Xist RNA(未剪接形式；SEQ IDNO20)。
图7的核酸序列显示了小鼠Xite区域(SEQ ID NO15)。这个序列以与pSxn的注解序列(图3)相同的方向定向。Xite在2簇起始位点内的多个位置中开始。第1个簇在nt 6995-5773(其中存在1.2kb增强子)周围。第2个簇在nt 13000-12500周围。注意所有转录物以反义方向(例如，从nt 6995到nt 1)进行。还应当注意Xite不“结束”。当它达到Tsix时，它正好减少。还应当注意2个起始簇中的第2个在pSxn关键区域外面但仍是Xite的部分。
图8A-8E显示计数缺陷，候选计数区域，以及XΔXΔ、XΔO和XΔY ES细胞分离的表现。图8A的图示显示了正常和异常计数模式。实心黑圈，xi。空圈，Xa。图8B是Xic的图示，显示了被认为影响或不损害计数的现有缺失。水平虚线描绘了每个敲除的程度。关于计数元件的假定区域以橙色显示。图8C是选择新分离的XΔXΔ、XΔO和XΔY ES系的DNA印迹分析。图8D的显微照片显示了使用来自Xite基因座(pDNT 1)的X连锁探针，对Δf5细胞的DNA FISH结果，从而证明了突变系中的2个Xs。图8E是鉴定Δf4作为XΔY克隆的Y染色体涂染的显微照片。染色体涂染如制造商(Cambio，UK)建议的进行。
图9A-9F显示了异常分化和XΔXΔ而不是XΔO或XΔY克隆中的XCI。图9A是在相同放大率下获取的突变EB的一系列相差图像。XΔXΔEB(Δf5显示)显示d2至d6(d，天)的差的分化，但某些EB最后在不迟于d9显示稀少的长出(outgrowth)。XΔO(Δf32显示)、XΔX(BA9，未显示)和XΔY(Δf4，未显示)自始至终显示正常分化。图9B的图显示了细胞死亡的定量。第0天在所有细胞系中显示了＜＜1％的死亡。显示的数据表示了3次实验的平均值。如通过斯氏t检验计算的，统计学显著性(P)在下表中指出。每种细胞系针对WT对照进行测试。图9C的一系列图像显示了使用对于Xist RNA(FITC标记的，绿色)和Xite DNA(Cy3标记的，红色)的探针以标记X染色体的RNA/DNA FISH。图9D的图示显示了在分化d3时的XCI模式。对于来自2次实验的每种样品计数＞200个核。n.a.，不可用。图9E的图像显示了在第6天时生长差的Δf25EB(XΔXΔ)的RNA/DNA FISH，显示了具有2个Xi的众多核。Xist RNA，绿色。Xite DNA，红色。图9F的图像显示了在随后的分化天数时的RNA/DNA FISH，其中大多数存活的XΔXΔ细胞(Δf41显示)只显示单个Xi。Xist RNA，绿色。Xite DNA，红色。
图10A-10E显示了携带Xic的雌性转基因ES系的生成。图10A的Xic和P1转基因图覆盖Xic的各个区域。转基因序列是πJL2，包含Xist以及30kb上游和下游序列的80kb P1质粒(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)；πJL3，包含Xist和60kb下游序列的80kb P1质粒(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)；和pSx7，πJL1的BssHII-NotI片段。如先前所述(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)通过电穿孔引入转基因，连同摩尔比为0.1的Neo选择标记(pGKRN)。本文使用的所有转基因系具有常染色体插入。图10B是转基因细胞系的DNA印迹分析。拷贝数分析如先前所述进行(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)。Xist拷贝数对Dnmt1进行标准化。图10C是分化5天的WT和转基因EB的一系列相差图像。所有图像为相同的放大率。图10D的一系列图像显示用于检测Xist RNA(绿色)和X染色体(Xite DNA，红色)的RNA/DNA FISH。细胞来自第4天。X，X染色体；T，转基因常染色体。红色箭标指向在高拷贝克隆中可见的稀少的Xist RNA聚集体。图10E的表显示了与转基因拷贝数反相关的Xist表达的频率(如通过RNA/DNA FISH测定的)。
图11A-11E显示的较精细的转基因作图揭示Tsix和Xite具有计数元件。图11A是Xic和较精细转基因的图。由每种转基因携带的序列是pSxn，πJL1的19.5kb RsrII-NotI片段(SEQ ID NO4)；p3.7，从TsixΔCpG中缺失的3.7kb MluI-SacI序列(SEQ ID NO10；Lee等人，Cell(1999)同上)；pCC3，Tsix启动子下游的4.3kb BamHI片段(SEQ ID NO9)；pCC4，Tsix启动子上游且包括Tsix启动子的5.9kb BamHI片段(SEQ IDNO11)；pXite，跨越Xite的DHS1-4的5.6kb片段(Ogawa等人，同上)；pXist5’，来自Xist启动子的4.8kb XbaI-XhoI片段(SEQ ID NO8)；pXist3’，来自Xist外显子7的4.9kb PstI片段(SEQ ID NO7)；和pTsx，来自Tsx基因座的Genbank X99946的bp 41,347-52,236(SEQ IDNO18)。除了pXist3’外，将Neo选择标记工程改造到每种质粒内用于在ES细胞中选择。本文表征的所有系都具有常染色体插入。实心紫色条，具有最强计数性质的元件；虚线紫色条，也具有计数性质的元件，虽然比前者弱。图11B的图显示了通过锥虫蓝测定对选择的转基因细胞系的细胞死亡分析。数据表示3次实验的平均值。如通过斯氏t检验计算的，统计学显著性(P)在邻近表中指出。每种细胞系针对对照WTneo进行测试。图11C是在相同放大率下获取的转基因EB和对照的一系列相差图像。对于克隆3.7-11和Xite-11，注意到d5时大尺寸的EB和不迟于d8的大量退化。图11D的图显示了d3时转基因和对照细胞系中的XCI模式。对于来自2次实验的每种样品计数至少200个核。在Tsix和Xite转基因中，检查载玻片上＞50,000个细胞以得出结论为0％显示Xist表达。n.a.，不可用。图11E的一系列图像显示了Tsix和Xite雌性转基因系而不是Xist或Tsx系中的XCI阻抑。RNA/DNA FISH使用p3.7、pXite或pTsx质粒作为探针(红色)检测Xist RNA(绿色)和转基因染色体。X，X染色体；T，转基因常染色体。
图12A-12D显示了用于计数的二重性模型(duality model)。图12A的图显示单一模型(singularity model)。计数表示X因子(绿色圈)和A因子(紫罗兰色圈)的滴定。A因子可以来源于多个不同常染色体。A至X因子的偶联形成‘阻断因子’(BF)。任何未滴定的X因子被降解。选择由BF与1个Xic的结合产生，这随后阻抑XCI的开始。Xi通过缺省形成。X，X染色体；A，常染色体。图12B的图显示二重性模型。正如在单一模型中，A和X因子的复合形成BF。然而，未滴定的一种或多种X因子导致称为(dubbed)‘感受态因子’(CF)的第2种复合物形成。选择步骤表示BF和CF与Xic的结合。BF结合阻断未来Xa上的XCI，而CF与剩余X的结合诱导未来Xi上的XCI。二重性模型暗示BF和CF以互相排斥的方式结合。BF和CF最可能与Tsix和Xite的5’区域结合。图12C的图显示了XΔXΔ突变体中的异常计数和混乱选择。描述的是在细胞分化期间4种同样可能的结果。顶端的2种结果达到剂量补偿作用且导致产生存活细胞。假定这些细胞是图9A中第9天存活的EB细胞和图9F中的剂量补偿的细胞。它们引起偶然的XΔXΔ小鼠出生(Lee，Nature Genet.(2002)，同上)。底部的2种结果导致2个Xi’s或2个Xa’s(由于互相排斥的丧失和随之发生的‘混乱’)——不存活的状态。Tsix缺失由X中的缺口表示。图12D的图显示常染色体上出现多个Tsix或Xite序列压制来自内源Xic的阻断和感受态因子，从而导致转基因细胞中组成型活性的X’s。黑色框是完整或部分的Xic序列。ATg，转基因常染色体。
图13的一系列相差图像显示XΔXΔ克隆中的异常细胞分化。指出了分化天数(d)时在相同放大率下的突变EB的相差图像。为了产生EZB，在d)时ES集落被胰蛋白酶消化成脱附的细胞簇，在悬浮培养中在不含LIF的DME/15％FBS中生长4天，其后与凝胶化的板附着以获得长出。注尽管不迟于d*时许多XΔXΔEB退化，但相当大部分EB的确长出(显示了例子)，但长出的程度一般不如WT或XΔO强壮。
图14的一系列相差图像显示了包含Tsix/Xite的转基因系中的异常细胞分化。显示了在指定分化日时在相同放大率下的突变体和野生型EB的相差图像。所有包含Tsix/Xite的XX转基因导致在第5天时EB长出差且不迟于第8天时大量死亡。如通过锥虫蓝摄取测定的，＞99％的非附着细胞是死亡的。包含相同转基因的XY系和包含Xist、Tsx的XX系，以及载体转基因不显示这种表型。在Tsix/Xite转基因中，p3.7和pXite转基因显示非常高的放射状生长(显示了各2种克隆)。与较大的转基因比较，pCC3、pCC4和pSxN转基因的确也是这样，但程度较少和更可变。πJL2、πJL3和pSx7同样具有升高的细胞死亡率，但它们的EB集落不是非常大。
图15A-D显示了关于X-X同源结合的证据。图15A的一系列图像和图显示了野生型雌性ES核从分化第0天到第6天以及MEFs的DNA FISH和X-X分布特征。2种探针组合Xic DNA绿色(pSxn-FITC)+Tsx DNA红色(pTsx-Cy3)。DAPI(4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚)，蓝色。每个图像是0.2μz切片的3D图像栈(image stack)层的2维(2D)表示。分布显示标准化的距离，ND＝X-X距离/d，其中d＝2x(核面积/π)0.5。ND为0-1。平均距离，空心三角。图15B的一系列图显示了ND 0.0-0.2时关于X-X对的累积频率曲线。P(KS检验)在逐对比较中针对第0天进行计算。关于每次实验的样本大小(n)＝174-231。图15C的图显示X-X距离＜0.05ND。距离用来自3次独立实验的标准差(SD)进行图示。图15D是Xic的图和显示对Xic特异的邻近配对的图。关于X连锁基因座的X-X分布特征显示于图中。KS检验(P)比较Xic对侧翼基因座。n＝166-188。
图16A-D显示在XCI开始期发生的同源结合。图16A的一系列图像和图显示关于第2天野生型XX细胞的RNA-DNA FISH。Xic DNA，绿色(pSxn-FITC)；Xist RNA，红色(链特异性核糖核酸探针(riboprobes)-Cy3)。图16B-16D的一系列图显示关于第2天野生型XX细胞的累积分布，从而比较Xist+(n＝74)对Xist-(n＝180)细胞(图16B)；Ezh2+(n＝33)对Ezh2-细胞(n＝178)(图16C)；和H3-3meK27+(n＝48)对H3-3meK27-(n＝188)细胞(图16D)。
图17A-F显示Tsix和Xite对于X-X配对是必需和充分的。图17A是Xic、TsixΔCpG和XiteΔL以及各种转基因的图。图17B的一系列图显示了从第0天到第6天关于Tsix和Xite突变体的X-X分布。n＝181-223。KS检验比较了每条曲线与第0天的曲线。图17C的图表显示了用于3C分析的Tsix等位基因和引物(红色)。BamHI位点，蓝色箭标。图17D显示了XΔTsix(neo+)X细胞和p3.7雌性的逐对相互作用的3C分析。引物对在凝胶右侧指出。C，阳性对照连接。所有负-交联(N)和负-连接对照都是阴性的。图17E的图显示使用显示的等式，使第n天(dn)时的相对配对频率(X)对β珠蛋白(βg)和第0天的值进行标准化。S，通过光密度测定法定量的信号强度。来自3次独立实验的平均值和SD。图17F关于转基因ES细胞的DNA FISH和X-A分布曲线。转基因被Neo探针标记为红色，且X被pSx7探针(对于p3.7、pXite、pXist5’和pTsx细胞)或pTsx探针(对于pSx7细胞)标记为绿色。pSx7与p3.7和pXite转基因部分重叠，但小重叠使信号暗淡且可与X区分。对于πJL1.4.1，转基因标记为绿色(pSx9 Xist片段)且X标记为红色(pTsx探针)。KS检验比较来自第0天对第4天的数据集。n＝170-234。
图18A-D显示从头X-A配对抑制X-X配对。图18A的一系列图显示雌性转基因细胞中的X-X配对的破坏。n＝177-221。图18B显示的KS检验比较来自第0天对第2天以及来自第0天对第4天的数据集。图18C的图显示了来自3次实验的X-X配对的平均频率与标准差。图18D的模型显示了X-X配对是计数/选择所需的。等位基因交扰导致不对称的染色体标记(黄色圈，阻断的Xic；红色圈，诱导的Xic)以及Xa和Xi的互相排斥的指示。蓝线，Xist RNA。异位Tsix/Xite转基因(Tg-Xic)通过滴定消除X-X相互作用来抑制XCI。Tsix XΔXΔ配对的丧失引起异常计数/选择。
图19的一系列图和图像显示，X-X邻近配对代表XX细胞中的X染色体双联体而不是XO细胞中单个X的姐妹染色单体。WT雌性ES细胞的Xic标记(Tsix探针，红色)和X涂染(FITC，绿色)显示，X-X邻近配对代表XX细胞中的2个不同Xs而不是XO细胞中单个X的姐妹染色单体。配对的Xs显示占据单个Xs 2倍核面积的X涂染信号。在右侧显示了X-X分布特征，其中KS检验(P)比较d4对d0。
图20的一系列图显示邻近配对是对X染色体特异的。在ES细胞分化期间Chr.1着丝粒(1C)和Chr.2 Abca2基因的分布特征。
图21A-C显示邻近配对是对Xic特异的。图21A的一系列图像显示XC和Tsix的DNA FISH，其中Tsix信号是分开(左侧)或配对的(右侧)。图21B的一系列图显示在d4时侧翼X连锁探针的分布特征。图21C的一系列图显示d0至d6的X连锁探针的累积频率曲线。KS检验，P＝针对d0测试时的差异显著性。
图22A-B的一系列图像和图显示，使用Ezh2(图22A)和H3-3meK27(图22B)作为标记的邻近配对的时间图解。ImmunoFISH使用与Ezh2或H3-3meK27抗体(红色)组合的Xic探针(绿色)。X-X分布特征在右侧显示。
图23的一系列图显示在d0天到d6天时突变Tsix和Xite ES细胞的X-X分布特征。这些图显示Tsix和Xite介导配对。
图24是β珠蛋白基因座图，其中3C引物通过箭头显示且BamHI位点通过箭标显示。
图25的一系列图显示从d0到d4所示转基因雌性ES细胞的X-X分布特征。
图26的一系列图像显示雌性转基因ES细胞在分化条件下甚至在第5天时仍维持未分化形态学。ns11(载体)和ns82(Tsix启动子)用作阴性对照。
图27的一系列图像显示雄性转基因ES细胞在分化条件下没有显示对于雌性ES细胞可见的相同未分化形态学。
图28的一系列图显示细胞中的Tsix和Xite的所有亚片段之间的配对，除了ES ns82(只有Tsix启动子)之外。异位X-A配对抑制内源X-X配对。
图29A-I显示Tsix启动子的杂合缺失对选择没有明显作用。图29A是关于Tsix启动子删除的靶向方案的示意图。RVEcoRV，BBamHI。探针1和2的位置由编号的灰色矩形指出。实心和空心三角分别表示FRT和LoxP位点。图29B显示来自雌性克隆的基因组DNAs的DNA印迹分析，所述基因组DNA用EcoRV消化和用探针1探测。图29C显示来自小家鼠(M.musculus)(129)或M.castaneus(cast)肝的基因组DNAs、和来自野生型或靶向的雌性ES细胞的DNA的DNA印迹分析，所述DNA用BamHI消化和用探针2探测。图29D显示来自雄性克隆的基因组DNAs的DNA印迹分析，所述基因组DNA用EcoRV消化和用探针1探测。图29E显示基于ScrFI和MnlI SNPs在2个位置上的Tsix表达的等位基因特异性分析。图29F的一系列图显示雄性细胞中的Tsix表达的实时RT-PCR定量。所有样品对内部对照Rpo2进行标准化。误差条指示1个标准差。图29G显示关于雌性细胞系中的Xist(顶端)或Mecp2(底部)的等位基因特异性RT-PCR。分化天数如所示的。图29H显示在图29G中所示实验中来自129等位基因的Tsix RNA级分。图29I的一系列图像显示在第8天时雌性ΔPneo细胞的RNA/DNA FISH。Xist RNA，绿色；Neo DNA，红色。每种XCI模式的百分比在小图右侧指出(括号中是取样的核数目)。n＝138。
图30A-E显示DXPas34是保守的，且具有与转座元件(TEs)的相似性。图30A是在DXPas34上小鼠(x轴，AJ421479的138,745-141,000)对大鼠(y轴，N_W048043的51,001-53,300)序列的点图。显示了不同重复簇的位置。图30B显示如对于每个物种测定的共有重复序列。人重复A，SEQ ID NO40；小鼠重复A1，SEQ ID NO28；小鼠重复A2，SEQ ID NO29；小鼠重复B，SEQ ID NO30；大鼠重复A，SEQ ID NO31；大鼠重复B，SEQ ID NO32。图30C显示小鼠(x轴，AJ421479的bp134,001-141,000)对人(y轴，NT_011669的bp 11,328,000-11,352,000)的点图分析。区域2和3如所标记的(Lee等人，Cell 9947-57(1999))。在y轴上标出人序列中的14kb插入，连同包含A重复(灰色框)的区域。图30D显示了人A重复区域的示意图，显示ERV/LTRs和SINEs(亮和暗灰色框)以及A重复单位(黑色三角)的位置。显示了代表性的ERV/LTR序列(NT_011669的bp 11345000-11348700；SEQ ID NO43)，其中A重复用框圈出。图30E显示人重复A(SEQ ID NO40)完全匹配人HERVL重复(SEQ ID NO44)的相应区域。小鼠DXPas34(A1基序)(SEQ ID NO28)同样显示与人HERVL(27bp中的4个错配)和小鼠MERVL/RatERVL(5个错配)(SEQID NO45)的极佳比对。
图31A-E显示DXPas34展示双向启动子活性。图31A是Tsix 5’区域的示意图，显示了DXPas34、对于链特异性RT-PCR使用的引物对的位置(星号数字)、和相关限制位点(AAge I，SSalI，MMluI)。显示了萤光素酶测定中使用的DXPas34片段。萤光素酶活性对β半乳糖苷酶且随后对Tsix启动子萤光素酶构建体进行标准化。误差条指示1个标准差。图31B显示如图31A中所示的Rrm2或Tsix 5’区域的链特异性RT-PCR结果。有义(s)和反义(as)链在每个柱的上方指出。图31C显示检测Dxpas-r的5’RACE的结果。M标记，5’5’RACE扩增产物。具有主要和次要起始位点的代表性DXPas34区组序列由重和轻箭标指出(SEQ ID NO46)。有下划线的是包含起始位点的重复A1单位。图31D显示用tagetin(T)处理8小时或α鹅膏毒环肽处理4或8小时(分别为α4和α8)的ES细胞的RT-PCR结果。Tsix和Dxpas-r在位置2上检测到。18S RNA(PolI转录物)作为装载对照进行平行扩增。图31E显示在位置2上扩增来自指示样品的RNAs的RT-PCR结果。
图32A-F显示的DXPas34的靶向缺失使Tsix转录减少。图32A的图显示关于DXPas34缺失的靶向方案。这个基因座的前3个等位基因在上方以灰色显示(Debrand等人，Mol.Cell Biol.198513-8525(1999)；Lee等人，Cell 9947-57(1999)；Sado等人，Development 128 1275-1286(2001))。相关限制位点是SStuI，BBamHI，RVEcoRV。探针由灰色框指出。图32B显示用StuI消化和用探针1检测的来自雌性和雄性克隆的基因组DNAs。图32C显示用EcoRV消化和用探针2检测的基因组DNAs。图32D显示用BamHI消化和用探针2探测的雌性基因组DNAs，以测定哪个等位基因被靶向。图32F的放射自显影图显示在未分化的雄性细胞中在位置A和B上的定量实时RT-PCR分析(如图29E中所示)。图32的一系列图显示如图31B-E中所述，对指示基因型的雄性细胞的链特异性RT-PCR分析的结果。位置2在ΔDXPas34缺失区域内且因此从分析中省略。
图33A-C显示DXPas34缺失导致非随机XCI模式。图33A的一系列图像显示在第12天时雌性ΔDXPas34细胞的RNA/DNA FISH。Xist RNA，绿色；DXPas34 DNA，红色。每种XCI模式的百分比在小图右侧指出(括号中的核数目)。n＝48。图33B-33C显示如图29G中所述关于Xist(图33B)或Mecp2(图33C)的等位基因特异性RT-PCR分析。注ΔDXPas34实验对图29G中呈现的细胞系平行进行；因此，对照放射自显影图是相同的。图表指出在第12天时对于多分化实验来自129染色体的转录百分比。空心圈表示个别实验；实心圈表示平均值，其中1个标准差由误差条指示。如所示的样品的逐对比较通过斯氏t检验来进行(底部)。
图34A和B显示分化后期DXPas34缺失使Tsix去阻抑。图34A显示在分化期间野生型和ΔDXPas34雌性的ScrFI多态性上的等位基因特异性Tsix RT-PCR。图34B的一系列图显示在细胞分化期间来自129(左侧小图)或castaneus(右侧小图)的Tsix RNA的等位基因级分。误差条指示1个标准差。
图35A的示意图显示在细胞分化期间DXPas34如何调节Tsix表达的3步骤模型，其中DXPas34的2个增强子和2个功能在序列中发挥作用以控制Tsix动力学的不同方面。这个模型提出二分增强子在前XCI细胞中发挥作用以完成双等位基因(biallelic)Tsix表达。Xite增强子在这个期间可能也发挥作用，但它直到XCI开始时才是绝对需要的，这时它的作用使得Tsix表达能够在未来Xa上持续。XCI确立后，Tsix的稳定表达需要DXPas34的晚期的阴性功能。在这个模型中，Dxpas-r的反平行转录导致Tsix的阻抑，可能通过类似的反义机制。图35B的示意图显示Tsix如何指派反转录转座元件用于其调节的模型。约8千万-2亿年前，反转录转座子(rTE)偶然插入原始Tsix基因5’端附近的Xic内。每个TE是包含启动子、增强子和隔离子的自给自足型基因表达模块，插入引入指派调节Tsix的调节元件谱(repertoire)(例如CTCF位点、Tsix增强子、和可变启动子(Chao等人，Science 295345-347(2002)；Stavropoulos等人，Mol.Cell Biol.252757-2769(2005))。随着时间过去，rTE可能丧失几乎所有其原始序列，除了保留用于调节Tsix的那些。保留的元件在这个过程期间重复加倍以产生现在的DXPas34。
图36显示关于在Xite内存在小RNAs的RNA印迹分析，如示意图中所示，左侧的1个用let7探针探测，且右侧的1个用Xite探针探测。Xite内的小RNAs用箭标指出。let7b印迹是显示已知miRNA(let7b)可以被检测的阳性对照。注意对于Xite小图，小RNAs可以使用指出小RNAs是双链的有义和反义探针进行检测。显示的细胞系是来自Lee，Science(2005)同上、和Xu等人Science(2006)同上、以及Ogawa和Lee Mol.Cell.(2003)同上的那些。简言之，J1，野生型雄性ES；16.7，野生型雌性ES；J1-ΔCpG是Tsix-缺失的雄性ES；16.7Δ/Δ是Tsix-/-雌性ES；ΔL(Xite)是Xite的12.5kb缺失；雌性-Tsix3.7是具有在Tsix等位基因中缺失的3.7kb Tsix序列的转基因雌性ES；雌性-Xite是具有5.6Xite转基因的转基因雌性ES。泳道0、4、10指关于每种细胞系的细胞分化天数。
详述 由于其无限自我更新和分化成大量细胞和组织类型的能力，干细胞具有巨大的临床潜能。它们在再生疗法和基因疗法中的潜在用途几乎是无限的，但取决于控制以其他方式不可逆的分化过程的能力。
本发明的特征在于用于控制此类分化的方法，其通过引入Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite转基因或其片段，或来源于Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite的小RNA以抑制分化来实现。这允许有足够时间根据需要处理干细胞以用于治疗或研究用途。转基因的后续去除允许诱导干细胞分化成所需细胞或组织类型，且给患者施用。
转基因 本发明基于下述发现将具有Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite序列或其片段的转基因引入干细胞内抑制分化。在本发明中有用的转基因可以包括任何Xic、Tsix或Xite核酸序列，或具有Tsix和Xite序列的部分或全部的Tsix/Xite核酸序列。
Tsix和Xite是在称为X失活中心(Xic)的主调节区中发现的非编码顺式作用基因。这个区域包含许多罕见的非编码基因，包括Xist、Tsix和Xite，所述非编码基因一起发挥作用以确保XCI只在XX雌性中、只在1条染色体上、且以发育特异性方式发生。这些基因各自产生RNA而不是蛋白质。Xist只由将来失活的X产生，且产生“包被”失活X的20kbRNA，从而开始基因沉默过程。Tsix是Xist的反义调节物，且通过阻止Xist RNA沿着X染色体扩展来发挥作用。因此，Tsix指定未来的活性X。Xite连同Tsix一起发挥作用以确保X的活性状态。Xite产生一系列基因间RNAs且呈现特别的染色质构象。它的作用增强了反义Tsix的表达，从而与Tsix协同指定未来的活性X。此外，Tsix和Xite通过如本文所述的X-X配对一起发挥作用，以调节XCI的计数和选择方面。
具有Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite序列或其片段或组合的转基因在本发明的方法中对于延迟或控制分化是有用的。应当指出尽管确定了Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite序列内的优选片段，但这个区域内的任何核酸序列在本发明的方法中都是有用的。本文呈现的数据鉴定这个区域关于阻断X-X配对、计数和细胞分化的功能丰余性，支持来自这个区域的任何片段的使用。例如，来自这个区域的可以抑制X-X配对的任何序列(例如，通过诱导从头X转基因配对)都可以用于阻断分化。
优选的Xic转基因序列的非限制性例子包括小鼠Xic(SEQ ID NO1)或人同线等价物(SEQ ID NO39)、πJL2(SEQ ID NO2)和πJL3(SEQ ID NO3)。
优选的Tsix转基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同于全长小鼠Tsix基因(SEQ ID NO6)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同于下述小鼠Tsix基因片段的核酸例如高度保守区域(SEQ IDNO5)、pCC3(SEQ ID NO9)、p3.7(SEQ ID NO10)、DxPas34(SEQ ID NO12)、DxPas34的34bp重复(SEQ ID NO13)、DxPas34的68bp重复(SEQ ID NO14)、ns25(SEQ ID NO21)、ns41(SEQID NO22)、ns82(SEQ ID NO23)、小鼠重复A1(SEQ ID NO28)、小鼠重复A2(SEQ ID NO29)、小鼠重复B(SEQ ID NO30)、大鼠重复A(SEQ ID NO31)和大鼠重复B(SEQ ID NO32)。另一种优选的Tsix转基因序列包括34bp或68bp DxPas34重复(分别为SEQ ID NOs13或14)的至少2个拷贝，以及至少3个拷贝、至少4个拷贝、和至少5个拷贝或更多。另外优选的Tsix转基因序列包括至少基本上等同于以下人同线等价物的核酸序列全长人Tsix基因(SEQ ID NO36)、人重复A(SEQ ID NO40)，或其任何片段，和基本上等同于小鼠Tsix序列(SEQ ID NO6)或其片段的任何哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体的核酸序列。
如上文关于SEQ ID NOs13和14所述，应当指出对于任何片段，特别是较小的片段例如SEQ ID NOs28、29、30、31、32和40，转基因可以包括序列的多个拷贝，例如以串联系列(例如，至少2个拷贝、至少3个拷贝、至少4个拷贝、和至少5个拷贝或更多)。小鼠重复A1(SEQ ID NO28)、小鼠重复A2(SEQ ID NO29)、小鼠重复B(SEQID NO30)、大鼠重复A(SEQ ID NO31)、大鼠重复B(SEQ ID NO32)和人重复A(SEQ ID NO40)都是DXPas34区域的部分，且包括结合转录因子CTCF所需的正规序列。图30B中提供的这些DxPas小重复单位和任何ERV衍生的正规序列多聚体，因此被包括作为在本发明方法中有用的优选Tsix转基因序列。
优选的Xite转基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同于全长小鼠Xite基因(SEQ ID NO15)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同于下述小鼠Xite基因片段的核酸例如pXite(SEQ ID NO16)、Xite增强子(SEQ ID NO17)、ns130(SEQ ID NO24)、ns135(SEQID NO25)、ns155(SEQ ID NO26)、ns132(SEQ ID NO27)。优选的Xite转基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同于人Xite基因(SEQ ID NO38)或其片段的核酸序列，和基本上等同于小鼠Xite序列(SEQ ID NO15)或其片段的任何哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体的核酸序列。
包括跨越2种基因全部或部分的区域或2种基因之间的间插区域的序列被称为Tsix/Xite转基因，且也可以在本发明方法中用作转基因。非限制性例子包括具有跨越小鼠染色体的2种基因的整个关键区域的核酸，pSxn(SEQ ID NO4)、pCC4(SEQ ID NO11)、和二分增强子(SEQ ID NO19)。另外优选的Tsix/Xite转基因序列包括基本上等同于Tsix(SEQ ID NO36)和Xite(SEQ ID NO38)的人同线等价物之间的间插区域的核酸序列。人Tsix/Xite转基因序列的一个例子是pSxN人(SEQ ID NO37)。
优选片段显示于下表1和2中。应当指出因为片段是非编码区，所以序列的确切起始和结束并不重要。因此，对于所有片段，大小和核苷酸序列是近似值，且可以有1、2、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、500、750、1000或更多核苷酸的改变。还应当指出所有序列以5’至3’的方向呈现。
表1.小鼠和大鼠序列。
“N”指任何核苷酸 “Y”指任一嘧啶 “R”指任一嘌呤 *应当指出如图5中所示的序列和GenBank登记号AJ421479在Zeste重复区域中具有3kB缺失。这个区域不能进行测序。这些坐标基于提供的序列且在序列中不包括3kB缺口。
表2.人序列 对于任何Xic、Tsix、Xite或组合Tsix/Xite转基因序列，将理解还包括哺乳动物(例如，人、小鼠、灵长类动物、牛、绵羊、猫和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物种变体、或同线变体。例如，人同线区域包括X染色体上邻接人序列的约15兆碱基(GenBank登记号NT_011669，SEQ ID NO34)。这些15兆碱基序列包括人Xic区域以及Xic区域2个末端上的另外序列。Xist的同线等价物在GenBank登记号NT_011669的约核苷酸11,390,576-11,358,483(SEQ ID NO35)处发现。包括人序列中的Tsix和Xite的关键区域预测来自GenBank登记号NT_011669的约核苷酸11,358,483-核苷酸11,300,000(pSxN，人，SEQID NO37)。Tsix(SEQ ID NO36)的同线等价物在NT_011699的约核苷酸11,329,000-11,393,000处发现，且Xite(SEQ ID NO38)的同线等价物在NT_011669的约核苷酸11,320,000-11,333,000处发现。在本发明方法中有用的转基因可以使用关于转基因阻断X染色失活或分化能力的测定进行鉴定。此类测定是本领域已知的且例子在本文中描述。
RNA干扰(RNAi) 本发明基于XCI过程破坏可以阻断分化的发现。用于干扰XCI的一种方法包括针对Xic、Tsix、Xite或Xist的小RNA分子例如siRNA的使用，将所述小RNA分子引入干细胞内且阻止干细胞经历X染色失活和在培养中分化。此类小RNA分子的使用避免了去除转基因的需要，因为小RNA分子具有有限的半衰期且将自然降解。
RNAi是通过引入双链RNA(dsRNA)开始的转录后基因沉默形式。一般称为“siRNAs”、“小RNAs”或“微小RNAs(microRNAs)”的15-32个核苷酸的短双链RNAs，在线虫(Zamore等人，Cell 10125-33)和哺乳动物组织培养细胞系(Elbashir等人，Nature 411494-498，2001，在此引入作为参考)中有效下调基因表达。这种方法在哺乳动物中的进一步治疗效力通过McCaffrey等人(Nature 41838-39.2002)在体内证实。小RNA长度为至少15个核苷酸，优选地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个核苷酸，且长度甚至最高达50或100个核苷酸(包括在中间的所有整数)。基于下述发现Tsix、Xite以及Xist元件被转录和这些区域的部分显示双向转录，因而具有形成随后可以经历RNAi途径的双链RNAs的潜能，基本上等同于Xic、Tsix、Xite或Xist的任何区域，或与Xic、Tsix、Xite或Xist的任何区域互补的此类小RNAs，包括在本发明中。事实上，对应于Xite区域、大小小于25nt-约100nt的小非编码RNAs(ncRNAs)已由有义和反义链鉴定(参见图36)。此外，Xic、Tsix Xite、或Tsix/Xite、或两者的转录或ncRNA产物已显示是XCI期间配对所需的。
因此，本发明包括任何小RNA，其基本上等同于Xic、Tsix、Xite或Xist的任何区域，优选本文所述以及表1和2中所示区域的长度上至少15个核苷酸，优选地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸，及长度上甚至最高达50或100个核苷酸(包括在中间的所有整数)。本发明还包括此类小RNA分子阻断分化的用途。应当指出，如下所述，可以使用被加工成此类小RNAs的较长dsRNA片段。有用的小RNAs可以使用本文所述方法，通过其阻断分化、阻断配对、或阻断XCI的能力来鉴定。小RNAs还可以包括短发夹RNAs，其中siRNA双链体的2条链都包括在单个RNA分子内。
小RNA的具体需要和修饰是本领域已知的，且例如在PCT
发明者J·T·李 申请人:综合医院公司